인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

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Peters, P. N., Schryver, E. M., Lengyel, E., Kenny, H. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. Exp. (106), e53541, doi:10.3791/53541 (2015).

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Abstract

Protocol

설명하는 모든 연구 프로토콜은 시카고 임상 시험 심사위원회의 대학 (IRB)에 의해 검토되었다. 동의서는 수술 전에 각 환자로부터 얻어진 것으로,이 연구는 시카고 IRB의 대학에 의해 승인되었다. 보호를위한 인체 조직을 처리하고 세포를 오염의 위험을 줄일 때 생물 안전 캐비닛 2 형 장갑을 사용해야합니다.

차 변환되지 않은 기질 세포의 1. 분리 및 문화

  1. 인체 조직 수집 및 준비.
    1. 복부 수술 중 제거 된 인간의 대망, 2cm 3의 표본을 확보, 즉시 RT 인산 완충 식염수 (PBS) (그림 2A)에서 조직 몰입. X 2cm 대망 3cm의 조각은 일반적으로 1,000,000 주 인간 중피 세포 (HPMC) 및 20 차 인간 섬유 아세포 또는 정상 대망 섬유 아세포 (NOF)를 산출한다.
    2. 조직이 3 0.5 XG에 침지 PBS를 스핀 다운분 가능한 한 빨리 후 수집 (<2 PBS의 시간)과 50 ML 원뿔 튜브에 신선한 20 ml의 PBS로 조직을 전송합니다. 15cm 직경, 무균 배양 접시 (그림 2B)에서 메스로 닦지에 의해 5mm 3 조각으로 조직을 잘라.
  2. 일차 인간 중피 세포 분리 8
    1. HPMC를 분리하려면 50 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송하고 고체 조각이 상단 (그림 2C & D)에 떠있는 1 분을 기다립니다. HPMC와 적혈구 (RBC)의 하단에있는 액체에 존재합니다. 튜브의 바닥에서 그리고 새로운 원추형 튜브로 액체를 제거하기 위해 피펫을 사용한다. 3 분 0.5 XG에서 액체를 스핀 다운 및 HPMC / RBC 펠렛에서 뜨는을 대기음.
      1. , 다진 조직에 20 ml의 PBS를 추가 조직, 스핀 다운, 상승 피펫 및 HPMC / RBC 튜브에 바닥에서 액체를 제거 할 수 있도록하고 제거 : 과정을 세 번 반복상층 액. 모든 스핀 완료 및 상청액 흡입 후, 펠릿 HPMC 및 RBC를 포함 할 것이다.
    2. 플레이트 10 % 소 태아 혈청 [FBS, 1 % MEM 비타민 [93 ㎎ / ℓ], 1 % MEM 비 필수 아미노산 [81.4 전체 성장 배지 15 ㎖ (DMEM에서 75cm 2 플라스크에 펠릿의 모든 셀 ㎎ / ℓ], 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 [펜 연쇄상, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신).
    3. 추가 HPMCs을 분리 보조 PBS 세척을 수행합니다.
      1. 조직이 정상에 떠위한 보조 PBS 세척를 들어, 200 rpm으로, PBS의 20 ㎖에서 10 분 동안 37 ° C에서 남아있는 고체 조직을 흔들어 후 1 분을 기다립니다. 3 분 0.5 XG에 원심 분리기, 새로운 튜브로 튜브의 바닥에서 액체를 제거하고 뜨는을 대기음.
      2. 전체 성장 매체의 15 ㎖에 별도의 75cm 2 플라스크에 씻어 보조 PBS에서 모든 HPMC / RBC 플레이트.
    4. 어떤 연구를 분리하려면부피 PBS 용액 : 1 0.25 % 트립신 25 밀리미터 EDTA : HPMC를 emaining, 1 20ml에 10 분간, 200 rpm에서 37 ° C 정도를 다진 조직을 흔들. 조직, 상승 관의 하단에있는 액체를 수집 새로운 50 ML 튜브로, 0.5 GX 3 분에서 스핀 다운을 허용합니다.
      1. 뜨는을 대기음 및 전체 성장 매체의 15 ㎖에 별도의 75cm 2 플라스크에 모든 HPMC / RBC를 접시.
    5. 배양 습한 환경에서 37 ° C에서 5 % CO 2에서 도금 셀. 소비 매체를 제거하지 않고 3 일 및 5 일에 완전 성장 배지 15 ㎖에 첨가함으로써 공급 도금 셀. HPMC는 분할 전에 5-7일 배양 할 수있다.
      1. 원래의 표현형의 탈분화 및 수정을 최소화하기 위해 모든 실험에서 (통로 2까지) 낮은 통로 HPMC를 사용합니다. 위상차 capabilitie 플라스틱 미분 간섭 대비 기능 또는 4-20x 목적으로 20 배 목적으로 바람직 넓은 필드 현미경을 사용하여의 세포의 모든 이미지를 복용 (현미경의 위상 콘트라스트 필터), 3,3'- 디아 미노 (DAB) 얼룩을 면역 조직 화학 분석 밝은 분야에서 10 배 목표 ().
    6. HPMC가 입방 것을 확인하고 면역 조직 화학 (8) (그림 3A, C, E)를 수행하여 cytokeratin 8 멘틴을 표현한다.
  3. NOF 분리 (8)
    1. 1 : 100 배 펜 연쇄상 구균의 1 : 1 혼합물 (1)를 결합하여 콜라겐 유형 III 솔루션 (10 배)의 주식 10 ㎖를 준비 콜라게나 제 3 형의 1,500 유닛 활동 / ㎖를 : PBS에서 히알루의 714 유닛 활동 / ㎖.
    2. 1 % MEM 비타민 [93 ㎎ / ℓ]와 무 혈청 배지에서 희석 10 배 콜라겐 유형 III 용액 10 ㎖ (DMEM에 6 시간 동안 200 rpm에서 HPMC 분리 후 남아있는 다진 대망의 조직, 37 ° C를 흔들어, 1 % MEM 비 필수 아미노산 [81.4 ㎎ / ℓ], 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 [펜 연쇄상, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신]). 소화 조직은 불투명 한 모양과 일부 섬유 파편 (그림 2E)을 가질 수있다.
    3. NOF 함유 용액을 원심 분리하여 세포 실온에서 3 분 0.5 XG에 정지에, 뜨는을 대기음 및 전체 성장 매체의 13 ㎖에 75cm 2 플라스크에 펠렛을 접시.
    4. 이전 용지를 제거하고 24 시간 후 신선한 전체 성장 매체의 15 ㎖로 대체합니다. NOF는 분할 전의 1-3일 배양 할 수있다. 세포가 포화 상태에 도달했을 때 NOF의주의 확산은 중단됩니다.
    5. 기본 인간 섬유 아세포는 평면, 신장 세포임을 확인하고 멘틴을 표현하지만, 면역 조직 화학 (8)을 수행하여 8 cytokeratin하지 (그림 3B, D, F). 탈분화을 최소화하기 위해 (이상적 통로 (3) 전) 실험 낮은 통로 NOF를 사용하여 원래 표현형의 수정. 세포의 모든 단계 이미지를 복용 플라스틱 DIC 기능이있는 20 배 목적으로 넓은 필드 현미경을 사용하여,밝은 분야에서 10 배의 목표는 면역 조직 화학 DAB 염색을 분석합니다.

2.의 Organotypic 문화 (8) 도금

  1. 더 이상으로 5 분 이상 3 ㎖의 0.25 % 트립신 / EDTA 25 mM의 뒤에 PBS 10 mL로 세척하여 75cm 배양 플라스크에서 분리 NOF. 완전 성장 배지의 적어도 3 배 부피의 트립신을 중화.
  2. 50 ML 원뿔 튜브에 트립신 세포를 전송하고 0.5 GX 3 분에서 스핀 다운. 상층 액을 제거하고 전체 성장 미디어 5 ㎖에 다시 세포를 가지고. 문화 플라스크에서 회수 된 세포를 계산하는 셀 카운터를 사용합니다.
  3. 96 웰, 분명 바닥, 검은 접시에 100 μL 당 2,000-4,000 NOF를 판에 전체 성장 매체의 적절한 볼륨에서 세포를 희석. 도금하기 전에 세포 혼합물에 쥐 꼬리 콜라겐 I는 0.5 μg의 / 100 μl를 추가합니다. 하자 세포는 적어도 4 시간 동안 습한 환경에서 5 % CO 2에서 37 ° C에 앉아서, 또는 세포까지플레이트 표면에 부착합니다.
  4. 단계 2.1 및 2.2에 설명 된 것과 동일한 방법을 사용하여 배양 플라스크에서 HPMC를 놓습니다. 완전 성장 배지의 적당한 양의 세포를 이미 96- 웰 플레이트에서 콜라겐 I 도금 NOF의 상부에 50 μL 당 10,000-20,000 HPMC를 플레이트에 희석. 세포 실험을 시작하기 전에 적어도 18 시간 동안 습한 환경에서 5 % CO 2에서 37 ° C에서 앉게.
  5. 완전 성장 배지에서 HeyA8 난소 암 세포를 배양 발현 녹색 형광 단백질 (GFP). HeyA8 난소 암 세포가 형광 요각류 cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1)를 발현하는 렌티 바이러스 벡터의 식으로 표시되어 있습니다. HeyA8 난소 암 세포는 사용 일 (대수 증식기)에 80-90% 합류해야한다. 배양 접시에서 세포를 분리 및 일차 전지에 대한 단계 2.1-2.2에 설명 된 것과 동일한 방법을 사용하여 계산합니다.
  6. 난소 암 세포는 37 ℃에서 15-20 분 동안 완전 성장 배지로 복구 할뚜껑을 원뿔 튜브 느슨하게 봉인.

3. 접착 분석 (8)

  1. 회복 후, 0.5 XG에서 3 분 동안 회전시켜 난소 암 세포 펠렛 후 상청액을 제거하고 50,000 세포 / 100 ㎕의 농도를 달성하기 위해 혈청이없는 배지의 적당한 부피 세포를 희석.
  2. 소비 매체를 분리 HPMC / NOF의 Organotypic 함께 배양 96 웰 플레이트를 전환하고, 각 웰에 무 혈청 배지에서 암 세포 현탁액 100 ㎕를 추가한다. 4 시간 30 분 동안 습한 환경에서 5 % CO 2에서 37 ℃에서 플레이트를 배양한다.
  3. 미디어 및 비 - 부착 세포를 제거하기 위해 96 웰 플레이트를 전환. 조심스럽게 부드럽게 잘 각각에 PBS의 100 μl를 피펫, 다시 판을 반전 낮은 전력에서 멀티 채널 피펫을 사용합니다. PBS를 한 번 더 씻어 반복합니다.
  4. PBS를 제거하고 각 웰에 100 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 추가하는 반전. 판은 20 마일 동안 앉아 허용N 세포를 해결하려면. 20 분 후, 플레이트를 반전 100 μl의 PBS를 추가합니다.
  5. 웰의 총 형광보고 될 수 있거나 또는 세포의 수를 정량 할 수 있습니다. 정량, 1 백만 세포 / ml의 농도로 HeyA8 세포를 이용한 복제에서 제 1 플레이트 표준 곡선.
    1. 아래 100 만 셀을 회전 미디어를 제거하고 20 분 동안 1 ml의 4 % 파라 포름 알데히드에 앉아 할 수 있도록하여 표준 곡선을 확인합니다.
    2. 스핀 세포는 다시 PBS (재검 세포가 100 만 / ml의 농도를 확인하기 위해) ㎖로 1에서 가져온다. 플레이트 50,000, 40,000, 30,000, 20,000, 10,000, 5,000, 1,000, 잘 중복의 각에 0 세포 및 각 웰에 50 μL의 최종 총 볼륨 PBS를 추가합니다.
  6. 아래는 높은 우물 (표준 곡선에 50,000) 확장, 형광 플레이트 리더 (여기 = 488 nm의, 방출 = 528 ㎚)의 문화 판을 읽어 보시기 바랍니다. organotyp 부착 얼마나 난소 암 세포를 계산하는 표준 곡선을 사용하여각 웰 (도 4A-C)에서 IC 배양.

4. 대량 살상 무기 확산 분석 (10)

  1. 난소 암 세포가 회복 후 1 % FBS와 (DMEM에게 1 % FBS 배지의 적당한 부피로 세포를 희석 한 다음 0.5 XG에서 3 분 동안 회전시켜 세포 펠렛과, 1 % MEM을 (단계 2.5 이상 2.6 참조) 비타민 [93 ㎎ / ℓ], 1 % MEM 비 필수 아미노산 [81.4 ㎎ / ℓ], 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 [펜 연쇄상 구균은 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신])를 4,000 세포의 농도를 달성 / 150 μL.
  2. 각 웰에 FBS 매체를 소비 매체를 제거하고, 1 %에서 암 세포 현탁액 150 μl를 추가 HPMC / NOF의 Organotypic 문화로 96 웰 플레이트를 전환. 72 시간 동안 가습 환경에서 5 % CO 2에서 37 ℃에서 플레이트를 배양한다.
  3. 아래는 상대적 확산을 평가하기 위해 한 번 형광 플레이트 리더 일 (여자 = 488 nm의, 방출 = 528 ㎚)의 문화 판을 읽고세포의. 48 시간 (그림 5A-C)에서 미디어를 변경, 96 시간 동안 분석을 계속합니다. (접시 바람직하다 반전) 미디어를 변경할 때 문화를 방해하지 않도록주의하십시오.

5. 침략 분석 (8)

  1. 3D 문화를 도금하기 전에, 24 웰 배양 플레이트 삽입 (8 μm의 기공 크기)에 200 μL PBS에 7.5 μg의 쥐 꼬리 콜라겐 I를 추가합니다. 판을 품어 O는 / N은, 조심스럽게 즉시 콜라겐 코팅 인서트 (위의 2 단계)에 HPMC / NOF의의 Organotypic 문화를 도금하기 전에 피펫으로 PBS를 제거 할 수 있습니다.
  2. 단계 3.1에서와 난소 암 세포를 준비한다. 삽입에의 Organotypic 문화에 난소 암 세포를 플레이트에 조심스럽게 삽입의 상단에서 초과 용지를 제거하기 위해 피펫을 사용합니다. 각 웰에 무 혈청 배지에서 난소 암 세포 현탁액 100 ㎕를 추가한다.
  3. 암 세포를 유도하는 웰 인서트 아래로 완전 성장 배지 750 μl를 추가의 Organotypic 문화에 vasion. 24 시간 동안 가습 환경에서 5 % CO 2에서 37 ℃에서 플레이트를 배양한다.
    주 : 문화의 Organotypic 삽입물을 건너 인서트의 바닥면에 남아 침입 난소 암 세포.
  4. 빈 우물에 삽입물을 이동 한 후, 24 시간 후, 집게와 인서트를 잡고 간단히 PBS의 비이커에 씻어. 1 분의 총 면봉의 양측 각 인서트의 상부 스크럽. 신속하게 잘 각각 750 μL 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 플레이트에 삽입을 배치합니다. 각 삽입 750 μL PBS로 가득 우물에 삽입을 전송하기 전에 10 분 동안 파라 포름 알데히드에 앉아하도록 허용합니다.
  5. 2.5 배의 배율로 현미경 침략 세포 (인서트의 바닥에 접착 고정)를 조회. 전체 웰이 시야 내에있는 경우, 회피, 10 배의 배율을 조정하고 5 사진, 물론 각 사분면에서 하나의 중앙 부근에 1을가장자리에 너무 가까이있는 이미지를 복용. 물론 각각의 동일한 패턴을 따릅니다.
  6. 이들 프로토콜에 따라 각 웰 (도 6A-C)에서 필드 당 침략 세포의 평균 수를 얻기 위해 각각의 이미지 셀의 수를 계산하기 위해 제조자의 프로그램을 사용한다.

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Representative Results

배양의 Organotypic 제 콜라겐 타입 I과 차 인간 섬유 아세포를 혼합 한 다음 중피 세포의 5 배 번호 이것 문화를 오버레이하여 조립 하였다. 난소 암 세포 부착, 침입이나 확산을 연구하기 전에 첨가하고 배양은 적어도 18 시간 동안 인큐베이션 하였다. 각 분석은 다중 반복 하였다 (N = 5), 침윤 분석 (N = 3) (N = 3-5) 다른 환자 및 수많은 웰로부터 얻은 3D 배양 접착 각 조건에서 시험 하였다 (N = 5), 확산 . 4 시간 (그림 4) 후 3 차원의 Organotypic 문화에 부착 된 난소 암 세포는 72 시간 (6 시간 HeyA8 세포 배가 시간) (그림 5) 후 문화를 확산하고, 24 시간 (그림 6) 후 침공. HeyA8 난소 암 세포의 부착, 증식과 침윤 인테그린 - 의존성 (도 4-6)이었다. 즉, RGD 펩티드 및 antib 블로킹항체 (그림 4) 10하지 않았다 -integrin 라드 펩타이드, 제어 항체와 4 β 동안 odies은의 Organotypic 문화에 난소 암 세포 부착을 억제 -integrin 5 -integrin, β 1 -integrin 및 α의 V β (3) α합니다. 상기의 Organotypic 문화를 억제 난소 암 세포 증식 -integrin 1 β, RAD 펩타이드, 항체를 제어하면서, α 항체 -integrin 3 β 4 -integrin을 β v에 - 증식 분석, RGD 펩티드 및 5 α 항체를 블로킹 항체 (그림 5)하지 않았다. 항체 -integrin α 브이 β 3 차원의 Organotypic 문화를 통해 난소 암 세포의 침략을 강화하면서, 및 억제 -integrin 1 β - 침공 분석에서, RGD 펩타이드 및 차단 항체는 5 α합니다. RAD 펩티드, 대조군 항체 및 β4 -integrin 항체는 침략 (그림 6)에 영향을 미치지 않았다. 드물게, 이러한 분석은 미 해석 할 수 없습니다 (즉, 제어 항체에 비해 접착, 확산 또는 침략을 억제하지 않습니다 항체를 차단 -integrin α 5). 이전에, 우리는 특정의 Organotypic 문화가 분석 중에 미디어 또는 PBS 세척의 변화에​​ 씻어 것을 발견했다. 난소 암 세포가 죽은 또는 트립신에서 충분히 회복되지 않은 경우 또한에 다시 명시 인테그린을 ​​소화, 분석이 작동하지 않습니다. 따라서, 배양의 Organotypic 및 난소 암 세포 분석의 품질이 평가 될 수 있도록 각각의 분석에서의 양성 및 음성 대조군을 갖는 것이 중요하다. 여기에 도시 된 바와 같이, RGD 펩타이드, 5 -integrin를 α와의 Organotypic 문화에 대한 항체를 모두 억제 난소 암 세포 부착, 침략과 확산을 차단 -integrin 1 β과 긍정적 인 사기꾼으로 사용할 수 있습니다미래 분석에 trols. 마찬가지로, 4 β 항체를 블로킹의 Organotypic 배양에 난소 암 세포 부착, 침입 및 확산에 영향을 미치지 않았다 -integrin 미래 분석에서 음성 대조군으로 사용할 수있다.

그림 1
인간의 대망 전이 그림 1. 조직학. 헤 마톡 실린 및 (가) 정상적인 인간의 대망 (MC, 중피 세포, FIB, 섬유 아세포, 안녕, 지방 세포)와 (B) 난소 암 대망 전이 (메트로, 난소 암 전이)의 에오신 염색. = 패널에 길이가 100 ㎛ 바. 인간의 대망의 표면에 초기 난소 암 세포의 전이를 흉내 낸 난소 암 전이의 차원의 Organotypic 모델 (C) 도식. 버전 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 시온.

그림 2
차 인간 대망 세포의 그림 2. 분리. (A) 대망의 조각은 PBS 수술에서 수집 및 실험실로 운반된다. 티슈는 0.5 xgx 3 분으로 펠릿 신선한 PBS로 전송된다. (B) 대망의 단편은 PBS로 세척하고 10cm 배양 접시로 전송하고, 메스 작은 조각 (0.5 cm로 복막을 절단하는 데 사용되는 3 ). (CD) 조직의 조각 25 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 수집 및 HPMC의 분리를위한 50 ML 원뿔 튜브로 전송됩니다. PBS은 튜브에서 제거되고 HPMC는 PBS에서 37 ° C에서 0.5 XG를 펠릿된다. (MC는 중피 세포, RBC는 적혈구는, FIB는, 섬유 아세포) (E)는 NOF remaini 격리되어 히알루 및 콜라게나 제 III 형과 배양 후 NG 대망 조직. 이미지는 6 내지 12 시간의 소화 후 조직을 보여줍니다. NOF는 실온에서 0.5 XG에서 회전시켜 펠렛있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
HPMC와 NOF 그림 3. 특성은 인간의 대망의 조직에서 분리. (A) 중피 세포 (HPMC)와 (B) 섬유 아세포 (NOF)의 위상 콘트라스트 이미지를 대망 조직에서 분리 한 후. 인간 HPMC는 (C) cytokeratin 8 (E)에 대한 염색 멘틴. 인간 NOF는 (F) vimentin에 대한 염색하지만, (D) cytokeratin 8 바 = 100 μm의를 위해 염색하지 않은, 모든 패널에 적용됩니다.ftp_upload / 53541 / 53541fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
의 Organotypic 배양에도 4 난소 암 세포 부착은 인테그린 - 의존성이다. 프로토콜 부분에 기재된 바와 같이 (A)의 접착 분석은 50,000 형광 표지 한 난소 암 세포, HeyA8 세포로 수행 하였다. 각 웰에 총 형광가보고됩니다. 대조군 항체는 마우스 IgG이다. 각 막대는 평균 + 표준 오차 평균을 나타냅니다. 주제 (B) 및 위상차의 Organotypic 배양에 난소 암 세포 유착의 (C) 형광 이미지. 바 = 100 μm의이 두 패널에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
배양의 Organotypic도 5에 난소 암 세포의 증식은 인테그린 - 의존성이다. 프로토콜 부분에 기재된 바와 같이 (A) 증식 분석은 4,000 형광 표지 한 난소 암 세포, HeyA8 세포로 수행 하였다. 세포의 총 수는보고된다. 대조군 항체는 마우스 IgG이다. 각 막대는 평균 + 표준 오차 평균을 나타냅니다. 병합 된 위상차와 (B)에서의 Organotypic 배양에 난소 암 세포 증식의 형광 이미지 (24)와 (C)의 96 시간. 바 = 100 μm의이 두 패널에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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의 Organotypic 문화를 통해 그림 6. 난소 암 침공 인테그린에 의존합니다. 프로토콜 절에 설명 된대로 (A) 침공 분석은 40,000 형광 표지 난소 암 세포, HeyA8 세포 하였다. (인서트의 바닥에 3 차원 배양을 통해 이동) 침입하는 셀의 수를보고한다. 대조군 항체는 마우스 IgG이다. 각 막대는 평균 + 표준 오차 평균을 나타냅니다. (B) 및 위상차 (C)의 Organotypic 배양을 통해 침입 난소 암 세포의 형광 이미지. 바 = 100 μm의는, 모든 패널에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

복막 미세 환경의의 Organotypic 모델은 난소 암의 보급에 미세 환경의 세포와 타고난 구성 요소를 모두의 개인 및 집단 기능 (들)을 평가하기 위해 설립되었다. 난소 암 세포 부착, 증식, 그리고 침략을 조사하기 위해 3 차원의 Organotypic 문화를 도금 및 사용자 정의에 대한 특정 프로토콜이 제공됩니다. 일차 인간 장간막 중피 세포 및 섬유 아세포는 환자로부터 분리 된 형태 및 정상 변이 환자를 보존 이른 통로에서 사용 하였다. 이 모델에서, 정상 대망 섬유 아세포 및 ECM (일반적으로 콜라겐 타입 I)는 기본 인간 중피 세포 단일 층으로 적층 하였다. 이 모델은 조직 학적으로는 복막 안감을 모방, 우리가 다시 난소 암 세포 부착, 증식 및 침입 8,27 포함 난소 암 전이의 주요 이벤트를 검사 할 수 있습니다.

이전 제한 3D 모델이이 3 차원의 Organotypic 모델은 복강의 중피 라이닝의 구조를 다시 제 반면, 미세 13,14,21-25 난소 암과의 상호 작용을 조사하기 위해 설립되었다. 인간의 대망은 나이와 건강에 변화 환자에서 수집됩니다. 조직의 건강에 직접 중피 세포와 섬유 아세포 분리 기술에 영향을 미친다. 건강한 조직은 현재 큰 소엽 (> 5mm)와 컬러에 더 오렌지가 조직에 비해 매우 작은 소엽 (1~3mm)와 색상에 가벼운 나타납니다. 조직은 실험실에서 수행되는 수술로서 HPMC의 대부분은 초기 PBS에 내놓고. 1 PBS : 조직 건강, 그러나, 탄력 HPMC는 제거 및 추가 PBS 세척 및 1에있는 트립신 다이제스트는 HPMC와 NOF 세포의 혼합 문화의 원인이 될 수 있습니다. 건강한 조직, 일부 HPMC는 6 시간 콜라게나 소화 살아남을 수 있고, 전체의 1 배 콜라겐 솔루션의 다이제스트 O / N성장 매체는 순수한 NOF 문화를 획득하는 것이 좋습니다. 대망가 제거시 PBS에 즉시 배치해야하거나 더 HPMCs이 조직에서 발견되지 않습니다 있습니다. 조직이 RT 또는 냉장고에서 시간 (> 2 시간) 연장 된 기간 동안 PBS에 저장되는 경우 또한, 격리 가능한 HPMCs의 수는 현저하게 감소된다.

1 : 중피 세포 아세포 (5)의 비 생체 8 중피 세포 아세포의 비율을 모방하도록 도금된다. 그것은 절연 중피 세포의 크기는 환자마다 다르다 이것은 도금 비율 조정을 요구할 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 일부 환자의 중피 세포는 훨씬 더 작다; 이러한 경우에, 우리는 중피 세포 (20,000)의 수를 두 접시. 또한, 기본 셀은 항상 형태를 보존하기 위해 초기 (1-2) 통로에 사용된다. 중피 세포는 입방 형 또는 가늘고, 그리고 입방 중피 세포가 더 가늘고 될 수 있습니다이들은, 또는 TGFβ 10 난소 암 세포 또는 치료에서 조정 배지에 계대 큰 노출 된 바와 같다.

난소 암 세포 부착과 동일하거나 상이한 환자로부터의 중피 상피 세포를보다 효율적으로 간엽 중피 세포를 통해 침투 할 수있다. 일반적으로, 우리는 난소 암 세포의 기능 분석을 시작하기 전에 18 시간 동안의 Organotypic 문화를 설정할 수 있습니다. 이상 중피 세포 및 섬유 아세포, 이들이 난소 암 세포의 거동에 영향을 미칠 수있는 ECM 단백질을 포함한 다른 단백질을 분비 할 시간 배양했다. 이러한 분석을 수행하는 인테그린, 프로테아제, 및 성장 인자를 포함하여 향상된 접착력, 내습, 및 / 또는 증식과 관련된 단백질의 차등 증식 속도 및 발현 수준이 때 또 하나의 중요한 요소는 각각의 암 세포주 또는 일차 인간에서 고려해야 암 세포 유형.배양의 Organotypic와 기능 분석의 각각에 사용 된 암세포의 시간과 번호는 각 암 세포주 또는 일차 세포의 암 유형에 대해 최적화 될 필요가있다. 예를 들어, 기재 부착 분석에서, 난소 암 세포는이 시간 동안 배양 침입 될 수있다.

분명이의 Organotypic 모델은 이러한 모든 면역, 내피로 정상 복막 미세 환경의 구성 요소 및 지방 세포의 세포가 포함되어 있지 않습니다. 일차 세포가 오직 처음 세 통로 내에서 사용되는 바와 같이 또한, 모델, 액세스 가능성 및 일차 인간 조직의 이용에 의존한다. 그러나, 기본 모델은 사람 세포 및 전이에 중요한 역할을하는 것으로 입증되었다 여러 세포 유형의 결합의 사용에 많은 이점을 갖는다. 이 모델은 이후에 개별 세포 유형에서의 유전자 조절 단백질 (예, 암세포, 정상적인 중피 또는 섬유 아세포)를 조사하기 위해 사용되어왔다공동 문화. 특히,의 역할 초기 전이에 C-메트로 28, MMP-2 9, 29, 5 -integrin 10,31 α 3 -integrin 16 β E-cadherin의 30, β 1 -integrin (10), 및 피브로넥틴 (10)는이 탐구되었다. 또한, 모델은 지방 세포 (6)의 혼입과 같은보다 세포 유형을 포함하도록 확장 할 수있는 가능성을 갖는다. 모델 수정 및 복막 미세 환경 (27)에 난소 암 세포 유착 / 내습의 소분자 저해제를 식별하기 위해 고 처리량 스크리닝에 사용하기 위해 소형화되고있다. 이 모델의 미래 응용 프로그램은 기계 론적 연구와 높은 처리량 검사에 대한 대 식세포를 포함한 분석에 면역 세포의 결합을 포함 할 것이다. 요약하면, 세포 배양의 Organotypic는 고아와 복막 미세 인간 난소 암 세포 사이의 상호 작용을 평가하는 유용한 모델을 제공한다확산과 질병 진행의 중요한 분자 메커니즘을 해명하고, 잠재적 인 치료 표적을 식별 L.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation and culture of primary cells
PBS Fisher Scientific SH3001304
Single-edged razor blades Fisher Scientific 12-640
15 cm culture dishes BD Biosciences 353025
Glass flask ? ?
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000044_3616914956
DMEM with L-Glutamine Corning 10-013-CV
MEM Vitamins Corning 25-020-Cl
MEM Nonessential amino acids Corning 25-025-CI
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
Shaker  Thermo-Fisher MaxQ 4450
Centrifuge Eppendorf 5702
Incubator Thermo-Fisher Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%) Corning 25-053-CI
Hyaluronidase Worthington Biochemical LS002592
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
T-175 Flasks BD Biosciences 353112
Pipet tips Rainin P2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tips Corning Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
2. Plating 3D culture
Cell Counter Invitrogen Countess
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10313
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Collagen Type I (Rat Tail) BD Biosciences 354236
96 well plate, clear bottom, black BD Biosciences 353219
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipet Eppendorf Xplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Plate reader Molecular Devices Minimax
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well) BD Biosciences 353097
Cotton swabs Q-tips cotton swabs
Microscope Zeiss Axiovert 200m
Cell Profiler public domain
24 well plate BD Biosciences 353047
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 EMD Millipore MAB1976
Beta 1  Oncosynergy OS2966
Alpha 5 [CD49e] ID Pharmingen 555615
Beta 4 [CD104] EMD Millipore MAB 2058

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References

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