Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Neuroscience

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Nishimura, C., Polesskaya, O., Dewhurst, S., Silva, J. N. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (107), e53582, doi:10.3791/53582 (2016).

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Abstract

Introduction

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) dringt in das Gehirn während der akuten Phase der Virus-Infektion, und produktiv infiziert sowohl Mikroglia und Gehirn Makrophagen, was zu deren Aktivierung - und die Freisetzung von beiden Host-abgeleitete Entzündungsmediatoren und lösliche HIV-1 virotoxins wie Tat und gp120 (in 1,2 überprüft). Als Folge davon wird ein chronischer Zustand neuroinflammatorischen im ZNS, die vermutlich auf die Pathogenese der HIV-1-assoziierte neurokognitive Störungen (HAND) 3-5 beitragen etabliert.

Chronische Überexpression von HIV-1 Tat oder Interleukin (IL) -17A im ZNS von Mäusen wurde gezeigt, dass in der mikrovaskulären rarefaction 6,7 führen. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass eine chronische Neuroentzündung kann zur Pathogenese von Hand durch Wirkung auf die zerebrale Gefäßsystem beizutragen. Um diese Frage weiter zu prüfen, haben wir Methoden, um zerebrale vaskuläre struc Quantifizierung entwickeltturen.

Dieser Beitrag beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung der Anzahl der Kapillar-Knoten, Kapillar Segmente bedeuten Segmentlänge, Gesamtsegmentlänge, bedeuten Kapillardurchmesser und Gesamt Kapillarvolumen mit In-vivo-Bildgebung von Kapillarnetzwerke durch eine dünne Schädel kortikalen Fenster (von zuvor beschriebenen modifizierten Protokolle) 8,9 sowie ex vivo-Abbildung von Gehirnschnitten unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie. Dieser kombinierte Ansatz sieht eine ganzheitliche Quantifizierung des zerebralen Gefäßparameter, da die in vivo-Dünn Schädel Kortikalisfenster ermöglicht die Erhaltung des zerebralen Umgebung während ex vivo-Abbildung von Kapillarnetzwerken in Hirnschnitten erlaubt die Rekonstruktion der vollständigen, dreidimensionalen Kapillarnetzwerke - die dann unter Verwendung im Handel erhältlicher Software quantifiziert werden kann.

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Protocol

Die Universität von Rochester Universität Ausschuss für Tier Ressourcen genehmigt alle in diesem Papier durchgeführt Verfahren.

1. Präoperative Vorbereitung (und Mäusen)

  1. Bereiten Sie den OP-Bereich mit allen erforderlichen Geräten haben. Sterilisieren Sie alle während des Verfahrens zuvor mit 70% Ethanol verwendeten Werkzeuge. Optional können Sie eine Glasperlen Sterilisators oder Autoklaven, um die Werkzeuge zu sterilisieren.
  2. Platzieren Sie die Maus in einer Isofluran Induktionskammer zu einer Isofluran Verdampfer verbunden ist. Eingestellt Isofluran Ebenen zu 4% bei einer Rate von 1 L / min.
    Anmerkung: Für die Experimente hier berichteten, Mäuse mit einer Doxycyclin (DOX) induzierbaren HIV-1-Tat-Transgens durch astrozytenspezifischer gliafibrilläres Protein (GFAP) -Promotor (HIV Tat-Tg-Mäusen) angetrieben 10 wurden verwendet, um die Wirkung von HIV zu untersuchen -1 induzierte Neuroentzündung auf die zerebrale Gefäßstruktur, wie zuvor beschrieben, 7,10.
  3. Spitze vorsichtig die Induktionskammer, um die Maus zu beobachten &# 39; s Stellreflexes. Sobald die Stellreflexes unterdrückt worden ist, setzen Sie die Isofluran-Level auf 2% und leiten den Luftstrom aus der Induktionskammer zu dem Nasenkegel an der Operationstisch.
  4. Bewegen sich schnell mit der Maus aus der Induktionskammer zu dem Wasser aufgegossen Heizkissen. Fahren Sie mit Isofluran (1,5-2%) durch die Nase Kegel gelten. Passen Anästhesie nach individuellen Maus Toleranz durch Atemfrequenz (RR) Überwachung bewertet.
    Hinweis: physiologischen Gasparameter verändert Hirndurchblutung und Gefäßdurchmesser Beurteilung kann die Vertiefung der RR zu stören. Versuchen, RR zwischen 55-65 Atemzüge pro Minute zu halten. Herzfrequenz (HR) verwendet Beurteilung der Narkosetiefe ist; Halten HR zwischen 300-450 Schlägen pro Minute auf physiologische Veränderungen Gefäßdurchmesser zu verhindern. Typischerweise wird eine ausreichende Anästhesie zwischen 1,5-2,0% Isofluran werden bei 1 l / min bei einem gegebenen Maus.
  5. Führen Sie eine Zehe Prise weiter prüfen Sie die Tiefe der Anästhesie. Wenn die Maus nicht reagiert, commENCE die chirurgischen Verfahren.

2. Herstellung der Thin-Schädelhirn Fenster

  1. Künstliche Tränen Gel für die Augen der Maus. Vollständig zu entfernen die Haare aus der Kopfhaut der Maus mit einer Schere oder einem elektrischen Rasierer.
  2. Sterilisieren der Kopfhaut durch Anlegen Povidonjodlösung; Trocknen lassen. Dann, unter einem Lichtmikroskop, entfernen Sie die Haut von der Kopfhaut der Maus, komplett Aussetzen der Scheitelbeine, Schwanzstirnknochen und Bregma Kennzeichnung.
  3. Sie eine kleine Menge einer 10% Eisenchloridlösung auf den Schädel, um die Membranen zum leichten Entfernen zu trocknen. Entfernen Sie die getrockneten Membranen mit den # 5/45 Pinzette vorsichtig Abkratzen der Schädel.
  4. Tragen Sie eine dünne Schicht Kleber auf der Kopfplatte Fenster. Drücken Sie den Kopfplatte gegen den Schädel der Maus, halten Sie den Bereich von Interesse in der Mitte des Fensters. Einen Tropfen Zahnzement auf der Kopfplatte, um den Kleber zu polymerisieren.
  5. Eine dünne SchichtKlebstoff entlang der Kante der Kopfplatte Fenster, ein Reservoir, in welchem ​​zu Kochsalz Halt. Nachdem der Leim getrocknet ist, schrauben Sie die Kopfplatte in die Maus Kopfplatte Baum.
    Hinweis: die Maus Kopfplatte Baum in diesem Verfahren verwendet wird, ist eine Struktur mit einer Metallbase und zwei Metallsäulen. In jeder Spalte gibt es einer Feder und einer Flügelmutter. Die Kopfplatte ist auf der Oberseite der Feder angeordnet, und die Flügelmutter angezogen, bis der Kopf waagerecht steht und sich nicht bewegt.
  6. Entfernen Sie alle Kleber von der Kopfplatte Fenster mit einem Bohrer auf eine Microtorque Bohrer bei 6.000 Umdrehungen pro Minute eingestellt angebracht. Stoppen Sie alle 10-15 sec, um eine Überhitzung der Maus Schädel, die in strukturelle Schäden an Schiffen zur Folge haben können, zu verhindern.
    1. Mit einem neuen Bohrer, platzieren Sie den Microtorque Bohrer 1,5 mm seitlich von der Mittellinie (ein Drittel des Durchmessers der Kopfplatte Fenster). Fangen Sie an, dünnen den Schädel in der Umgebung dieser Stelle bei 4.000 Umdrehungen pro Minute. Bewegen Sie den Bohrer sanft über den Schädel, die keinen direkten Druck nach unten.
    2. Cease drilling alle 10-15 sec Überhitzung der Maus Schädels zu verhindern. Während dieser Zeit, entfernen Sie den angesammelten Staub mit einem Totenkopf Druckluftbehälter.
    3. Verwenden Tropfen Kochsalzlösung auf RT Schädels für 5-10 sec abkühlen. Alle Flüssigkeit entfernen Sie vorsichtig mit einem weichen Tuch, um Schädel Ausdünnung fortsetzen.
  7. Für die endgültige Verdünnung des Schädels, stellen ein geringes Volumen von Kochsalzlösung in der Kopfplatte und Behälter leicht fegen eine Dentalmikroklinge über den Bereich von Interesse, bis kleine Gefäße sind deutlich sichtbar.

3. Überwachung von physiologischen Parametern

  1. Sobald der Schädel vollständig ausgedünnt, trennen Sie die Maus aus der Halterung und legen Sie sie auf dem Rücken. Gently kleben Sie beide Hinterbeine, um die mediale Oberschenkel deutlich aus.
  2. Entfernen Sie das Haar über beiden medialen Oberschenkel mit einer Schere oder einem elektrischen Rasierer. Desinfizieren Sie die Operationsstelle durch das Abdecken der Oberschenkel mit PVP-Jod.
  3. Sie die Haut an der medialen rechten Schenkel über die Oberschenkelveneund Arterie mit Hilfe der # 5 Pinzette. Ziehen Sie die Haut nach oben und mit einer Schere zu schneiden und entfernen Sie die Haut.
    Anmerkung: die linken Oberschenkel im Falle von chirurgischen Komplikationen (Gefäßanomalien aufgebrochenen Zellen) vorbehalten.
  4. Gelten etwa 3-5 Tropfen 0,9% -iger Salzlösung zur Operationsstelle. Dies ermöglicht eine größere Vergrößerung der Schiffe, sowie das Einhalten der Website mit Feuchtigkeit versorgt und verhindert das Trocknen der Gefäße. Trennen Sie die Oberschenkelvene von Arterie durch stumpf sezieren in die Oberschenkelgefäßnervenbündel mit zwei # 5/45 Pinzette.
  5. Stellen zwei 3 cm Stücke von chirurgischem Nahtmaterial unterhalb der Femoralarterie ungefähr 1 cm auseinander. Drehen Sie den oberen Faden im Uhrzeigersinn, um eine vaskuläre Blutsperre, die helfen, übermäßigen Blutverlust während der Katheterisierung zu verhindern erstellen.
  6. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Oberschenkelarterie mit Hilfe der Feder Schere. Platzieren des Katheters in der Arterie durch den Einschnitt und vorzuschieben, bis der Katheter sicher innerhalb der Arterie.
  7. Injizieren 10 ul Heparin (100 IU / ml) durch den Katheter, um die Blutgerinnung zu verhindern. Dann schließen Sie die chirurgisch rechten Oberschenkel durch Zusammennähen der Haut zusammen mit einem 4-0 Naht in einer einfachen unterbrochenen Muster.
  8. Injizieren Sie 50 ul Urethan (1,2 mg / g) intraperitoneal in der rechten unteren Quadranten. Fünf Minuten später wurden weitere 50 ul Einspritzung in den linken unteren Quadranten für eine Gesamtmenge von 100 ul intraperitoneale Urethan wiederholen. Isofluran Niveaus langsam zurück auf etwa 0,25%, während gleichzeitig rechecking Maus für die Tiefe der Anästhesie.
    Anm: Nadel oberflächlichen innerhalb der Bauchhöhle entlang der hinteren Bauchwand, so dass sie nicht den Darm zu perforieren. Dies kann durch Kneifen der Bauch rectus mu erreicht werdenscles weg von den Eingeweiden und dann Injizieren.
  9. Verwendung einer Kapillare, sammeln eine 40 ul-Probe von arteriellem Blut aus dem Katheter. Befestigen des Katheters an die Blutdruckwandler mit einer Kochsalzlösung gefüllten Vierwegehahn und Heparin Spritze angebracht.
  10. Band der Blutdruckwandler der chirurgischen Vorrichtung, um das unbeabsichtigte Entfernen des Katheters zu verhindern. Beginnt die Überwachung des mittleren arteriellen Drucks.
  11. Legen Sie die Blut gefüllte Kapillare in ein Blutgasanalysegerät Eintrittsöffnung. Sobald alles Blut extrahiert worden ist, entfernen Sie die Kapillare aus der Eintrittsöffnung. Die O 2 und CO 2 Blutgaswerte werden auf einem Papier aus dem Blutgasanalysegerät gedruckt erscheinen.

4. Injektion des fluoreszierenden Farbstoffs

  1. Klemmen Sie die Haut an der medialen linken Oberschenkel mit Hilfe der # 5 Pinzette. Ziehen Sie die Haut nach oben und mit einer Schere zu schneiden und entfernen Sie die Haut. Bereiten Dextran konjugierten rot emittierenden Rhodaminfarbstoff(70 kDa) (10 mg / kg in Salzlösung).
  2. Finde die Oberschenkel vein.Using eine 1-ml-Spritze mit einer 30-G-Nadel befestigt ist, ziehen Sie eine vorher hergestellte Lösung aus einem Fluoreszenzfarbstoff zur Bildgebung an die 130 & mgr; l Linie der Spritze geeignet. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem der Farbstoff vollständig in die Spritze und die Spritze fest flicking Wand.
    1. Biegen Sie die 30 G-Nadel auf einer ca. 30-Grad-Winkel, indem Sie sie gegen eine harte Oberfläche Kegel Seite nach oben. Füllen Sie die Nadel mit dem Farbstoff und entsorgen Sie überschüssige Flüssigkeit, eine 100 ul-Probe verlassen.
  3. Spritzen Sie die 100 ul-Probe von Farbstoff langsam in die Oberschenkelvene. Nach dem Entfernen der Nadel, gelten ruhig, und Druck auf die Injektionsstelle, um Blutungen zu stoppen. Ermöglichen, dass der Farbstoff für 5 min zirkuliert.
    Hinweis: Alternativ kann die rechte Femoralvene stattdessen für die Fluoreszenzfarbstoffinjektion zur weiteren Blutverlust durch die Schaffung eines weiteren Operationsstelle zu verhindern. Darüber hinaus, wenn dasTier unkontrollierbar Blutungen von der Operationsstelle, kann dies ein Hinweis darauf, dass zu viel Heparin gegeben wurde, um den Katheter zu spülen. Wenn es keine Gerinnung innerhalb von 10-15 min und die Maus immer noch Blutungen, sollten Sie einen Neustart des Experiments mit einer neuen Maus.
  4. Schließen Sie den linken Oberschenkel durch Zusammennähen der Haut zusammen mit einem 4-0 Naht, dann vorsichtig drehen Sie die Maus auf dem Bauch, und legen Sie sie in die Maus Kopfplatte Baum.

5. In Vivo Zwei-Photon Imaging

  1. Bewegen Sie die chirurgische Vorrichtung zu der Zwei-Photonen-Mikroskop, um sicherzustellen, um eine kontinuierliche Anästhesie Niveau zu halten. Eine kleine Menge an 0,9% iger Kochsalzlösung in der Kopfplatte Reservoir und Absenken des Mikroskopobjektivs, so daß er in Kontakt mit der Salzlösung kommt. Suchen Sie den Bereich von Interesse unter Verwendung der Hellfeld-Betrachtung Ziel
  2. Stellen Sie die Zwei-Photonen-Laser-Anregung zu einer Wellenlänge für das Fluoreszenz-Farbstoff geeignet. Beginnen Zwei-Photonen-Imaging mit der 25x oIEL.
    Man beachte, dass in diesen Experimenten verwendeten wir eine Dextran zu einem rot emittierenden Leucht Rhodamin-Farbstoff, der bei einer Wellenlänge von 780 nm angeregt wurde, konjugiert. A 607/36 Emissions Filterdurchlaßbereich, um die Fluoreszenz von dem Farbstoff zu erfassen, und eine Bandpassemissionsfilter 480/20 wurde verwendet, um den arteriellen Autofluoreszenz nachzuweisen
  3. Suchen Sie eine Kapillare auf dem Sichtschirm Bett, und vergrößern diesen Bereich mit dem optischen Zoom 2. Acquire Bilder der Kapillaren mit Hilfe der Zwei-Photonen-Imaging-Software.
  4. Nach der vollständigen Bildgebung ist, zu opfern, die Maus durch Genickbruch folgte durch Enthauptung.

6. Ex Vivo Zwei-Photonen-Imaging

  1. Mit den extra feine Schere, einen Einschnitt in die Kopfhaut vor den interparietal Knochen zu den Stirnknochen der Maus. Sichern Sie die Haut an den Seiten des Schädels mit dem Zeigefinger und Daumen.
  2. Legen Sie die zusätzlichen feinen Schere unter dem medialen Inkabein und schnitt den Schädel entlang der Pfeilnaht. Stoppen Schneiden des Schädels ca. 3 mm nach dem Bregma Kennzeichnung.
    Anmerkung: Bewerben Aufwärtsdruck beim Schneiden des Schädels Schneiden des Gehirns zu verhindern.
  3. Mit Hilfe der # 5 Zangen, trennen den Schädel aus dem Gehirn und entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhäute von der Oberfläche des Gehirns. Verbleibende Hirnhäute kann versehentlich zerfleischen das Gehirn; extreme Vorsicht ist geboten, um dies zu vermeiden. Schieben Sie die # 5 Zange unter dem Gehirn fort langsam nach vorne, bis Gehirn frei von Schädel.
    Hinweis: dass Abwärtsdruck sollten, um verwendet werden, um zu vermeiden Punktion des Gehirns.
  4. Legen Sie das Gehirn in einer Hirnschnittwerkzeug speziell für Mäuse. Durch Tüpfeln künstliche Zerebrospinalflüssigkeit über das Gehirn waschen das Gehirn.
  5. Entfernen Sie einen 2 mm koronalen Abschnitt des Gehirns von Bregma 0 bis Bregma -2. Setzen Sie den Frontalschnitt auf einen konkaven Glasobjektträger, die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit mit dem 0 Bregma (die meisten Hirn Teil des Abschnitts) nach oben zeigt. Abdeckung vorsichtig das Gehirn slEis mit einem Deckglas.
    Hinweis: Vermeiden Sie Druck auf die Glas einmal auf das Gehirn Abschnitt gelegt, da dies die Gefäßarchitektur verformen.
  6. Die Objektträger in dem Mikroskoptisch und legen Sie eine kleine Menge von 0,9% Salzlösung auf das Deckglas. Senken das Mikroskopobjektiv, bis es in Kontakt mit der Salzlösung kommt. Suchen Sie die Mittellinie des Gehirns mit Hilfe der Hellfeld Ziel.
  7. Beginnen Zwei-Photonen-Imaging und suchen Sie die Mittellinie wieder mit dem 25x Ziel. Erreichen dies durch die Suche nach der Längsfissur an der kortikalen Oberfläche des Frontalschnitt. Setzen Sie den rechten Rand des Abbildungsschirm auf der Mittellinie und bewegen Sie den Viewer-Bildschirm über seitlich drei komplette Frames (etwa 1,5 mm von der Mittellinie).
    Man beachte, dass in diesen Experimenten identisch mit denen in der Anmerkung zu Schritt 5.2 wurden die Bildaufnahmeparameter.
  8. Suchen Sie die Tiefe, in der Kapillaren auf dem Sichtschirm kaum sichtbar. Senken Sie die Fokusebene eine zusätzliche 20& mgr; m, um die Spitze der z-Stapel zu bestimmen.
  9. Stellen Sie die Bilddicke bis 1 um. Senken Sie den Blick auf Bildschirm 100 um und passen Laserleistung im ganzen, so dass weniger als 1% der Pixel übersättigt sind.
    Hinweis: Die Z-Stapel-Bilder werden aus einer Reihe von 100 aufeinanderfolgenden 500x500x1 um Bilder zusammengestellt. Je größer der Z-Stapel desto genauer die Nachbearbeitung Berechnungen wird. Im Allgemeinen versuchen, einen z-Stapel 100 um oder mehr zu sammeln.
  10. Drücken Sie auf das Symbol XY Wiederholen gefolgt von der benachbarten XY-Symbol. Sobald die Z-Stapel abgeschlossen ist, drücken Sie die Serie Fertig Symbol und speichern Sie die Datei.

7. Datenverarbeitung

  1. Öffnen Sie ein in-vivo-Bild Kapillare im ImageJ Software. Die Pixel zu Abstandsverhältnis auf Basis der Zwei-Photonen-Software erhaltenen Werte manuell einstellen.
    1. Wählen Sie die * gerade * Symbol aus dem Menü Werkzeuge. Zeichnen Sie eine Linie, die sich von einer Kapillarwand auf die oppoWebsite Kapillarwand, und notieren Sie die Länge von ImageJ vorgesehen.
      Man beachte, daß es notwendig sein kann, um in dem Bild, um die Kanten der Kapillarwände anschaulich machen zoomen.
    2. Wiederholen Sie Schritt 7.1.1 an verschiedenen Stellen entlang der Kapillare sowie für mehrere Kapillaren in dem Bild.
  2. Öffnen Sie die Datei z-Stapel in die Analysesoftware wie Amira. Wählen Sie das Filament Editor-Symbol aus der Unterdrucktastenleiste
    1. Gesetzt den Betrachter Dicke auf etwa 20 zu bewegen, um den Betrachter entweder oben oder unten in der z-Stack.
    2. Wählen Sie das Trace-Symbol und bewegen Sie den Cursor über das geladene Bild. Platz Knoten auf den Kapillaren an den in 2C beschriebenen Standorten; Segmente werden automatisch zwischen benachbarten Knoten angezeigt. Spuren Kapillaren während des gesamten Z-Stapel.
      Hinweis: es wird notwendig sein, um Knoten zwischen Endpunkten und Verzweigungspunkten, um die Kapillaren thr Spuren platzierenoughout der Z-Stapel.
    3. Um diese Knoten zu entfernen, klicken Sie auf Entfernen Zwischensymbol.
      Hinweis: Dies kann eine fehlerhafte geschleift Segmente, die manuell durch Auswahl der Schleife mit dem Buchen Einzelsymbol, und wählen Sie den Remove Selected Symbol entfernt werden müssen, zu erstellen. Wenn Schleifen weiterhin während der Ablaufverfolgung in der Umgebung angezeigt werden, ist es wahrscheinlich, dass die Knoten wurden auf verschiedenen Kapillaren platziert.
    4. Sobald die Rückverfolgung abgeschlossen ist, wählen Sie das Symbol Graph Info, eine Tabellenkalkulation, die automatisch extrahierten Gefäßparameter enthält, zu öffnen. Die Anzahl der Knoten und Segmente sind auf der Hauptansicht Bildschirm zur Verfügung.

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Representative Results

Die Dünn Schädel kortikalen Fenster können für die in vivo Zwei-Photonen-Imaging von kortikalen Kapillaren (Abbildung 1). Ein geeigneter Bereich für Bild zeigt zahlreiche, unterschiedliche Kapillaren (Abbildung 1A). Im gleichen Blickfeld gibt es keine arteriellen Zellwand Autofluoreszenz, und es kann weitere Fluoreszenzsignale, wie Kollagen Fluoreszenz, durch Erzeugung der zweiten Harmonischen 11 (1B) induziert werden.

Sobald die Vorbereitung der Hirnschnitt abgeschlossen ist, wird ein Abbildungsbereich etwa 1,5 mm von der Mittellinie liegt (Abbildung 2A). A 100 um Z-Stapel erzeugt einen für die Analyse im Amira Analysesoftware (2B) verwendet, dreidimensionales Bild. Kapillarnetz wird dann manuell durch Anordnen Knoten am Anfang und am Ende einer Kapillare, oder an Orten, wo eine Kapillare b zurückzuführenFarmen in eine andere (Abbildung 2C). Dies erzeugt eine vollständig skelettierten Bild aus dem morphologische Parameter werden automatisch extrahiert (2D). Die Anzahl der Kapillare Knoten, Segmente mittleren Segmentlänge, Gesamtsegmentlänge und Gesamt Kapillarvolumen kann mit Zweiphotonen-ex-vivo-Abbildung von Mausgehirnschnitte extrahiert werden (Abbildung 2).

Abbildung 3 zeigt mit der hier vorgestellten Verfahren erhaltene repräsentative Ergebnisse. In diesem Experiment wurde ein transgenes Mausmodell für HIV neuroinflammation 10 eingesetzt. Die Produktion des HIV virotoxin Tat wurde in Tat + Mäusen durch Doxycyclin-infundiert Essen für 12 Wochen induziert. Die Kontrollgruppe bestand aus tat- Wurf gefüttert das gleiche Essen. Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen Tat + und TAT-Mäuse in jeder der Kapillare Parametern. So Exposition des Gehirns 12 Wochen 'tisklagen, um HIV-1-Tat ist unzureichend, um Verdünnung des Gehirns microvasculature verursachen. Im Gegensatz dazu unsere zuvor veröffentlichten Daten zeigen, dass mehr verlängert (20 Wochen) chronische ZNS-Expression von Tat führt Verdünnung der zerebralen Gefäß 7. Somit sind die hier gezeigten Daten (Figur 3) liefert wertvolle Informationen in Bezug auf die Kinetik der Tat-induzierte vaskuläre Umgestaltung im ZNS von Mäusen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Erwerb kortikaler Kapillardurchmesser. (A) Im Anschluss an eine Thin-Schädel kortikalen Fenster Vorbereitung und intravenöse fluoreszierenden Farbstoff Injektion wurde Zwei-Photonen-Mikroskopie, um Bild zerebrale Gefäßsystem verwendet. In unseren Experimenten verwendeten wir ein Dextran mit einem rot emittierenden Rhodamin-Farbstoff, der bei 780 nm angeregt wurde, konjugiert, und die Fluoreszenz wurde durch ein Bandpassemissionsfilter 607/36 visualisiert. 11 angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Figur 2. Erzeugung von skelettierten Kapillarnetzwerken. (A) Die Mäuse wurden intravenös mit einem fluoreszierenden Farbstoff eingespritzt und geopfert. Eine 2 mm koronalen Abschnitt des Gehirns wurde zwischen Bregma 0 und Bregma -2 genommen und Bildgebung wurde an der 0 Bregma etwa 1,5 mm von der Mittellinie durchgeführt. EIN repräsentatives Bild des kortikalen Lage zur Bildgebung (black box), ausgewählt aus einer C57BL / 6-Maus, gezeigt. Diese Region, die somatosensory Cortex, wurde gewählt, weil wir haben bereits gezeigt, dass die Fehlregulation des zerebralen Blut kann an dieser Stelle in Tat + Mäusen 12 auf. (B) Representational drei Z-Stapel-Bildern von Kapillarnetzwerke dimensional. (C) Schematische Darstellung des Verfahrens verwendet werden, um manuell verfolgen Kapillaren während des Schiffes Quantifizierung. (D) Repräsentatives Bild image skelettiert Z-Stapel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur in TAT-Mäuse im Vergleich zu Mäusen, die den Kandidaten HIV virotoxin Tat fo ausgesetztr 12 Wochen. Die Mäuse mit einem Doxycyclin (DOX) induzierbaren HIV-1-Tat-Transgens durch astrozytenspezifischer gliafibrilläres Protein (GFAP) -Promotor (HIV Tat-Tg-Mäusen) angetrieben wurden verwendet, um die Wirkung der HIV-1-induzierte Neuroentzündung zu untersuchen zerebrale Gefäßstruktur, wie beschrieben 7. Diese Mäuse (Tat +, n = 3) wurden zu einer chronischen (12 Wochen) Therapie von Tat Induktion ausgesetzt (dh., 12 Wochen DOX). TAT-Mäuse (n = 4) wurden als bei gleichaltrigen Kontrollen verwendet (diese Mäuse entsprechen nicht-transgenen Wurfgeschwistern der Tat + Mäusen und daher nicht exprimieren HIV-1 Tat). Wie die Tat + Mäusen erhielten die tat- Mäusen auch 12 Wochen der DOX Exposition. In den Mäusen zu Tat für 12 Wochen (Tat +) ausgesetzt ist, im Vergleich zu denen nicht tat ​​(TAT-) ausgesetzt ist, gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Anzahl der Knoten (A), die Anzahl der Segmente (B), die mittlere Segmentlänge (C), oder Gesamt Kapillarlänge (D), Kapillardurchmesser (fürdie Tat + Mäusen untersuchten wir 14 Kapillaren in 6 Abbildungsbereichen; für tat- Mäuse analysierten wir 7 Kapillaren in 4 Bereichen Bildgebung) (E), oder Gesamt Kapillarvolumen (F). Da die Daten nicht normalverteilt sind (wie von der Shapiro-Wilk-Test bestimmt wird), wurde die genaue Wilcoxon-Rangsummentest verwendet werden, um die statistische Signifikanz (in diesem Fall als p <0,05 festgelegt). Berechnen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Das hier beschriebene Verfahren kann angewendet werden, um Gehirn mikrovaskulären Strukturen in einer breiten Palette von experimentellen Modellen / Einstellungen zu analysieren. Für den Erfolg dieser Methode müssen drei wichtige Schritte gemeistert werden. Erstens muss die dünne Schädelfenster den Schädel oder die zugrunde liegenden Hirn nicht beschädigen. Es ist leicht, den Schädel während der Ausdünnung zu durchstechen oder zu einem Hitze induzierte Gefäßdurchlässigkeit. Dies kann mit einer Abbildungs ​​stört, wenn der Fluoreszenzfarbstoff in die Fokusebene auslaufen und verdunkeln die Kapillaren. Wenn der Schädel häufig während des Dünn Schädel Vorbereitung bricht, wird sie höchstwahrscheinlich durch zu großen Druck nach unten verursacht. Halten Sie die Microtorque Bohrer so nah wie möglich an den Grat ermöglicht eine größere haptische Kontrolle, die den Druck auf den Schädel zu verringern wird.

Zweitens sollte arterielle Katheterisierung so schnell wie möglich, nachdem die Arterie geschnitten worden auftreten. Bei Nichtbeachtung der Katheter schnell einfügen können übermäßigen Blutverlust, die comp verursachtromise die physiologische Unversehrtheit der Maus. Schwierigkeiten beim Einsetzen des Katheters ist in der Regel wegen der relativ großen Abmessungen des Katheters gegenüber dem Oberschenkelarterie. Es kann notwendig sein, um den Katheter, um seinen Durchmesser zu reduzieren dehnen. Darüber hinaus können die Spitzen der # 5 Zange benutzt, um zu packen und das Bild der Öffnung in der Arterie in der Platzierung des Katheters zu erleichtern gemacht werden.

Drittens sollte die Dauer der in vivo chirurgischen Verfahren minimiert werden, so dass das Urethan-Narkose kann so schnell wie möglich verabreicht werden. Die Isofluran-Narkose kann Vasodilatation zerebraler Blutgefäße 13 verursachen, wodurch Schrägstellen der Kapillardurchmesser Daten.

Es sei anerkannt, dass die Amira Analysesoftware kann automatisch die Radien der Hand zurückverfolgt Gefäße zu extrahieren; jedoch, wenn Sie diese Funktion verwenden, um Z-Stapel-Bilder von ex vivo Gehirn zu analysieren, ist der Wert ungenau. Dies liegt daran, after Entfernung des Gehirns sind die zerebralen Kapillaren nicht mehr unter Druck und kann morphologisch verzerrt werden. Die in vivo Kapillardurchmesser Mess umgeht dieses Problem, da die Kapillaren unter normalen physiologischen Bedingungen unter Druck gesetzt.

Es muss auch beachtet werden, dass dieses Verfahren nicht ohne Einschränkungen. Zunächst wird eine umfassende Ausbildung erforderlich, um die in-vivo-Bildgebung Vorbereitung zu meistern. Ein Forscher muss lernen, zwei technisch anspruchsvolle Techniken (dünne Schädel kortikalen Fenster und arterielle Katheterisierung) effizient durchzuführen; Ein Fehler in beiden Verfahren kann das Experiment beeinträchtigen und zum Verlust der Daten. Zweitens ist die Analyse der Ex-vivo-Z-Stapel zeitintensiv. Die Skelettierung eines Bildes z-Stack kann bis zu 2,5 Stunden dauern. Außerdem ist es ratsam, dass diese Analyse von einem erfahrenen Forscher abgeschlossen werden, um die Konsistenz der Skelettierung Verfahren (die in liebevoller Hand tr beinhaltet sicherzustellen,acing der Blutgefäße).

Sobald alle Aspekte dieses Protokoll beherrscht werden, die erhaltenen Daten eine tiefer gehende und physiologisch genaue Quantifizierung der Gefäßparameter im Vergleich zu anderen traditionell verwendeten Methoden, die Kapillardichte als Kapillaren pro Volumeneinheit, oder Kapillaren pro Sichtfeld zu zeigen. Die in vivo-Bildgebungsverfahren ermöglicht die Untersuchung von anderen Parametern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, der Erythrozytengeschwindigkeit Arteriole Dilatation und roten Blutkörperchen Fluss 7,12 beschränkt, die auch in der Lage, in Langzeitstudien untersucht werden könnte. Darüber hinaus kann es leicht angepaßt und modifiziert, um Forschungsfragen Gehirn mikrovaskulären Struktur bezogen untersuchen. Solche Studien könnten Quantifizieren pathogene Veränderungen der Kapillare Morphologie in anderen neurokognitiven Krankheiten, oder Messaltersbedingten Veränderungen in Kapillardichte. Daher ist die hier vorgestellte Methode ein vielseitiges und leistungsfähiges Werkzeug für die quantitative Analyse der Hirnblutgefäße Architektur.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica Microscope Leica Inc. MZ8
High Intensity Illuminator Dolan-Jenner 180
Heating Pad Stryker  TP3E
T/PUMP Gaymar Industries, Inc. TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer Datex Ohmeda 447
Artificial Tear Gel Butler AHS 7312
Povidone-Iodine solution  Aplicare 52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Dumot #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
Ferric Chloride Solution Ricca Chemical Company 3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel Henkel 45404
Dental Cement Stoelting 51459
Microtoruqe II Handpiece Kit Pearson Dental R14-0002
005 Burr for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
Norland Blade (Dental Microblade) Salvin Dental 6900
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Group 2B Carcinogen
Braided Suture Ethicon 735G
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
 Arterial Catheter SAI Infusion Technologies MAC-01 The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. 
Blood Pressure Moniter World Precision Intruments SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable World Precision Intruments BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer  Siemens  248
40 μl Capillary Tube VWR 15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) Invitrogen D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope Olypmus FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser Spectra-Physics
ImageJ Software National Institutes of Health (NIH) Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software Visage Imaging 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64, (1), 133-145 (2009).
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