Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

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Neuroscience

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Nishimura, C., Polesskaya, O., Dewhurst, S., Silva, J. N. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (107), e53582, doi:10.3791/53582 (2016).

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Abstract

Introduction

Virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) invade il cervello durante la fase acuta di infezione da virus, e infetta produttivo sia microglia e macrofagi residenti del cervello, portando a loro attivazione - e il rilascio di entrambi mediatori dell'infiammazione ospitanti di derivazione e l'HIV-1 solubile virotoxins come la Tat e gp120 (rivisto in 1,2). Di conseguenza, uno stato cronico neuroinflammatory si stabilisce nel SNC, che è pensato per contribuire alla patogenesi di HIV-1 disturbi associati neurocognitivi (mano) 3-5.

Sovraespressione cronica di HIV-1 Tat o interleuchina (IL) -17A nel SNC di topi ha mostrato di provocare microvascolare rarefazione 6,7. Ciò solleva la possibilità che neuroinfiammazione cronica può contribuire alla patogenesi di mano attraverso effetti sul sistema vascolare cerebrale. Al fine di esaminare ulteriormente la questione, abbiamo sviluppato metodi per quantificare strut vascolari cerebraliture.

Questo documento descrive un metodo per quantificare il numero di nodi capillari, segmenti capillari, significa la lunghezza del segmento, la lunghezza totale del segmento, diametro medio capillare, e il volume totale capillare usando immagini in vivo di reti capillari attraverso una finestra corticale sottile cranio (modificato da precedentemente descritta protocolli) 8,9, nonché ex vivo imaging sezioni cerebrali, utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo approccio combinato prevede una quantificazione olistica parametri vascolari cerebrali, poiché il sottile cranio finestra corticale in vivo permette la preservazione dell'ambiente cerebrale, mentre ex vivo imaging reti capillari in fettine di cervello permette la ricostruzione di completo, tridimensionale reti capillari - che possono poi essere quantificati utilizzando il software disponibile in commercio.

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Protocol

L'Università del comitato dell'Università di Rochester per le risorse animali ha approvato tutte le procedure eseguite in questo documento.

Preparazione 1. Pre-chirurgico (e mouse)

  1. Preparare l'area chirurgica con tutte le attrezzature necessarie. Sterilizzare tutti gli utensili impiegati durante la procedura di anticipo utilizzando 70% di etanolo. Facoltativamente, utilizzare uno sterilizzatore vetro tallone o in autoclave per sterilizzare gli strumenti.
  2. Posizionare il mouse in una camera di induzione isoflurano collegato ad un vaporizzatore isoflurano. Impostare i livelli isoflurano al 4% ad una velocità di 1 L / min.
    Nota: per gli esperimenti qui riportati, i topi con doxiciclina (DOX) inducibile di HIV-1 Tat transgene guidato dalla proteina gliale fibrillare specifici astrociti (GFAP) promotore (HIV Tat-Tg topi) 10 sono stati utilizzati per esaminare l'effetto del virus HIV -1 neuroinfiammazione sulla struttura vascolare cerebrale indotta, come precedentemente descritto 7,10.
  3. Punta delicatamente la camera di induzione di osservare il mouse &# 39; s riflesso di raddrizzamento. Una volta che il riflesso di raddrizzamento è stata soppressa, impostare il livello di isoflurano al 2% e reindirizzare il flusso d'aria dalla camera di induzione al cono al banco chirurgica.
  4. Spostare rapidamente il mouse dalla camera di induzione al pad riscaldamento dell'acqua infuso. Continuare ad applicare isoflurano (1,5-2%) attraverso il cono. Regolare l'anestesia secondo tolleranza individuale del mouse valutata attraverso la frequenza respiratoria (RR) di monitoraggio.
    Nota: La depressione di RR può perturbare parametri fisiologici gas che alterano il flusso sanguigno cerebrale e valutazione diametro del vaso. Tentativo di mantenere RR tra 55-65 respiri al minuto. Frequenza cardiaca (HR) può anche essere usato valutare la profondità dell'anestesia; mantenere HR tra 300-450 battiti al minuto per evitare cambiamenti fisiologici al diametro del vaso. Tipicamente, anestesia sarà adeguato tra 1,5-2,0% isoflurano a 1 L / min per un dato mouse.
  5. Eseguire un pizzico piedi per verificare ulteriormente la profondità dell'anestesia. Se il mouse non risponde, commENCE le procedure chirurgiche.

2. Preparazione del sottile cranio cranici Finestra

  1. Applicare gel lacrima artificiale agli occhi del mouse. Rimuovere completamente i capelli dal cuoio capelluto del mouse con le forbici o un rasoio elettrico.
  2. Sterilizzare il cuoio capelluto mediante l'applicazione di una soluzione di iodio-povidone; lasciare asciugare. Poi, sotto un microscopio ottico, togliere la pelle dal cuoio capelluto del mouse, esponendo completamente le ossa parietali, ossa frontali caudale, e marcatura Bregma.
  3. Applicare una piccola quantità di una soluzione di cloruro ferrico 10% al cranio per asciugare le membrane per una facile rimozione. Rimuovere le membrane secche con la # 5/45 forcipe raschiando delicatamente il cranio.
  4. Applicare un sottile strato di colla intorno alla finestra piastra di testa. Premere delicatamente la piastra di testa contro il cranio del mouse, mantenendo la zona di interesse del centro della finestra. Applicare una goccia di cemento dentale per la piastra di testa di polimerizzare la colla.
  5. Applicare uno strato sottiledi colla lungo il bordo della finestra piastra di testa per creare un serbatoio in cui tenere salina. Una volta che la colla si è asciugata, avvitare il piastra di testa nel cablaggio del mouse piastra di testa.
    Nota: il cablaggio del mouse piastra di testa utilizzato in questa procedura è una struttura con una base di metallo e due colonne di metallo. Su ogni colonna c'è una molla e un galletto. La piastra di testa è posto sulla sommità della molla, e il dado ad alette viene stretto finché la testa sia in piano e non si muove.
  6. Rimuovere la colla dalla finestra piastra di testa con una punta attaccato ad un trapano MicroTorque impostato a 6.000 giri. Fermare ogni 10-15 secondi per evitare il surriscaldamento del mouse del cranio che può provocare danni strutturali alle navi.
    1. Utilizzando una nuova punta, posizionare il MicroTorque fresa 1.5 mm lateralmente da linea mediana (un terzo del diametro della finestra piastra di testa). Inizia a sottile cranio nei dintorni a 4,000 rpm. Spostare il trapano delicatamente attraverso il cranio senza pressione diretta verso il basso.
    2. Cease drilling ogni 10-15 secondi per evitare il surriscaldamento del cranio del mouse. Durante questo tempo, rimuovere la polvere accumulata cranio utilizzando una bomboletta di aria compressa.
    3. Utilizzare gocce di soluzione salina RT raffreddare cranio per 5-10 secondi. Rimuovere delicatamente tutto il liquido con un panno morbido per continuare cranio diradamento.
  7. Per l'assottigliamento finale del cranio, posizionare un piccolo volume di soluzione salina nel serbatoio piastra di testa e leggermente spazzare un microlama dentale sull'area di interesse finché piccoli vasi sono chiaramente visibili.

3. Il monitoraggio dei parametri fisiologici

  1. Una volta che il cranio è completamente diluito, scollegare il mouse dal supporto e posizionarlo sul dorso. Nastro delicatamente verso il basso entrambe le zampe posteriori per esporre chiaramente le cosce mediale.
  2. Rimuovere i capelli su entrambe le cosce mediale con le forbici o un rasoio elettrico. Disinfettare il sito chirurgico coprendo le cosce con iodopovidone.
  3. Pizzicare la pelle sulla coscia mediale proprio sopra la vena femoralee l'arteria con la # 5 pinze. Tirare delicatamente la pelle verso l'alto e usare le forbici per tagliare e rimuovere la pelle.
    Nota: la coscia sinistra è riservata nel caso di complicanze chirurgiche (anomalie vascolari, vasi rotti).
  4. Applicare circa 3-5 gocce di soluzione fisiologica 0,9% al sito chirurgico. Questo consente una maggiore ingrandimento di navi, oltre a mantenere il sito idratata e prevenire l'essiccazione dei vasi. Separare la vena femorale da arteria da dissezione senza mezzi termini nel fascio neurovascolare femorale utilizzando due # 5/45 pinze.
  5. Inserire due, 3 pezzi cm di sutura chirurgica sotto l'arteria femorale circa 1 cm di distanza. Ruotare la parte superiore in senso orario di sutura per creare un laccio vascolare che contribuirà a prevenire un'eccessiva perdita di sangue durante il cateterismo.
  6. Fai una piccola incisione nell'arteria femorale utilizzando le forbici primavera. Posizionare il catetere nell'arteria attraverso l'incisione e avanzare fino a quando il catetere è saldamente all'interno dell'arteria.
  7. Iniettare 10 ml di eparina (100 UI / ml) attraverso il catetere per prevenire la coagulazione del sangue. Poi, chirurgicamente chiudere la coscia destra cucendo insieme la pelle con un 4-0 di sutura in un semplice schema interrotto.
  8. Iniettare 50 ml di uretano (1,2 mg / g) per via intraperitoneale nel quadrante in basso a destra. Cinque minuti dopo ripetere con un'altra iniezione 50 microlitri al quadrante inferiore sinistro per un totale di 100 ml di uretano intraperitoneale. Ridurre lentamente i livelli isoflurano a circa il 0,25%, mentre in concomitanza ricontrollare il mouse per la profondità dell'anestesia.
    Nota: Mantenere l'ago superficiali all'interno della cavità peritoneale lungo la parete addominale posteriore in modo da non perforare l'intestino. Questo può essere ottenuto pizzicando rectus mu addominalescles lontano dai visceri e poi iniettare.
  9. Utilizzando un tubo capillare, raccogliere un campione di 40 ml di sangue arterioso dal catetere. Fissare il catetere al trasduttore di pressione sanguigna, dotata di rubinetto a quattro vie soluzione salina e la siringa eparina-riempita.
  10. Nastro il trasduttore di pressione sanguigna con gli apparecchi chirurgici per impedire la rimozione involontaria del catetere. Avviare il monitoraggio della pressione arteriosa media.
  11. Inserire il tubo capillare riempito di sangue in una porta di entrata analizzatore di gas di sangue. Una volta che tutto il sangue è stato estratto, rimuovere il tubo capillare dalla porta di entrata. I livelli di gas nel sangue 2 O 2 e CO apparirà su una carta stampata dal analizzatore di gas di sangue.

4. L'iniezione del colorante fluorescente

  1. Pizzicare la pelle sulla coscia sinistra mediale utilizzando la # 5 pinze. Tirare delicatamente la pelle verso l'alto e usare le forbici per tagliare e rimuovere la pelle. Preparare destrano coniugato rosso che emette rhodamine tintura(70 kDa) (10 mg / kg disciolto in soluzione fisiologica).
  2. Individuare femorale vein.Using una siringa da 1 ml con un ago da 30 G allegata, disegnare una soluzione precedentemente preparata di un colorante fluorescente appropriata per l'imaging alla linea 130 microlitri della siringa. Rimuovere tutte le bolle d'aria disegnando il colorante completamente nella siringa e fermamente muovendo il muro siringa.
    1. Piegare il 30 ago G con un angolo di circa 30 gradi, premendo contro una superficie dura lato smusso up. Riempire l'ago con il colorante ed eliminare il liquido in eccesso, lasciando un campione di 100 microlitri.
  3. Iniettare il campione di 100 ml di colorante lentamente nella vena femorale. Dopo aver rimosso l'ago, applicare costante, delicatamente pressione sul sito di iniezione per fermare le emorragie. Lasciare il colorante circolare per 5 min.
    Nota: in alternativa, la vena femorale destra può essere utilizzato invece per l'iniezione colorante fluorescente per impedire ulteriore perdita di sangue attraverso la creazione di un altro sito chirurgico. Inoltre, se laanimale sta sanguinando incontrollabile dal sito chirurgico, potrebbe essere un'indicazione che troppo eparina è stato dato per irrigare il catetere. Se non c'è coagulazione entro 10-15 minuti e il mouse è ancora sanguinando, considerare riavviare l'esperimento con un nuovo mouse.
  4. Chiudere la coscia sinistra cucendo insieme la pelle con un 4-0 di sutura, poi capovolgere con attenzione il mouse sul suo stomaco, e inserirla nel cablaggio del mouse piastra di testa.

5. In Vivo a due Photon Imaging

  1. Spostare l'apparato chirurgico al microscopio a due fotoni, avendo cura di mantenere i livelli di anestesia continui. Mettere una piccola quantità di soluzione salina allo 0,9% nel serbatoio piastra di testa e abbassare l'obiettivo microscopio in modo che viene a contatto con la soluzione salina. Individuare l'area di interesse con l'obiettivo a campo chiaro visualizzazione
  2. Posizionare il laser di eccitazione a due fotoni ad una lunghezza d'onda appropriata per il colorante fluorescente. Iniziare due fotoni di imaging utilizzando il 25x oOBIETTIVO.
    Si noti che in questi esperimenti abbiamo usato un destrano coniugato al rosso emettono rodamina colorante che è stato eccitato alla lunghezza d'onda di 780 nm. Una 607/36 banda passante del filtro di emissione per rilevare la fluorescenza della tintura, e una banda passante del filtro di emissione 480/20 è stato utilizzato per rilevare autofluorescenza arteriosa
  3. Individuare una capillare letto sulla schermata di visualizzazione, e ingrandire l'area utilizzando ottiche zoom 2. Immagini Acquisire dei capillari con il software di imaging a due fotoni.
  4. Dopo l'imaging è completo, sacrifica il mouse per dislocazione cervicale seguita da decapitazione.

6. Ex Vivo a due Photon Imaging

  1. Utilizzando le forbici finissimi, fare un'incisione nel cuoio capelluto dalle ossa interparietale alle ossa frontali del mouse. Fissare la pelle ai lati del cranio con il dito indice e il pollice.
  2. Posizionare le forbici in più sottili sotto l'osso interparietale mediale e tagliare il cranio lungo la sutura sagittale. Fermare il taglio del cranio circa 3 mm dopo aver segnato il bregma.
    Nota: Applicare una pressione verso l'alto quando il taglio del cranio, per evitare che il taglio del cervello.
  3. Usando i # 5 pinze, separare il cranio dal cervello e rimuovere accuratamente eventuali meningi dalla superficie del cervello. Meningi rimanenti possono accidentalmente lacerare il cervello; estrema cura dovrebbe essere presa per evitare questo. Far scorrere delicatamente la # 5 pinze sotto il cervello avanza lentamente in avanti fino a quando il cervello è privo di cranio.
    Nota: che la pressione verso il basso deve essere usato per evitare la puntura del cervello.
  4. Posizionare il cervello in uno strumento cerebrale sezionamento specifico per i topi. Lavare il cervello mediante l'applicazione di gocce di liquido cerebrospinale artificiale nel cervello.
  5. Rimuovere una sezione coronale 2 millimetri di cervello da bregma 0 a bregma -2. Posizionare la sezione coronale su un vetrino concava contenente liquido cerebrospinale artificiale con il bregma 0 (la maggior parte craniale della sezione) rivolto verso l'alto. Coprire delicatamente il cervello slghiaccio con una scivolata copertura in vetro.
    Nota: Evitare di premere il vetro una volta posizionati sulla parte del cervello in quanto ciò potrebbe deformare l'architettura vascolare.
  6. Trasferire il vetrino al palco microscopio e mettere una piccola quantità di soluzione fisiologica 0,9% sul vetrino. Abbassare l'obiettivo microscopio fino al perfetto contatto con la soluzione salina. Individuare la linea mediana del cervello con l'obiettivo campo chiaro.
  7. Iniziare l'imaging a due fotoni e individuare la linea mediana di nuovo con l'obiettivo 25x. Ottenere questo cercando la fessura longitudinale sulla superficie corticale della sezione coronale. Posizionare il bordo destro dello schermo per immagini sulla linea mediana e spostare lo schermo visualizzatore sopra lateralmente tre fotogrammi completi (circa 1,5 mm dalla linea mediana).
    Si noti che in questi esperimenti, i parametri di imaging erano identici a quelli indicati nella nota al punto 5.2.
  8. Individuare la profondità alla quale i capillari sono appena visibili sullo schermo vista. Abbassare il piano di messa a fuoco un ulteriore 20micron per determinare all'inizio della z-stack.
  9. Impostare lo spessore di 1 micron immagine. Abbassare la schermata di visualizzazione per 100 micron e regolare la potenza del laser durante tale che meno dell'1% dei pixel sono troppo saturi.
    Nota: le immagini z-stack sono compilati da una serie di 100 immagini consecutive 500x500x1 micron. Maggiore è lo z-stack più accurati calcoli di post processing sarà. Generalmente, tentare di raccogliere un z-stack di 100 micron o maggiore.
  10. Premere l'icona XY Ripeti seguita dall'icona XY adiacente. Una volta che lo z-stack è completo, premere l'icona della serie Fine e salvare il file.

7. Elaborazione Dati

  1. Aprire un vivo un'immagine capillare nel software ImageJ. Impostare manualmente il pixel rapporto distanza in base ai valori ottenuti dal software due fotoni.
    1. Selezionare l'icona del * * direttamente dal menu Strumenti. Tracciare una linea che si estende da una parete capillare al oppoparete capillare del sito, e registrare la lunghezza fornita da ImageJ.
      Si noti che può essere necessario per ingrandire l'immagine in modo da visualizzare chiaramente i bordi delle pareti dei capillari.
    2. Ripetere passaggio 7.1.1 in diverse posizioni lungo il capillare, così come per più capillari nell'immagine.
  2. Aprire il file z-stack nel software analitico come Amira. Selezionare l'icona filamento Editor dalla barra degli strumenti sotto-applicazione
    1. Impostare lo spessore spettatore a circa 20. Spostare lo spettatore a parte superiore o inferiore della z-stack.
    2. Selezionare l'icona Traccia e spostare il cursore sopra l'immagine caricata. Nodi immettere sul capillari nelle posizioni descritte nella figura 2C; segmenti appariranno automaticamente tra i nodi adiacenti. Tracciare capillari durante l'intero z-stack.
      Nota: sarà necessario inserire nodi tra i punti finali e punti di ramificazione per rintracciare i capillari thrOughout lo z-stack.
    3. Per rimuovere questi nodi, fare clic sull'icona Intermedio Rimuovi.
      Nota: Questo può creare segmenti erronee in loop che devono essere rimossi manualmente selezionando il ciclo utilizzando l'icona Seleziona unico, e quindi selezionando l'icona Elimina selezionati. Se loop continuano ad apparire nella stessa zona durante il tracciamento, è probabile che i nodi sono stati posti su diversi capillari.
    4. Una volta che il tracciato è completo, selezionare l'icona del grafico Info per aprire un foglio elettronico contenente i parametri vascolari estratti automaticamente. Il numero di nodi e segmenti sono disponibili nella schermata vista principale.

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Representative Results

La finestra corticale sottile cranio permette in vivo due fotoni imaging capillari corticali (Figura 1). Una zona adatta per l'immagine mostra numerosi, capillari distinti (Figura 1A). Nello stesso campo di vista, non c'è arteriosa autofluorescenza parete cellulare, e ci possono essere altri segnali fluorescenti, quali il collagene, la fluorescenza indotte da generazione di seconda armonica 11 (Figura 1B).

Dopo la preparazione della fetta cervello è completa, un area di esposizione di circa 1,5 millimetri dalla linea mediana si trova (Figura 2A). A 100 micron z-stack produce un'immagine tridimensionale utilizzato per l'analisi nel software analitico Amira (Figura 2B). La rete capillare viene quindi tracciata manualmente inserendo nodi all'inizio e alla fine di un capillare, o in qualsiasi luogo in cui uno capillare branch in un altro (Figura 2C). Ciò produce un'immagine completamente skeletonized da cui vengono estratti i parametri morfologici automaticamente (Figura 2D). Il numero di nodi capillari, segmenti, lunghezza media del segmento, lunghezza totale del segmento, e il volume totale capillare può essere estratto utilizzando due fotoni ex vivo imaging fettine cerebrali mouse (Figura 2).

Figura 3 mostra i risultati rappresentativi ottenuti con il metodo presentato in questo documento. In questo esperimento, un modello di topo transgenico di neuroinfiammazione HIV è stato usato 10. La produzione del virus HIV virotoxin Tat è stata indotta a Tat + topi dal cibo doxiciclina infuso per 12 settimane. Il gruppo di controllo era costituito da littermates tat- alimentato lo stesso cibo. Non c'era differenza statisticamente significativa tra Tat + e topi tat- in uno qualsiasi dei parametri misurati capillari. Pertanto, l'esposizione di 12 settimane di cervello tiscausa di HIV-1 Tat non è sufficiente a provocare la rarefazione del microcircolo cerebrale. Al contrario, i nostri dati precedentemente pubblicati mostrano che più prolungata (20 settimane) espressione cronica del sistema nervoso centrale dei risultati Tat in rarefazione vasi cerebrali 7. Pertanto, i dati riportati qui (Figura 3) fornisce preziose nuove informazioni per quanto riguarda la cinetica del rimodellamento vascolare Tat-indotta all'interno del sistema nervoso centrale di topi.

Figura 1
Figura 1. Acquisizione di diametro capillare corticale. (A) A seguito di una preparazione finestra corticale sottile cranio e iniezione endovenosa colorante fluorescente, microscopia a due fotoni è stato utilizzato per l'immagine vascolarizzazione cerebrale. Nei nostri esperimenti, abbiamo usato un destrano coniugato con un rosso che emette rodamina colorante che è stato eccitato a 780 nm e la fluorescenza è stata visualizzata attraverso un passa-banda 607/36 filtro per le emissioni. 11. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Generazione di reti capillari scheletrato. (A) i topi sono stati iniettati per via endovenosa con un colorante fluorescente e sacrificato. Una sezione coronale 2 mm di cervello è stato preso tra 0 e bregma bregma -2, e di imaging è stata eseguita al bregma 0 circa 1,5 mm dalla linea mediana. UN viene mostrata un'immagine rappresentativa della posizione scelta per l'imaging corticale (scatola nera) da un C57BL / 6 del mouse. Questa regione, la somcorteccia atosensory, è stata scelta perché abbiamo precedentemente dimostrato che la disregolazione di sangue cerebrale può verificarsi in questo sito in Tat + topi 12. (B) rappresentazionali tre immagini z-stack dimensionali di reti capillari. (C) Schema del metodo utilizzato per tracciare manualmente capillari durante nave quantificazione. (D) immagini Rappresentante immagine z-stack di scheletrato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Quantificazione dell'architettura vascolare cerebrale nel topo tat- contro topi esposti al candidato HIV virotoxin fo Tatr 12 settimane. I topi con una doxiciclina (DOX) inducibile di HIV-1 Tat transgene guidato dalla proteina gliale fibrillare (GFAP) promotore specifico-astrociti (HIV Tat-Tg topi) sono stati usati per esaminare l'effetto dell'infezione da HIV-1 neuroinfiammazione indotta struttura vascolare cerebrale, come descritto 7. Questi topi (Tat +, n = 3) sono stati esposti ad una malattia cronica (12 settimana) regime dell'induzione Tat (es., 12 settimane di DOX). Topi tat- (n = 4) sono stati utilizzati come controlli di pari età (questi topi corrispondono ai fratellini non transgenici dei topi + Tat, e, pertanto, non esprimono HIV-1 Tat). Come i topi Tat +, i topi tat- anche ricevuto 12 settimane di esposizione DOX. Nei topi esposti a Tat per 12 settimane (Tat +), rispetto a quelli non esposti a Tat (tat-), non vi era alcuna differenza statisticamente significativa nel numero di nodi (A), il numero di segmenti (B), durata media del segmento (C), o la lunghezza capillare totale (D), diametro capillare (peri topi Tat +, abbiamo analizzato 14 capillari in 6 aree di imaging; per i topi tat-, abbiamo analizzato 7 capillari in 4 aree di imaging) (E), o il volume totale capillare (F). Dal momento che i dati non sono stati distribuiti normalmente (come determinato dal test di Shapiro-Wilk), il test esatto somma dei ranghi di Wilcoxon è stato utilizzato per calcolare la significatività statistica (determinato in questo caso come P <0,05). Cliccate qui per vedere una versione più grande questa cifra. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il metodo qui descritto può essere applicato per analizzare strutture microvascolari cerebrali in un'ampia gamma di modelli sperimentali / impostazioni. Per il successo di questo metodo, tre passaggi critici devono essere padroneggiato. In primo luogo, la finestra sottile cranio non deve danneggiare il cranio o cerebrale sottostante. E 'facile forare il cranio durante diradamento, o causare perdite di calore indotta vascolare. Questo può interferire con le immagini come il colorante fluorescente colerà nel piano di messa a fuoco e oscurare i capillari. Se il teschio si rompe frequentemente durante la preparazione sottile del cranio, è probabilmente causato da una troppo grande pressione al ribasso. Tenendo il trapano MicroTorque il più vicino possibile alla bava consente un maggiore controllo tattile che si riduce la pressione verso il basso sul cranio.

In secondo luogo, la cateterizzazione arteriosa deve avvenire nel minor tempo possibile dopo l'arteria è stato tagliato. La mancata inserire il catetere in fretta può causare eccessiva perdita di sangue che si compromise l'integrità fisiologica del mouse. Difficoltà inserire il catetere è solitamente dovuto le dimensioni relativamente grandi del catetere rispetto all'arteria femorale. Potrebbe essere necessario allungare il catetere in modo da ridurre il suo diametro. Inoltre, le punte delle # 5 pinze possono essere utilizzate per afferrare e allargare l'apertura fatta nell'arteria per facilitare nel posizionamento del catetere.

In terzo luogo, la durata delle procedure chirurgiche in vivo dovrebbe essere minimizzato in modo che l'anestesia uretano può essere somministrato appena possibile. L'anestesia isoflurano può provocare vasodilatazione dei vasi sanguigni cerebrali 13, inclinazione così i dati di diametro capillare.

Bisogna riconoscere che il software di analisi Amira può estrarre automaticamente i raggi delle navi tracciate a mano; Tuttavia, quando si utilizza questa funzione per analizzare le immagini z-stack da ex vivo il cervello, il valore è imprecisa. Questo perché, after rimuovendo il cervello, i capillari cerebrali non sono più in pressione, e può diventare morfologicamente distorta. La misurazione del diametro capillare in vivo elude questo problema perché i capillari sono posti sotto pressione, condizioni fisiologiche normali.

Si deve anche notare che questo metodo non è senza limitazioni. In primo luogo, la formazione significativo è necessario per padroneggiare il vivo preparazione imaging. Un ricercatore deve imparare a eseguire in modo efficiente due tecniche tecnicamente impegnative (sottile cranio finestra corticale e cateterismo arterioso); un errore in entrambe tecnica può compromettere l'esperimento e invalidare i dati. In secondo luogo, l'analisi delle ex vivo z-stack è ad alta intensità di tempo. L'scheletrizzazione un'immagine z-stack di può durare fino a 2,5 ore. Inoltre, è consigliabile che tale analisi essere completato da un ricercatore esperto per garantire la coerenza del processo di scheletrizzazione (che comporta un'attenta tr manualeacing dei vasi sanguigni).

Una volta che tutti gli aspetti di questo protocollo sono padronanza, i dati ottenuti forniscono un più approfondito e la quantificazione fisiologicamente accurata dei parametri vascolari rispetto ad altri metodi tradizionalmente usati che mostrano densità capillare come capillari per unità di volume, o capillari per campo visivo. La tecnica di imaging in vivo in consente per lo studio di altri parametri tra cui, ma non solo, la velocità di globuli rossi, arteriole dilatazione, e rosso flusso di globuli 7,12, che può anche essere in grado di essere esaminata in studi longitudinali. Inoltre, può essere facilmente adattato e modificato per studiare le questioni di ricerca relative alla struttura del cervello microvascolare. Tali studi potrebbero includere quantificazione cambiamenti patogeni nelle capillare morfologia in altre malattie neurocognitivi, o misurando i cambiamenti legati all'età densità capillare. Pertanto, il metodo presentato in questo documento è un attrezzo versatile e potente per la Quantitätanalisi ive dell'architettura vascolare cerebrale.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leica Microscope Leica Inc. MZ8
High Intensity Illuminator Dolan-Jenner 180
Heating Pad Stryker  TP3E
T/PUMP Gaymar Industries, Inc. TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer Datex Ohmeda 447
Artificial Tear Gel Butler AHS 7312
Povidone-Iodine solution  Aplicare 52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Dumot #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
Ferric Chloride Solution Ricca Chemical Company 3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel Henkel 45404
Dental Cement Stoelting 51459
Microtoruqe II Handpiece Kit Pearson Dental R14-0002
005 Burr for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
Norland Blade (Dental Microblade) Salvin Dental 6900
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Group 2B Carcinogen
Braided Suture Ethicon 735G
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
 Arterial Catheter SAI Infusion Technologies MAC-01 The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. 
Blood Pressure Moniter World Precision Intruments SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable World Precision Intruments BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer  Siemens  248
40 μl Capillary Tube VWR 15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) Invitrogen D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope Olypmus FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser Spectra-Physics
ImageJ Software National Institutes of Health (NIH) Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software Visage Imaging 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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