Metabolic karakterisering av polariserat M1 och M2 Benmärgs-härledda makrofager Användning av realtids Extracellulärt Flux Analys

Immunology and Infection
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (105), e53424, doi:10.3791/53424 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Även makrofager spelar en central roll i praktiskt taget alla sjukdomar, de molekylära mekanismer som reglerar deras fenotyp är fortfarande inte helt avslöjad. Makrofager uppvisar hög heterogenitet och som svar på mikro anta olika fenotyper 1. LPS (+ IFNy) -inducerad klassiskt aktiverad M1 eller M (LPS) makrofager främja inflammation och skydda värden mot olika typer av mikrobiella hot 2. Andra använder IFNy ensamt eller i kombination med TNF som stimuli för att framkalla M1 polarisering. IL-4 och / eller IL-13 inducerar alternativa makrofagaktivering och dessa M2 eller M (IL-4) celler är potenta suppressorer och styrenheter av pågående immunsvar 3. Polariserade makrofager uppvisar en tydlig reglering av cellulär metabolism med LPS-aktiverade M1 makrofager som genomgår en metabolisk övergång till förbättrad glykolys 4-6. Omvänt förbättrad fettsyraoxidation (FAO) och mitokondriell oxidative fosforylering (OXPHOS) ger ihållande energi i IL-4-inducerad M2 makrofager 7-9. Således är förändrad metabolism inte bara en egenskap hos polarise macrophage delmängder, det är också en förutsättning för korrekt polarisering och inflammatorisk reglering. Viktigt, hämning av glykolys eller OXPHOS / FAO har visat sig försämra M1 eller M2 aktivering, respektive 8,10. Som sådan kunde identifiera metabola förändringar i makrofager användas som ett verktyg för att bedöma deras polariseringsstatus och inflammatorisk potential.

En konsekvent analys som mäter makrofag metabolism kan därför användas för att förutsäga om ett läkemedel, gen slå ner eller annan behandling påverkar makrofager polarisering och funktion. I den här videon, är ett extracellulärt flöde analysator som används för att karakterisera bioenergetik profiler av naiva, M1 och M2 makrofager.

Detta manuskript detaljer ett optimerat protokoll som möjliggör mätningav alla relevanta glykolys parametrar (glykolys, maximal glykolys och glykolytiska reserv) och mitokondriella funktions egenskaper (total andning, basal mitokondrie andning, ATP produktion, proton läcka, maximal andning och reservandningskapacitet) i en enda analys. Med hjälp av denna experimentuppställning, kan bioenergetik jämföras mellan kontroll och "förändrad" (t.ex. genen slå ner, transgena uttryck eller farmakologisk behandling) celler.

Protocol

1. Odling och polariserande Benmärgs-härledda makrofager

  1. Dag 0: Isolera lårben och skenben ben från 6-10 veckor gamla möss av intresse (C57Bl / 6 i denna analys).
  2. Ta muskelvävnad från benen och placera benen i en 9 cm petriskål fylld med iskallt PBS.
  3. Överför ben till en 9 cm petriskål fylld med 70% etanol och försiktigt skaka plattan i 30 sek.
  4. Överför ben till ett färskt 9 cm petriskål fylld med iskallt steril PBS.
  5. Skär lårben och skenben i båda ändar med steril sax.
  6. Spola benen med 10 ml iskall steril PBS med användning av en 10 ml spruta och en 25 G-nål. Samla benmärgen i ett 50 ml rör.
  7. Överför benmärgsceller i ett annat 50 ml rör med användning av en 23 G-nål.
  8. Upprepa detta steg med en 25 G-nål. Obs! Dessa åtgärder behövs för att ta bort cellklumpar och ben rester.
  9. Centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
  10. Kassera supernatant och återsuspendera cellerna i 40 ml cellodlingsmedium (RPMI-1640 plus 2 mM L-glutamin, 10% FCS, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 | ig / ml) och 15% filtrerad L-929-cell ( ATCC, CCL-1) -konditionerat medium innehållande M-CSF (eller alternativt 10 ng / ml rekombinant M-CSF i stället för L-929-cell-konditionerat medium).
    Obs: Genereringen av L-929-cell-konditionerat medium beskrivits tidigare i denna tidskrift 2013. 11
  11. Kultur cellerna från en mus i två 15 cm petriskålar (använd inte cellodlingsbehandlade plattor eftersom makrofager inte lossna från denna plast) i 20 ml odlingsmedium per platta i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
  12. Tillsätt 10 ml färskt cellkulturmedium på dag 3, utan att ta bort de 20 ml äldre cellodlingsmedium.
  13. Ersätta det gamla mediet på varje platta med 20 ml färskt odlingsmedium på dag 6. Att göra detta, kommer icke vidhäftande celler också avlägsnas.
  14. Dag 8:
    1. Drag av celler genom att inkubera dem 5 mi vid 37 ° C i 10 ml citrat saltlösning (135 mM kaliumklorid plus 15 mM natriumcitrat i H2O, autoklaverad) och tvätta med 10 ml PBS. Räkna mogna benmärgshärledda makrofager (BMDM) på dag 8 med användning av en cellräknare.
    2. Kontrollera bildandet av mogna (CD11b + F4 / 80 +) BMDM genom visuell inspektion eller genom flödescytometri. Block 10 5 celler med 1/100 anti-CD16 / CD32 i PBS under 20 min i 100 pl PBS, inkubera med 1/200 anti-CD11b-FITC plus 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 vid rumstemperatur, tvätta och analysera genom flödescytometri.
      Obs: Odling mus härledd från benmärg makrofager har publicerats i detalj tidigare i denna tidskrift av Ying et al 11..
  15. Seed 50000 celler (optimala cellräkningar måste optimeras) per brunn i en cellodlingsmikroplatta i 100 | il odlingsmedium. Inte utsäde celler i bakgrunden korrigerings brunnar (A1, A12, H1, H12) och satte endast medium (inga celler) i dessa brunnar. Tips: Håll pipetten i en vinkel about halvvägs längs sidan av brunnarna för mest homogena cellager.
  16. Låt cellerna att bosätta sig vid rumstemperatur i en cellkultur huva för en timme. Detta kommer att främja jämn cellfördelning och reducera kanteffekter. Övervaka vidhäftning med användning av ett mikroskop och kultur i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
  17. Tre h efter plätering, stimulera celler för 24 h med 10 ng / ml LPS, eller 20 ng / ml rekombinant mus-IL-4 för att generera M1 eller M2 makrofager, respektive. Inkludera obehandlade naiva (M0) makrofager som en kontroll. Bedöm korrekt M1 och M2 makrofag polarisering genom mätning LPS-inducerad sekretion av IL-6, IL-12, TNF (ELISA) och IL-4-inducerad arginas-1-aktivitet och / eller MMR (CD206) och MGL (CD301) ytexpression (flödescytometri) såsom beskrivits tidigare 3,11.
    Obs: Vid denna punkt, kan celler vara (pre) -behandlad med farmakologiska föreningar av intresse eller makrofager kan stimuleras med andra faktorer. Sedan, kan variationen mellan separata brunnar vara substantial, är det lämpligt att använda åtminstone 4 och helst sex brunnar per tillstånd.

2. Framställning av de extracellulära Flux-analys

  1. Fukta sensorhuvudet en dag innan du kör analysen:
    1. Placera sensorhuvudet upp och ned bredvid verktyget plattan.
    2. Fyll varje brunn av verktyget plattan med 200 pl kalibreringslösning och sänka sensorhuvudet på verktyget plattan dränka sensorerna i kalibreringslösningen.
    3. Verifiera kalibreringslösningen nivån är tillräckligt hög för att hålla sensorerna nedsänkta och plats i en icke-CO 2 37 ° C inkubator O / N.
  2. Förbered analysmediet på dagen för analysen enligt följande:
    1. Varm 50 ml XF basmedium till 37 ° C.
    2. Lägg 500 | il 200 mM L-glutamin för att få en 2 mM slutkoncentration.
    3. Justera pH till 7,4 med användning av 1 N NaOH och sterilisera med en 0,2 | iM filter och hålla analysmediet vid 37 ° C.
  3. Försiktigt bort cellodlingsmediet från de polariserade makrofager och förvara det vid -20 ° C för framtida användning (t.ex. ELISA för att undersöka ordentlig makrofager polarisering). Tvätta cellerna med 100 pl analysmedium, tillsätt 180 pl analysmedium per brunn och kontrollera i mikroskop att celler inte spolades bort. Placera cellodlingsplatta i en 37 ° C inkubator utan CO2 under 1 h före analysen körningen.
  4. Förbered 10 x injektion förening blandningarna A till D som beskrivs i tabell 1, värm till 37 ° C, justera pH till 7,4 och filtrera sterilisera.
    1. Gör alla föreningar i dessa blandningar vid 10 x den slutliga koncentrationen i cellodlingsbrunnar och optimera dessa koncentrationer för varje celltyp.
  5. Ladda sensorhuvudet med de medföljande lastlinjer med angivna volymer (tabell 1) för de framställda 10x injektion föreningsblandningar i hamnar A, B, C och D, respectively.
Blandning / insprutning Föreningar Volym tillsatt få 10x blandning (il) Volym analysmedium (ml) Volym insprutas under körning (il) Slutlig koncentration i analysen
en 2,5 MSEK (45%) glukos 300 2,7 20 25 mM
B 5 mM oligomycin A (OM) 9 3,0 22 1,5 | iM
C 5 mM FCCP 9 2,7 25 1,5 | iM
100 mM natriumpyruvat lösning 300 1 mM
D 5 mM antimycin A (AA) 15 3,0 28 2,5 | iM
5 mM rotenon (Rot) 7,5 1,25 ^ M

Tabell 1. Injektions blandningar.

3. bioenergetiska karakterisering av polariserat M1 och M2 BMDM med hjälp av en Extracellulärt Flux Analyzer

  1. Skapa en analysmall med analys guiden med 2 minuters MIX och 3 minuters mäta tider och (åtminstone) 3 mix och hastighetsmätning loopar före varje av de 4 injektioner (tabell 1) och efter den sista injektionen.
    Notera: Dessa koncentrationer är giltiga för benmärgshärledda makrofager och Raw264.7 makrofagcellinjer, men bör optimeras för varje celltyp. Det behövs Lägga pyruvat i FCCP blandningen för att driva maximal andning.
  2. Starta körningen genom att trycka på start botten och följ instruktionerna i apparaten. Första last bilenkassetten plattan med hydratiserade prober för att möjliggöra kalibrering av apparater och nästa belastning cellplattan.
  3. Efter analysen noggrant kassera alla analysmedium och lagra den analyserade cellodlingsmikroplatta vid -20 ° C för framtida cell normalisering med användning av cellproliferationsanalysen kit såsom beskrivits i detalj av leverantören.
    1. I korthet, förbereda en 1x cell lysbuffert genom utspädning komponent B 20-faldigt i destillerat vatten och späd förening A 400-faldigt i 1x cell lysbuffert. Tillsätt 200 | il per brunn, inkubera 5 min vid RT och mäta fluorescens med ~ 180 nm excitation och ~ 520 nm emissionsmaxima.
      Obs: När du arbetar med icke-vidhäftande celler eller om dålig följsamhet är ett bekymmer, det direkta celltillväxt kit kan användas som ett alternativ, eftersom detta protokoll inte kräver kasta alla analysmediet. Ändå är denna direkta protokoll något mindre känslig jämfört med det protokoll som används i denna laboration.
  4. Efter fluorescensmätning, normaliseracelltal i varje brunn som ett förhållande där den genomsnittliga celltal av alla naiva makrofager brunnar sätts till 1.
    Obs: Protein kvantifiering (t.ex. med en BCA-analys) kan användas som ett alternativt sätt att normalisera cellräkning. Ändå, i våra händer denna analys var mindre känslig jämfört med cellproliferationsanalys-kit.

Representative Results

Efter avslutad extracellulära flödesanalys och cell kvantifiering kan data normaliseras för cellräkning och analyseras. Detta kommer vanligtvis att ge ECAR och OCR tomter som visas i figur 1A och figur 1B.

Efter injektionen av glukos (A), representerar ökningen av ECAR glykolysen hastigheten. Den ytterligare ökning av ECAR efter ATP-syntas inhibition med oligomycin (B) ger information om glykolytiska reserven och kapacitet (Figur 1A). Vid analys av OCR-värden, oligomycin injektion (B) möjliggör beräkning av syreförbrukning används för mitokondriell ATP syntes. FCCP (C) frånkopplas mitokondrie andning och motsvarande OCR mätningarna ge uppgifter om den maximala och reservdelar lungkapacitet. Slutligen, injektion av rotenon (Rot) och antimycin A (AA) blockerar mitokondriella komplex I och III och rest OCR representerar icke-mitokondriella syre consumption (Figur 1B).

Figur 1
Figur 1: Metabola parametrarna härrörande från en XF Extracellulärt flödesanalys. (A) Följande parametrar cellulär glykolys beräknas från ECAR värden (i mph / min): glykolys, maximal glykolytisk kapacitet och glykolytiska reserv. (B) OCR mätningar (i pmol / min) används för att beräkna de kommande grundläggande parametrarna i mitokondriefunktion: basrespiration, ATP-produktion, proton läcka, maximal andning och reservdelar lungkapacitet. Gluk = glukos; OM = oligomycin A; FCCP = Karbonyl cyanid 4- (trifluormetoxi) fenylhydrazon; AA = antimycin A; Rot = Rotenon Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter körningen, ECAR och OCR mätningar 1 till 15 för varje brunn kan exporteras till Excel och följande glykolytiska parametrar kan beräknas från mätningarna ECAR enligt följande:

Icke-glykolytiska försurning = avg. ECAR (1,2,3)

Glykolys = avg. ECAR (4,5,6) - avg. ECAR (1,2,3)

Maximal glykolytiska kapacitet = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (1,2,3)

Glykolytiska reserv = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (4,5,6)

Från OCR hastigheter kan de nästa metabola egenskaper bestämmas:

Icke-mitokondriell andning = avg. OCR (13,14,15)

Basrespiration = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (13,14,15)

ATP-produktion = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (7,8,9)

Proton läcka =avg. OCR (7,8,9) - avg. OCR (13,14,15)

Maximal andning = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (13,14,15)

Reservlungkapacitet (SRC) = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (4,5,6)

Figur 2
Figur 2:. Metaboliska egenskaper hos naiva (M0), LPS- (M1) och IL-4- (M2) polariserade makrofager För varje mätning, medelvärdet och standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) av 8 enskilda brunnar presenteras. (A) Extracellulära försurnings priser (ECAR i mph / min) och (B) syreförbrukning priser (OCR, i pmol / min) mäts för differentiellt polariserad (M1 och M2) och naiva makrofager (M0). Alla mätningar normaliserades för cellräkning (mätt med CyQUANT) och den genomsnittliga celltal av naiva makrofager sattes till 1.projicerings A = glukos; B = oligomycin; C = FCCP; D = antimycin A + Rotenon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Som visas i figur 2A, inducerar makrofagaktivering med LPS ökade glykolytiska metabolism. Skillnaderna mellan LPS och IL-4-behandlade makrofager är ännu tydligare när man tittar på syreförbrukning (OCR) i figur 2B. I själva verket, medan den maximala oxidativ metabolism är mycket undertryckt i M (LPS), inducerar IL-4 basal och särskilt maximal andning i M2 makrofager. Man bör notera att ökad glykolytiskt är ganska unikt för M (LPS) makrofager och är inte nödvändigtvis ett kännetecken för M1 makrofager sedan M (IFNy) makrofager inte visa förbättra glykolysen.

Sammantaget visar detta extracellulära flödesanalys that IL-4-inducerad M2 makrofager kännetecknas av ökad oxidativ metabolism och särskilt en hög reservlungkapacitet (SRC), medan LPS-aktiverade makrofager display förbättrad glykolytiska metabolismen och inte har någon reservlungkapacitet.

Discussion

Syftet med vårt laboratorium är att förstå hur makrofager polarisering och funktion kan påverkas med slutmålet att förbättra resultatet av åderförkalkning och andra inflammatoriska tillstånd 12. För att bedöma makrofag polarisering, en mäter typiskt LPS (+ IFNy) -inducerade och IL-4-inducerade genuttrycket av M1 och M2 markörgener (qPCR) bestämmer IL-6, IL-12, TNF och NO-utsöndring (genom ELISA och Griess reaktion) och undersöker IL-4-inducerad CD71, CD206, CD273 och CD301 ytexpression (genom flödescytometri) och arginas aktivitet 3,13. Dessutom kan apoptosanalyser (av Annexin-V / PI färgning), fagocytos analyser (med fluorescerande latexpärlor och / eller pHrodo E. coli) och skumcellbildning analyser (av Dil-oxLDL upptag, LipidTOX neutral lipid färgning) utföras för att utvärdera makrofag funktionalitet 14. Dessutom kan genomföras extracellulärt flödesanalys för att mäta bioenergetik profiler av polariserad macrophages som en ny och alternativ funktionell avläsning.

Detta manuskript visar att makrofag polarisering inducerar metabolisk omprogrammering med LPS-inducerade makrofager byta till ökad glykolys som sin energikälla. Omvänt, IL-4-inducerad M2 makrofager använder mitokondriell oxidativ fosforylering som den viktigaste källan till ATP. Viktigt ger metaboliska omprogrammering inte bara energi för de särskilda kraven för M1 och M2 polariserade makrofager. I själva verket, metabola förändringar påverkar metabolitkoncentrationer som är direkta regulatorer av makrofag fenotypen 10,15,16. Därför är makrofager metabolism inte bara en egenskap (som visas i figur 2) men också en drivkraft för olika makrofag polariseringstillstånd och denna nya kunskap stödde den snabba tillväxten av immunometabolism forskningsområdet under de senaste åren.

Men robusta mätningar av metaboliska profiler i makrofager fortsatt svårt och hade sina begränsningar. I denna studie är ett extracellulärt flöde analysator tillämpas på kraftigt mäta glykolysen, glykolytiska reserv, maximal glykolytiska kapacitet, icke-glykolytiska försurning, basal och maximal andning, ATP-produktion, reservlungkapacitet, proton läcka och icke-mitokondriell andning i realtid i en minimal mängd av makrofager.

Därför vi modifieras och förbättras tillverkarens protokoll såsom följer. Standarden Mito Stress Test (# 103015-100) föreslår att man använder medium med glukos och pyruvat och ett protokoll med 3 injektioner (OM, FCCP, AA / Rot). Vi väljer att starta analysen med glukos / pyruvat fritt medium, tillsätt glukos som en första injektion i port A (som i glykolysen stresstest # 103.020-100) och tillsätt pyruvat tillsammans med FCCP frikopplare i hamn C. På detta sätt alla relevanta glykolys parametrar härleds från ECAR mätningarna 1-9 och all relevant information om mitochondrial-funktion från OCR mätningar 4-15.

Observera att det är viktigt att injicera pyruvat tillsammans med FCCP till bränsle maximal andning vid frånkoppling. Innan du använder denna kombinerade protokoll, bör man också kontrollera att 2-deoxi-D-glukos (2-DG) sänker ECAR nivåer efter analysen till de basala värdena (1-3) och att de inspelade ECAR priser 4-6 är verkligen beror till glykolys. Dessutom bör en förstå att de föreningskoncentrationer och cellantal som används i detta manuskript gäller för benmärgshärledda makrofager och Raw264.7 makrofagcellinjer och bör optimeras för andra celltyper. Dessutom bör man notera att M-CSF som används för att generera benmärgshärledda makrofager befrämjar en M2-liknande antiinflammatorisk fenotyp. De presenterade resultaten från benmärgshärledda makrofager kan därför vara inte helt jämförbar med mätningar med primär vävnads residenta makrofager eller makrofager cellinjer som inte kräver M-CSF under cell culturing.

Jämfört med befintliga metoder, kräver detta protokoll minimala mängder av makrofager och snabbt ger nästan alla grundläggande metabola cellegenskaper. Detta resulterar i tillräckligt överskott celler för att utföra andra immunologiska analyser och även de celler som används för bioenergetik profilering kan fortfarande användas för andra purposed efter analysen. Dessutom tillåter den särskilda 96 brunnar format bedömer flera villkor i realtid samtidigt. Ändå kan variationen mellan individuella brunnar vara betydande och därför är användningen av minst 4 brunnar per betingelse är ofta önskvärt. Tagit denna begränsning hänsyn tillåter den beskrivna extracellulära flödesanalys fortfarande att köra mer än 10 experimentella betingelser (n = 6) på en gång, vilket är mycket mer än traditionell teknik.

Sammantaget denna artikel ger ett enkelt och reproducerbar funktionell analys som gör det möjligt att mäta alla relevanta glykolys och mitokondriell parammetrar i polarise makrofag delmängder. Denna teknik kan fungera som en framtida program för att bedöma makrofagfunktion och utvärdera effekten av olika manipulationer (t.ex. gen knock ner, nya läkemedel, etc.) på makrofagen s (metabolisk) fenotyp. Som sådan, kan extracellulära flödesdata användas tillsammans med andra analyser för att möjliggöra en fördjupad karakterisering av makrofagaktivering status.

Disclosures

Fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Seahorse Bioscience.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23G and 25G needles Becton Dickinson #300800 and #300600 To flushed bone marrow
10 ml syringes Becton Dickinson #307736 To flushed bone marrow
Petri dishes Greiner #639161 To culture bone marrow cells
CyQUANT Cell Proliferation Assay kit  Molecular Probes #C7026 For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit  Molecular Probes #35011 For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)
XFe96 cell culture microplate Seahorse Bioscience #101085-004 96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done
recombinant mouse interleukin-4 (IL-4) Peprotech #214-14-B Used to induced alternative macrophage activation
lipopolysaccharide (LPS) Sigma #L2637 Pro-inflammatory stimulus
Seahorse Sensor Cartridge  Seahorse Bioscience #102416-100 Contains the probes for pH and O2 measurement
Seahorse XF Calibrant  Seahorse Bioscience #100840-000 Needed to hydrate the probes overnight 
XF base medium  Seahorse Bioscience #102353-100 Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes
L-glutamine Life Technologies #25030-081
D-(+)-Glucose Sigma #G8769 Fuels glycolysis once added to the cells
oligomycin A Sigma #75351 Inhibits mitochondrial ATP synthase
FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) Sigma #C2920 Uncouples mitochondrial respiration
100 mM Sodium Pyruvate solution Lonza #BE13-115E Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis
Antimycin A Sigma #BE13-115EA8674 Inhibits complex III of the mitochondria
Rotenone Sigma #BE13-115EA8674R8875 Inhibits complex I of the mitochondria
Casy Cell Counter Roche Diagnostics #05 651 697 001 Instrument to count cells
anti-CD16/CD32 eBioscience #14-0161 Fc receptor block flow cytometry
anti-F4/80-APC-eFluor780 eBioscience #47-4801 Antibody to stain macrophages
anti-CD11b-FITC eBioscience #11-0112 Antibody to stain macrophages

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. (2015).
  3. Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436 (2014).
  6. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).
  16. Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

Comments

1 Comment

  1. After step 17 in your protocol, you have a note that says pharmaceutical compounds can be used at this point. Does that mean immediately following the LPS stimulation or does this mean 24 hours after the LPS stimulation?

    Also, in step 17, do you suggest treating wells directly with LPS or adding LPS to fresh media and replacing the media on the plate?

    Reply
    Posted by: Morgan N.
    January 24, 2018 - 12:25 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics