Метаболический характеристика поляризованных M1 и M2 из костного мозга макрофагов, используя анализ в реальном времени внеклеточной Flux

Immunology and Infection
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (105), e53424, doi:10.3791/53424 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

В то время как макрофаги играют центральную роль в практически всех заболеваний, молекулярные механизмы, которые регулируют их фенотип до сих пор не разгадана полностью. Макрофаги проявлять высокую неоднородность и в ответ на микросреды принять различные фенотипы 1. ЛПС (+ IFN,), индуцированного в классическом активирована M1 или М (LPS) макрофаги способствуют воспаление и защитить хозяина против различных типов микроорганизмов угроз из 2. Другие используют IFN, отдельно или в сочетании с TNF, как стимулов, чтобы вызвать M1 поляризацию. ИЛ-4 и / или IL-13 индуцирует активацию макрофагов и альтернативный них М2 или М (ИЛ-4) клетки являются мощными супрессоров и контроллеры текущих иммунных реакций 3. Поляризованные макрофаги отображения отличное регулирование клеточного метаболизма с ЛПС-активированными макрофагами M1 проходит метаболический выключатель к повышению гликолиза 4-6. Окисления, наоборот, усиливается жирных кислот (ФАО) и митохондриальной oxidativе фосфорилирования (OXPHOS) обеспечивает устойчивый энергии в Ил-4-индуцированных М2 макрофаги 7-9. Таким образом, изменения метаболизма является не только характеристикой поляризованных макрофагов подмножеств, он также является необходимым условием для правильной поляризации и воспалительного регулирования. Важно отметить, что ингибирование гликолиза или OXPHOS / ФАО было продемонстрировано, ухудшают M1 или M2 активации соответственно 8,10. Таким образом, выявление метаболические изменения в макрофагах может быть применен в качестве инструмента для оценки состояния поляризации их и воспалительный потенциал.

Последовательное анализ, который измеряет макрофагов метаболизм, следовательно, может быть использован для прогнозирования ли препарат, ген сбить или другое лечение влияет макрофагов поляризации и функции. В этом видео, внеклеточный анализатор потока используется для характеристики биоэнергетики профили наивных, М1 и М2 макрофаги.

Эта рукопись подробно оптимизированный протокол, который позволяет измерятьвсех соответствующих параметров гликолиза (гликолиз, максимальная гликолиза и гликолитических резервных) и митохондриальных характеристик функций (общая дыхания, базальная митохондриального дыхания, АТФ производства, утечки протонов, максимальная дыхания и запчасти дыхательных мощности) в одном тесте. Используя эту экспериментальную установку, биоэнергетика можно сравнить между контролем и «измененной» (например, гена сбить, трансгенной сверхэкспрессии или фармакологическое лечение) клетки.

Protocol

1. Культивирование и поляризационный из костного мозга Макрофаги

  1. День 0: изолят бедра и голени кости из 6-10-недельных мышей интереса (C57BL / 6 в этом анализе).
  2. Удалить мышечной ткани от костей и поместить кости в 9 см чашки Петри, наполненной ледяной PBS.
  3. Передача кости блюдо 9 см Петри заполнены 70% этанола и осторожно встряхните пластину в течение 30 сек.
  4. Передача кости свежего 9 см чашки Петри, наполненной ледяной стерильной PBS.
  5. Вырезать бедра и голени на обоих концах с стерильными ножницами.
  6. Флеш кости с помощью 10 мл ледяной стерильной PBS с помощью шприца 10 мл и иглу 25 G. Сбор костного мозга в 50 мл пробирку.
  7. Передача клеток костного мозга в новую пробирку 50 мл с помощью иглы 23 G.
  8. Повторите этот шаг с иглой 25 G. Примечание: Эти шаги необходимы, чтобы удалить скопления клеток и остатков костей.
  9. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
  10. Откажитесь от вирernatant и ресуспендирования клеток в среде 40 мл клеточной культуры (RPMI-1640 плюс 2 мМ L-глутамина, 10% FCS, пенициллином (100 Ед / мл), стрептомицина (100 мкг / мл) и 15% отфильтрованного L-929 клетки ( АТСС, CCL-1) -conditioned среду, содержащую M-CSF (или альтернативно 10 нг / мл рекомбинантного M-CSF, а не L-929 клеток-кондиционированной среды).
    Примечание: Генерация L-929 клеток с кондиционером среды подробно ранее в этом журнале в 2013 году 11
  11. Культуры клеток от одной мыши в двух 15 см чашки Петри (не использовать культуру обработке пластин клеток, так как макрофагов не оторваться от этого пластика) в 20 мл культуральной среды на пластине в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
  12. Добавить 10 мл свежего клеток культуральной среды на 3 день, не снимая 20 мл старую культуральную среду.
  13. Замените старый носитель каждой пластины с 20 мл свежей культуральной среды на день 6. Ведение это, не прилипшие клетки также будут удалены.
  14. День 8:
    1. Снять клетки путем инкубации их 5 мВ при 37 ° С в 10 мл физиологического раствора цитрата (135 мМ хлорида калия плюс 15 мМ цитрата натрия в H 2 O, автоклавного) и промывают 10 мл PBS. Граф мозга, полученных макрофаги зрелой кости (BMDM) на 8-й день, используя сотовый счетчика.
    2. Проверка образование взрослых (CD11b + F4 / 80 +) BMDM путем визуального осмотра или с помощью проточной цитометрии. Блока 10 5 клеток с 1/100 анти-CD16 / CD32 в PBS в течение 20 мин в 100 мкл PBS, инкубировать с 1/200 анти-CD11b-FITC плюс 1/200 анти-F4 / 80-APC-Cy7 при комнатной температуре, стирка и анализировать с помощью проточной цитометрии.
      Примечание: мозга, полученных макрофаги Культивирование мыши кость подробно было опубликовано в начале в этом журнале по Ин др. 11.
  15. Семенной 50000 клеток (количество клеток оптимальные должны быть оптимизированы) на лунку в клеточной культуре микропланшет в количестве 100 мкл культуральной среды. Не клеток семян в коррекции фон скважин (A1, A12, H1, H12) и поставить средний только (и не клетки) в этих скважинах Подсказка:. Держите пипетку под углом абой на полпути вниз стороны скважин для наиболее однородного слоя клеток.
  16. Разрешить клетки поселиться в РТ в капот культуре клеток в течение 1 часа. Это будет способствовать равномерное распределение клеток и снизить краевые эффекты. Следить за соблюдением помощью микроскопа и культуры в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
  17. Три часа после посева, стимулируют клетки в течение 24 ч с 10 нг / мл ЛПС, или 20 нг / мл рекомбинантного мыши IL-4, чтобы генерировать M1 или M2 макрофаги, соответственно. Включить необработанные наивно (М0) макрофаги в качестве контроля. Оценка надлежащего M1 и M2 макрофагов поляризации путем измерения ЛПС-индуцированную секрецию IL-6, IL-12, TNF (ИФА) и ИЛ-4 индуцированный аргиназы-1 активность и / или MMR (CD206) и MGL (CD301) поверхностной экспрессии (проточной цитометрии), как описано ранее 3,11.
    Примечание: В этот момент клетки могут быть (предварительно) -обработанной с фармакологическими соединений, представляющих интерес, или макрофагов может быть стимулировано с другими факторами. Так, изменение отдельных скважин между может быть подводные лодкиtantial, желательно использовать по крайней мере 4 и 6 скважин в идеале за состояния.

2. Подготовка Пробирной внеклеточной Flux

  1. Гидратов картридж датчика за один день до проведения анализа:
    1. Поместите картридж датчика вниз рядом с утилитой пластины.
    2. Заполните каждую лунку полезности пластины с 200 мкл раствора калибрующего и опустите картридж датчика на сервисный пластины погружая датчики в калибрующего раствора.
    3. Убедитесь, что уровень раствора калибрующего достаточно высокой, чтобы датчики подводных и место в не-СО 2 37 ° C инкубатора O / N.
  2. Подготовка среды для анализа на день анализа следующим образом:
    1. Теплый 50 мл XF основную среду до 37 ° С.
    2. Добавить 500 мкл 200 мМ L-глутамина, чтобы получить 2 мм конечной концентрации.
    3. Доведения рН до 7,4 с помощью 1 N NaOH и стерилизовать с 0,2 мкм фильтр и хранить в среду для анализа при 37 ° С.
  3. Осторожно удалить клеточную культуральную среду с поляризованными макрофагов и хранить его при температуре -20 ° С для последующего использования (например, ELISA, чтобы исследовать надлежащую макрофагов поляризации). Вымойте клеток с 100 мкл среды для анализа, добавьте 180 мкл среды для анализа на лунку и проверьте под микроскопом, что клетки не были смыты. Поместите культуральный планшет в 37 ° C инкубаторе без CO 2 в течение 1 часа перед анализом перспективе.
  4. Подготовка 10 х впрыска смеси соединений A до D, как описано в таблице 1, тепло до 37 ° С, довести рН до 7,4 и стерилизуют фильтра.
    1. Сделать все соединения в этих смесей при 10x конечной концентрации в культуре клеток скважин и оптимизировать эти концентрации для каждого типа клеток.
  5. Загрузите картридж датчика используя предоставленные направляющие загрузки с указанными объемами (таблица 1) подготовленных 10х инъекции сложных смесей в портах A, B, C и D, respectively.
Смесь / впрыска Соединений Объем добавил, чтобы получить 10x смеси (мкл) Объем среды для анализа (мл) Объем инъекции во время работы (мкл) Конечная концентрация в анализе
2,5 М (45%) глюкозы 300 2.7 20 25 мм
В 5 мМ олигомицин A (ОМ) 9 3.0 22 1,5 мкМ
С 5 мМ FCCP 9 2.7 25 1,5 мкМ
Решение 100 мМ натрия пирувата 300 1 мм
D 5 мМ антимицину А (АА) 15 3.0 28 2,5 мкМ
5 мМ ротенон (Рот) 7.5 1.25 мкМ

Таблица 1. Инъекции смеси.

3. Биоэнергетический характеристика поляризованных M1 и M2 BMDM помощью внеклеточного Flux Analyzer

  1. Создайте шаблон анализа с помощью мастера анализа с 2 минут MIX и 3 раза минутах измерять и (по крайней мере) 3 смеси и скорости измерений петли перед каждым из 4 инъекций (Таблица 1) и после последней инъекции.
    Примечание: Эти концентрации действительны для мозга, полученных макрофагов костей и RAW264.7 макрофагов клеточных линий, но должны быть оптимизированы для каждого типа клеток. Добавление пирувата в смеси FCCP необходимо, чтобы питать максимальное дыхание.
  2. Начните бег, нажав начальную дно и следуйте инструкциям установки. Во-первых нагрузка автомобиль-картридж пластина с гидратированных зондов, чтобы калибровка аппаратуры и следующий нагрузки клеточной пластинки.
  3. После анализа, тщательно отбрасывать весь среды для анализа и хранения анализируемый планшет для культивирования клеток при -20 ° С для последующего нормализации клеток с использованием набора для анализа пролиферации клеток, как подробно описано поставщиком.
    1. Вкратце, подготовить 1x буфер клеток лизис путем разбавления компонента B в 20 раз в дистиллированной воде и разбавляют соединение 400-кратной в клетки-буфера для лизиса 1x. Добавить 200 мкл на лунку, инкубировать 5 мин при комнатной температуре и измерить флуоресценцию с ~ 180 нм и ~ возбуждения 520 нм максимумов излучения.
      Примечание: При работе с не-адгезивные клетки или если плохое соблюдение является проблемой, прямой набор пролиферации клеток можно использовать в качестве альтернативы, так как этот протокол не требует отбрасывания всех среде для анализа. Тем не менее, этот прямой протокола немного менее чувствительны по сравнению с протоколом, используемым в этой лаборатории.
  4. После измерения флуоресценции, нормализуютколичество клеток в каждой лунке в виде отношения, в которых среднее число клеток всех наивных макрофагов скважин устанавливается на 1.
    Примечание: Количественную оценку белка (например, с использованием BCA анализ) может использоваться в качестве альтернативного способа нормализации клеток рассчитывает. Тем не менее, в руках Этот анализ менее чувствительным по сравнению с набора для анализа пролиферации клеток.

Representative Results

После завершения анализа внеклеточной потока и количественного клеток, данные могут быть нормализованы для подсчета клеток и анализировали. Это, как правило, дают Ecar и распознавания участков, как показано на рисунке 1А и 1В рис.

После инъекции глюкозы (А), увеличение РВЦА представляет собой скорость гликолиза. Дополнительное увеличение РВЦА после АТФ-синтазы торможения с олигомицину (B) предоставляет информацию о гликолитического резерва и мощности (рис 1А). При анализе значения OCR, олигомицин инъекции (B) позволяет рассчитать потребление кислорода, используемого для синтеза АТФ митохондрий. FCCP (С) разобщает дыхание митохондрий и соответствующие измерения OCR выход данных о максимальной и свободное дыхательных мощности. Наконец, введение ротенона (Рот) и антимицин А (АА) блокировать митохондриальной комплекс I и III, и остаточное OCR представляет не-митохондриальные минусы кислородаumption (Фигура 1В).

фигура 1
Рисунок 1: параметры обмена веществ, полученные из анализа потока XF внеклеточной. (А) следующие параметры клеточного гликолиза рассчитываются из значений Ecar (в миль / ч / мин): гликолиз, максимальная мощность гликолиза и гликолитических резерв. Измерения (В) OCR (в пмоль / мин) используются для вычисления следующих основных параметров функции митохондрий: базальной дыхания, АТФ, утечки протонов, максимальная дыхания и дыхательной свободное мощности. Gluc = глюкоза; ОМ = олигомицин А; FCCP = карбонилцианид 4- (трифторметокси) фенилгидразон; А. А. = антимицин А; Рот = Ротенон Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

После запуска, Ecar и OCR измерения 1 TILл 15 для каждой лунки могут быть экспортированы в Excel, а также следующие параметры гликолиза может быть рассчитана из измерений Ecar следующим образом:

Номера для гликолиза подкисление = ср. РВЦА (1,2,3)

Гликолиз = ср. РВЦА (4,5,6) - ср. РВЦА (1,2,3)

Максимальная мощность гликолиза = ср. РВЦА (7,8,9) - ср. РВЦА (1,2,3)

Гликолитические резерв = AVG. РВЦА (7,8,9) - ср. РВЦА (4,5,6)

От темпов OCR, в ближайшие метаболические характеристики могут быть определены:

Номера для митохондриального дыхания = ср. (OCR 13,14,15)

Базальная дыхание = ср. (OCR 4,5,6) - ср. (OCR 13,14,15)

Производство АТФ = ср. (OCR 4,5,6) - ср. (OCR 7,8,9)

Протон утечки =ср. (OCR 7,8,9) - ср. (OCR 13,14,15)

Максимальная дыхание = ср. (OCR 10,11,12) - ср. (OCR 13,14,15)

Запасной дыхания способность (SRC) = ср. (OCR 10,11,12) - ср. (OCR 4,5,6)

Рисунок 2
Рисунок 2:. Метаболические характеристики наивно (M0), LPS- (М1) и IL-4 (М2) поляризованные макрофаги Для каждого измерения, среднего и стандартной ошибки среднего (SEM) 8 отдельных скважин представлены. (А) Внеклеточные ставки подкисления (Ecar, в миль / ч / мин) и (б) темпы потребления кислорода (OCR, в пмоль / мин) измеряются для дифференциально-поляризованного (М1 и М2) и наивных макрофагов (M0). Все измерения были нормализованы для подсчета клеток (как измерено с CyQuant) и среднее количество клеток из наивных макрофагов был установлен в 1. Впроекция А = глюкоза; B = олигомицин; С = FCCP; D = A + антимицин Ротенон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Как показано на фиг.2А, активации макрофагов LPS индуцирует с увеличена гликолитических метаболизм. Различия между LPS и ИЛ-4 обработанных макрофагах еще более очевидным, когда, глядя на уровень потребления кислорода (OCR) на рисунке 2В. В самом деле, в то время как максимальная окислительного метаболизма сильно подавлен в М (ЛПС), ИЛ-4 индуцирует базальной и особенно максимальный дыхание в М2 макрофаги. Следует отметить, что увеличение гликолиза довольно уникальным для M (ЛПС) и макрофагов не обязательно характеристика M1 макрофагов, так как М (IFN, макрофаги), не отображаются повышения гликолиза.

В целом, это внеклеточный анализ потока показывает, THAт ИЛ-4-индуцированной М2 макрофаги характеризуются повышенной окислительного метаболизма, и особенно высокий запасной дыхательной емкости (SRC), в то время как LPS-активированными макрофагами дисплей усиливается обмен веществ и гликолиза не обладают свободное дыхания потенциала.

Discussion

Целью нашей лаборатории, чтобы понять, как макрофагов поляризации и функции, могут влиять на конечную цель, чтобы улучшить результат атеросклероза и других воспалительных условиях 12. Для оценки макрофагов поляризации, один, как правило, измеряет LPS (+ IFN,), индуцированного и IL-4-индуцированных экспрессию генов M1 и M2 маркерных генов (КПЦР), определяет IL-6, IL-12, TNF и NO секрецию (по ELISA и Грисс реакция) и рассматривает ИЛ-4 индуцированный CD71, CD206, CD273 и CD301 поверхности выражение (цитометрическим) и активность аргиназы 3,13. Кроме того, апоптоз анализы (по аннексина-V / окрашивания PI), фагоцитоз анализа (с флуоресцентные шарики латекса и / или pHrodo E.coli) и формирование пенистых клеток анализа (по поглощению DiI-oxLDL, LipidTOX нейтрального липида) окрашивания может быть выполнена с оценить функциональность макрофагов 14. Кроме того, внеклеточный анализ потока могут быть выполнены, чтобы измерить биоэнергетики профили поляризованного Macмакрофаги как новый и альтернативной функциональной считывания.

Эта рукопись показывает, что макрофагов поляризации вызывает метаболический перепрограммирование с ЛПС-индуцированной макрофагами коммутации к увеличению гликолиза в качестве источника энергии. С другой стороны, ИЛ-4-индуцированные М2 макрофаги использовать митохондриальную окислительное фосфорилирование в качестве основного источника АТФ. Важно отметить, что метаболический перепрограммирование не только дает энергию для конкретных требований М1 и М2 поляризованных макрофагах. В самом деле, метаболические изменения влияют метаболитов концентраций, которые являются прямыми регуляторами макрофагов фенотипа 10,15,16. Следовательно, макрофагов метаболизм не только характеристика (как показано здесь на рисунке 2), но также водителем различных состояний поляризации макрофагов и это новое знание поддерживается быстрый рост научно-исследовательской сфере immunometabolism в течение последних нескольких лет.

Тем не менее, надежные измерения метаболических профилей в макрофаги остается сложной и имел свои ограничения. В этом исследовании, внеклеточный анализатор потока применяется для решительно измерить гликолиза, гликолитический резерв, максимальный гликолитический потенциала, без гликолитический подкисление, базальную и максимальную дыхание, производство АТФ, свободное дыхания потенциала, утечку протонов и без дыхание митохондрий в режиме реального времени в минимальном количестве макрофагов.

Таким образом, мы изменили и улучшили протоколы производителя следующим образом. Стандартная Мито Стресс-тест (# 103015-100) предлагает использовать среду с глюкозой и пирувата и протокол с 3 инъекции (OM, FCCP, А.А. / красный). Мы решили начать с анализа глюкозы / пируват-среде, свободной, добавить глюкозу в качестве первой инъекции в порту A (как в гликолиза стресс-тест # 103020-100) и добавить пирувата вместе с разобщающий FCCP в порту С. В этом случае все соответствующие параметры гликолиза получены из измерений Ecar 1-9 и всей соответствующей информации о mitochondriаль функция из измерений OCR 4-15.

Обратите внимание, что очень важно, чтобы придать пируват вместе с FCCP топлива максимальный дыхание на разобщение. Перед использованием этой комбинированной протокол, следует также проверить, что 2-дезокси-D-глюкоза (2-DG) снижает уровень Ecar после анализа на базальных значений (1-3), и что записанные скорости Ecar 4-6 действительно из-за гликолиза. Кроме того, нужно понимать, что концентрации соединений и число клеток, используемые в этой рукописи действительны для мозга, полученных макрофагов костей и RAW264.7 макрофагов клеточных линий и должен быть оптимизирован для других типов клеток. Кроме того, следует отметить, что M-CSF, который используется для генерации мозга, полученных макрофаги костного способствует М2-типа противовоспалительное фенотип. Поэтому Представленные результаты от мозга, полученных макрофагов кости могут быть не полностью сопоставима с измерениями с первичной ткани резидентных макрофагов или макрофаги клеточных линий, которые не требуют M-CSF в течение клеточного culturiнг.

По сравнению с существующими методами, этот протокол требует минимальное количество макрофагов и быстро обеспечивает практически все основные метаболические характеристики клеток. Это приводит к достаточно избыточных клеток для выполнения других иммунологических анализах, и даже клетки, используемые для профилирования биоэнергетической еще может быть использована для других предназначена после анализа. Кроме того, особенно 96-луночный планшет формата позволяет оценить несколько условий в реальном времени, в то же время. Тем не менее, разница между отдельных скважин может быть значительным, и поэтому использование по крайней мере 4 скважин в состоянии часто желательно. Взятые это ограничение во внимание, описанный анализ внеклеточного поток по-прежнему позволяет работать более чем 10 экспериментальных условий (п = 6) сразу, что гораздо больше, чем традиционные методы.

В целом, эта статья предоставляет простой и воспроизводимый функциональный анализ, позволяющий измерения всю необходимую гликолиза и митохондриального параметровметры в поляризованных макрофагов подмножеств. Этот метод может служить в качестве будущего приложения для оценки функции макрофагов и оценить эффект различных манипуляций (например, ген сбить, новые фармацевтические препараты и т.д.) на (метаболического) фенотипа макрофагов в. Таким образом, внеклеточные потока данных может быть использован в сочетании с другими анализами, чтобы углубленный характеристику состояния активации макрофагов.

Disclosures

Свободный доступ к этой статье спонсируется конек Bioscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23G and 25G needles Becton Dickinson #300800 and #300600 To flushed bone marrow
10 ml syringes Becton Dickinson #307736 To flushed bone marrow
Petri dishes Greiner #639161 To culture bone marrow cells
CyQUANT Cell Proliferation Assay kit  Molecular Probes #C7026 For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit  Molecular Probes #35011 For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)
XFe96 cell culture microplate Seahorse Bioscience #101085-004 96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done
recombinant mouse interleukin-4 (IL-4) Peprotech #214-14-B Used to induced alternative macrophage activation
lipopolysaccharide (LPS) Sigma #L2637 Pro-inflammatory stimulus
Seahorse Sensor Cartridge  Seahorse Bioscience #102416-100 Contains the probes for pH and O2 measurement
Seahorse XF Calibrant  Seahorse Bioscience #100840-000 Needed to hydrate the probes overnight 
XF base medium  Seahorse Bioscience #102353-100 Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes
L-glutamine Life Technologies #25030-081
D-(+)-Glucose Sigma #G8769 Fuels glycolysis once added to the cells
oligomycin A Sigma #75351 Inhibits mitochondrial ATP synthase
FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) Sigma #C2920 Uncouples mitochondrial respiration
100 mM Sodium Pyruvate solution Lonza #BE13-115E Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis
Antimycin A Sigma #BE13-115EA8674 Inhibits complex III of the mitochondria
Rotenone Sigma #BE13-115EA8674R8875 Inhibits complex I of the mitochondria
Casy Cell Counter Roche Diagnostics #05 651 697 001 Instrument to count cells
anti-CD16/CD32 eBioscience #14-0161 Fc receptor block flow cytometry
anti-F4/80-APC-eFluor780 eBioscience #47-4801 Antibody to stain macrophages
anti-CD11b-FITC eBioscience #11-0112 Antibody to stain macrophages

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. (2015).
  3. Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436 (2014).
  6. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).
  16. Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

Comments

1 Comment

  1. After step 17 in your protocol, you have a note that says pharmaceutical compounds can be used at this point. Does that mean immediately following the LPS stimulation or does this mean 24 hours after the LPS stimulation?

    Also, in step 17, do you suggest treating wells directly with LPS or adding LPS to fresh media and replacing the media on the plate?

    Reply
    Posted by: Morgan N.
    January 24, 2018 - 12:25 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics