عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج

1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Benck, C. J., Martinov, T., Fife, B. T., Chatterjea, D. Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation. J. Vis. Exp. (107), e53638, doi:10.3791/53638 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

تم العثور على الأمراض الجلدية التي تتراوح بين التهاب الجلد التماسي، والأكزيما، الصدفية، التهاب النسيج الخلوي، والالتهابات الفطرية وخراجات لسرطانات الجلد غير القتامي لتكون من بين 50 الأمراض الأكثر انتشارا في جميع أنحاء العالم، ورابع السبب الرئيسي العالمي للأمراض غير المميتة في عام 2010 1. وفقا لذلك، والتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء أمراض الجلد المختلفة هي منطقة الضرورية ونشطة للبحث. وكانت نماذج القوارض مفيدة بشكل ملحوظ في فهم الأمراض الجلدية الالتهابية مثل التهاب الجلد التأتبي 3 الصدفية، أو عدوى المكورات العنقودية الذهبية (4). يمكن البروتوكولات غير مكلفة وفعالة وبسيطة لعملية الهضم الأنزيمي من أنسجة الجلد الماوس توفر الاستعدادات من الخلايا التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب من أجل فهم أفضل الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الجلد. هنا، يتم وصف طريقة بسيطة واقتصادية لالأنزيمية ملخص من الجلد الماوسالأنسجة وعزل الجلد الكريات البيض التسلل التي يمكن استخدامها لزراعة الخلايا، في الجسم الحي نقل بالتبني، وتدفق تحليل cytometric والفرز أو دراسات التعبير الجيني. الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد تعليق خلية واحدة من الكريات البيض-التسلل الجلد مع بقاء الخلية عالية مع تقليل التكاليف المرتبطة عادة مع مجموعات كاشف العرف وdissociators الميكانيكية.

أنسجة الجلد طرق تفكك القائمة 5-7 قد يؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية وسلامة سطح علامة، أو تتطلب مجموعات انزيم العرف ومكلفة آلات تفكك النسيج 11/08. في حين أن هضم أذن الفأر أنسجة الجلد منتشر بشكل معقول 12-13، وهضم أنسجة الجلد الكيراتينية للغاية (على سبيل المثال من الجهة) يمكن أن يؤدي إلى الاستعدادات الخلية الملوثة مع كميات كبيرة من الحطام غير الخلوية. في دراسة حديثة، يهضم زيد وزملاؤه الماوس الجناح البشرة لمدة 90 دقيقة في 2.5 ملغ / مل dispase، FOLLOتزوجا قبل 45 دقيقة في 3 ملغ / مل كولاجيناز 7. في دراسة أخرى، استخدم هؤلاء الباحثون حضانات متعددة مع الهضم مجتمعة من 2.5 ساعة، بما في ذلك استخدام التربسين / EDTA، كولاجيناز الثالث، وdispase 5. لا ينصح استخدام التربسين لالأنزيمية الهضم الجلد، كما أظهرت المعاملة مع التربسين من مختلف الصانعين لتؤثر بشكل ملموس على سلامة بروتينات سطح الخلية في خلايا الثدييات 14-15. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون dispase آثار كبيرة على قدرات التكاثري خلايا CD4 وCD8α T وتؤثر على وفرة سطح لا يقل عن 20 الجزيئات، بما في ذلك T مشترك علامات تنشيط الخلايا مثل CD62L 16. بروتوكولات أخرى تستخدم RPMI 1640 في المتوسط ​​6 الهضم. ومع ذلك، فإن وجود من المغنيسيوم والكالسيوم 2+ 2+ في RPMI يمكن أن يسبب الخلايا واسعة التجميع 17.

وينبغي أن يهدف بروتوكول مثالية للتفكك الأنسجة لبقاء الخلية عالية، وانخفاضمستويات تجميع الخلية، والحد الأدنى من الضرر إلى الخلية البروتينات السطحية. وقد تم إنجاز جودة عالية التحضيرات خلية العقدة الليمفاوية انسجة مع البروتوكولات التي تستخدم حضانات انزيم أقصر، الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ سائل الإعلام الحرة، وتجنب التربسين وdispase 18. ومع ذلك، لم تثبت البروتوكولات من هذا النوع لتفكك الجلد الماوس كله.

هنا، يتم وصف بروتوكول لفصل وعزل، وإثراء الكريات البيضاء-التسلل الجلد من تحدى حساسية الماوس الجناح الجلد. لفترة وجيزة، وحضنت قبل رفعه الجلد في محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) مع 10٪ مصل بقري جنيني لمدة 1 ساعة لتليين الأنسجة لعملية الهضم وإزالة أي جلد أو الدهنية الميتة الأنسجة الزائدة. وأعقب ذلك 30 دقيقة خطوة الأنزيمية الهضم مع 0.7 ملغ / مل كولاجيناز D. كولاجيناز D ديه الحد الأدنى من الآثار على كثافة علامات سطح الخلية، وليس له تأثير على T تكاثر الخلايا في المختبر 16،18، مما يجعلهامناسبة جدا للتطبيقات التي تنطوي على توصيف البروتينات السطحية. بعد الهضم الأنزيمي، وكان يستخدم متقطع التدرج الكثافة الطرد المركزي لإزالة الخلايا الظهارية والحطام من تعليق وحيد الخلية وإثراء لالخلايا المكونة للدم. الأهم من ذلك، هذا الإجراء يتجنب الخلايا المغناطيسية الكواشف الفصل القائم على عمود مكلفة وآلات تفكك النسيج 11/8، ويمكن أن يؤديها مع المعدات والمواد الموجودة في مختبر البحوث الطبية الحيوية الأساسية. هنا تم استخدام هذا البروتوكول لعزل الكريات البيض من الجلد الجناح تحدى ثلاث مرات مع oxazolone ناشبة (الثور) في المتحسسة سابقا الفئران ND4 السويسري (مقتبس من 19). وقد تم تحليل الخلايا باستخدام متعددة حدودي التدفق الخلوي. هذه التقنية أسفرت تعليق خلية مع الحد الأدنى من الحطام و> 95٪ قابلية الخلايا الليمفاوية المعزولة التي تم تحليلها من قبل التدفق متعدد حدودي الخلوي لقياس تسلل الخلايا الليمفاوية T والعدلات في كورونا المتضررينفي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الفئران الأسبوع 8-12 أنثى القديمة ND4 بستر السويسرية، ويضم تقليديا مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء، واستخدمت لهذه الدراسات تمت الموافقة على بروتوكول تجريبي المستخدمة (B13S1) من خلال IACUC ماك ألستر الكلية.

1. توعية وتحدي مع Oxazolone

  1. اليوم 0
    1. إعداد غرفة التخدير عن طريق إضافة 3 مل الأيزوفلورين إلى المناشف الماصة وضعت تحت شبكة في الجزء السفلي من 4 L بغطاء جرة الزجاج. لإناث الفئران ND4 المستخدمة هنا، والوقت في الغرفة هو 30-60 ثانية حتى يتم تخدير موضوع بشكل كاف. تحسين إدارة مخدر للسلالة الماوس المستخدمة.
    2. حلاقة يعود كل فأر تخدير والجناح باستخدام الانتهازي وبر.
  2. اليوم 1
    1. جعل حل 2٪ من 4 ethoxymethylene-2-فينيل-2-oxazolin-5-واحد (الثور) إلى إيثانول المطلق، واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على طبق من الدورية في حاضنة.
    2. تخدير لفترة وجيزةالفئران باستخدام التخدير الأيزوفلورين كما هو موضح في 1.1.1 وتطبيق 100 ميكرولتر من 2٪ الثور إلى حلق مرة أخرى في العديد من التطبيقات المسلسل حول 20 ميكرولتر لكل منهما. انتظر 5-10 ثانية بين التطبيقات التسلسلية للحل لتجف.
    3. الحرص على تجنب إراقة 2٪ الحل الثور في مناطق أخرى من الخلف، وانتظر الحل لتجف بين التطبيقات.
  3. أيام 5-7
    1. جعل حل 1٪ من (الثور) في الايثانول المطلق، واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على طبق من الدورية في حاضنة.
    2. بلطف ولكن لشل حركة بحزم الماوس على القفا من قاعدة العنق والذيل مع البطن مواجهة والرقبة يميل قليلا إلى الأسفل (على غرار على عقد لحقن داخل الصفاق) وتطبيق 100 ميكرولتر من 1٪ الثور إلى الجناح حلق في العديد من التطبيقات التسلسلية وأخذ الوقت لتجفيف الجلد بعد ذلك كما هو موضح أعلاه.
    3. لالسيطرة على الفئران، وتطبيق 100 ميكرولتر من المركبات الإيثانول المطلقة لفلان حلقك.

2. الجناح الجلد الحصاد

  1. الموت ببطء الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون استنشاق، واستئصال بعناية المنطقة المرغوبة من الجلد الجناح (~ 25 ملم × 25 ملم من الجلد) مع 10 سم مقص جراحي.
  2. باستخدام نظيفة، شفرة جراحية حادة، كشط بعيدا الدهون الزائدة والنسيج الضام من الجلد الجناح.
  3. ضع 3 قطع من الجلد الجناح من 3 الفئران إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على 10 مل RT HBSS [مع الفينول الأحمر، بدون الكالسيوم أو المغنسيوم، 5 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، 10 ملي 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1- حمض piperazineethanesulfonic (HEPES)، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)].

3. قبل الهضم الأنسجة الغسل

  1. مكان أنبوب يحتوي على أجزاء الجلد على لوحة الدورية لمدة 30 دقيقة في حاضنة الجافة غير بالغاز-الحفاظ على 37 درجة مئوية.
  2. دوامة بقوة لمدة 10 ثانية في نهاية فترة الحضانة.
  3. سلالة محتويات الأنبوب خلال 70 ميكرونمصفاة للتخلص من المنطقة العازلة غسل وجمع الأنسجة. يمكن إعادة استخدامها مصفاة واحدة في جميع أنحاء الإجراء بأكمله ضمن مجموعة المعالجة البيولوجية.
  4. باستخدام زوج من الملقط، ونقل الجلد الجناح من مصفاة الى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد تحتوي على 10 مل من جديد، ووسائل الإعلام RT HBSS (التي تحتوي على EDTA، HEPES، وFBS كما هو موضح أعلاه).
  5. مع 12،5 سم مقص تشريح الجراحية مغمورة في أنبوب، تخطر على كل قطعة من الجلد الجناح حتى أن متوسط ​​قطعة من النسيج حوالي 2.2 مم × 2.2 مم في المنطقة.
  6. مكان أنبوب يحتوي على أجزاء الجلد على لوحة الدورية لمدة 30 دقيقة في حاضنة الجافة غير بالغاز-الحفاظ على 37 درجة مئوية.
  7. دوامة بقوة لمدة 10 ثانية على نهاية الحضانة

4. كولاجيناز الهضم من الجلد

  1. سلالة محتويات أنبوب من خلال مصفاة 70 ميكرون، وجمع ونقل القطع الجلد الجناح إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد تحتوي على 10 مل الصحائفش، RT HBSS وسائل الإعلام تستكمل مع 0.7 ملغ / مل كولاجيناز D.
  2. مكان أنبوب يحتوي على الهضم المتوسطة وشظايا الجلد على لوحة الدورية لمدة 30 دقيقة في حاضنة الجافة غير بالغاز-الحفاظ على 37 درجة مئوية.
  3. محتويات دوامة أنبوب بقوة لمدة 10 ثانية على نهاية الحضانة.
  4. تصفية محتويات أنبوب من خلال مصفاة 70 ميكرومتر إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد؛ الحفاظ على التدفق من خلال تحتوي على الأنسجة هضمها والتخلص من مصفاة والجناح الحطام الجلد.
  5. تغسل من خلال تدفق في 50 مل من HBSS وسائل الإعلام، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 غرام، وصب طاف.

5. كثافة الطرد المركزي التدرج

  1. باستخدام ماصة المصلية، إضافة 3 مل RT 67٪ كثافة التدرج وسائل الإعلام الطرد المركزي في الفوسفات 1X مخزنة المالحة (PBS) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد لكل عينة.
  2. resuspend الكرية خلية في 5 مل RT 44٪ كثافة وسائل الإعلام الطرد المركزي التدرج في HBSS مع الفينول الأحمر.
  3. شخص مهذبطبقة لاي 5 مل من 44٪ كثافة التدرج وسائل الإعلام الطرد المركزي التي تحتوي على الخلايا على أعلى من 67٪ من عينة سائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي باستخدام ماصة المصلية. تأكد من تعيين pipettor إلى أبطأ سرعة، ووضع ماصة على طول جدار أنبوب مخروطي الشكل. يجب الحرص على عدم اهتزاز، وتعطيل، أو عكس التدرج.
  4. تعيين تسارع إلى أدنى الإعداد، فك الارتباط على الفرامل، وأجهزة الطرد المركزي التدرج في 931 x ج لمدة 20 دقيقة في RT التأكد من أن أجهزة الطرد المركزي غير متوازن.
  5. بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية التدرج من أجهزة الطرد المركزي، ونقل بلطف على مقاعد البدلاء مختبر عقد أنبوب تستقيم. باستخدام 5 مل نقل البلاستيك ماصة، وإزالة طبقة الخلايا في واجهة من 44٪ و 67٪ التدرج الكثافة الطرد المركزي وسائل الإعلام ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. إذا واجهة غير مرئية، ببساطة إزالة حوالي 2 مل من السائل في 67٪ -44٪ الحدود.
  6. ملء أنبوب مخروطي يحتوي على خلايا من الأسواق العالمية ضغطهاrface مع 2٪ FBS في 1X PBS المثلج، والخلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ج، وصب طاف.
    ملاحظة: هذه هي المرة الأولى التي تقوم فيها الخلايا يمكن أن تبرد / أبقى الباردة منذ الخطوات الهضم هي 37 درجة مئوية، والخطوات وسائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي هي في RT. الخلايا يمكن معلق في 1: 1 التريبان تخفيف الأزرق والتهم ومعلومات حيوية يمكن الحصول عليها في هذه المرحلة.

6. الحجب وتلطيخ لتحليل تدفق Cytometric

  1. كتلة FcγRII / مستقبلات الثالث على خلايا لمنع تلطيخ الجسم المضاد غير محددة. لوصف التجارب هنا، وجعل يمزج سيد الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني مع 2٪ FBS تحتوي على 1: 100 التخفيف من الأجسام المضادة ضد اللامقترن CD16 / 32 (2.4G2) لربط وكتلة FcγRII / III مستقبلات.
  2. احتضان خلايا سدت مع يمزج رئيسية مناسبة من الأجسام المضادة ضد CD3ɛ (145-2C11)، CD4 (RM4-5)، CD8α (53 حتي 6،7)، CD11b (M1 / 70)، CD11c و(N418)، CD44 (IM7)، CD45 ( 30-F11)، CD45R(RA3-6B2)، CD62L (MEL-14)، ولي-6G / لي-6C (GR-1) (RB6-8C5)، وكذلك رائعة البنفسج 510 الحية / وصمة عار الميتة لتحديد الخلايا الميتة. استخدام جميع الأجسام المضادة إما في التخفيف الموصى بها من قبل الشركات المصنعة أو الأمثل من قبل الباحثين في السابق. لوصف التجارب هنا، استخدم كل الأجسام المضادة في التخفيف 1: 100.
  3. غسل الخلايا و resuspend في 50 ميكرولتر 1X PBS عازلة تلطيخ مع 2٪ FBS. الحفاظ على الجليد حتى يمكن الحصول على البيانات مضان على تدفق عداد الكريات.
    ملاحظة: من المهم أن يكون المعلمات تعويض ما قبل الأمثل مع الأنسجة اللمفاوية ومستضد سطح الخلية المشتركة (مثل CD4 أو CD8) قبل الحصول على البيانات مضان.
  4. لزيادة عدد الخلايا لتدفق المصب تحليل الخلوي، والحصول على البيانات من عينة كاملة من الخلايا الملون.

7. تحليل التدفق الخلوي البيانات باستخدام الطرق القياسية لإنجاز الخطوات المذكورة أدناه

  1. الأولى، بوابة على المنطقة اللمفاويات مبعثر إلى الأمام(منطقة) من خلال الجانب مبعثر (منطقة) المؤامرة.
  2. ثم، حدد الخلايا واحدة باستخدام مبعثر إلى الأمام (العرض) من خلال الجانب مبعثر (العرض)، لتجنب تحليل الحلل. هذا ويمكن أيضا أن يتحقق مع ارتفاع مبعثر إلى الأمام إلى جنب ارتفاع مبعثر المؤامرة.
  3. ثم، البوابة على النسب (CD11b، CD11c و، وCD45R / B220) -negative وCD3 إيجابية الأحداث، على أن تستبعد الضامة، والخلايا الخلايا الجذعية، وB، على التوالي، ويحلل تحصر إلى الخلية حجرة T، إذا كان الهدف هو، كما هو الحال هنا، لتقييم اختراق خلايا T.
  4. المقبل، بوابة على الخلايا الحية التي تستبعد / وصمة عار الميتة الحية.
  5. وأخيرا، بوابة على السكان خلية من الفائدة (انظر القسم ممثل النتائج).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تعامل كولاجيناز D splenocytes تظهر مستويات مماثلة من CD4 و CD8 α على خلايا T بالمقارنة مع الضوابط المعالجة الإعلامية
أولا، تم تقييم أي آثار محتملة من كولاجيناز D على وتيرة والسطحية وفرة من النسب وتفعيل علامات على T فرعية الخلية باستخدام الأنسجة اللمفاوية الثانوية كمجموعة تحكم. تم الحصول على تعليق من splenocytes من الفئران ND4 وغسلها لمدة 1 ساعة مع HBSS وسائل الإعلام. المقبل، نصف الخلايا تتعرض إلى 0.7 ملغ / مل كولاجيناز D (كما هو موضح في القسم 4 أعلاه). ومعلق الخلايا المتبقية في السيطرة HBSS المتوسطة. بعد ذلك، تم تجهيز كل من الكسور خلية طحالية باستخدام الكثافة الطرد المركزي التدرج كما هو موضح في القسم 5 أعلاه. ثم تم ملطخة الخلايا مع الأجسام المضادة ضد سطح CD4 وCD8α، وتحليلها على تدفق عداد الكريات. واحدة، ويعيش، CD45 غير-T النسب - (B220 - CD11b -CD11c و-)، وبوابات CD3ɛ + الخلايا لتحليلها، لاستبعاد الخلايا B، الضامة، والخلايا الجذعية. تم الكشف عن CD4 وCD8α البروتينات بالتساوي على سطح splenocytes التي تعرضت لكولاجيناز D الهضم وتلك لم تتعرض لانزيم مع ما يقرب من 60٪ CD4 + CD8α - خلايا و 30٪ CD4 - CD8α + خلايا الكشف مع أي علاج ( الشكل 1A). ولذلك، لم كولاجيناز D ملخص لا تؤثر على وتيرة النسبي للCD4 وCD8α. كانت شدة سطح CD4 وCD8α المتوسط ​​الهندسي وحدات مضان (gMFI) على هذه المجموعات الفرعية للمقارنة بين العلاجين أيضا. وكانت القيم gMFI لCD4 2271 لالمعالجة انزيم وsplenocytes 2243 للسيطرة على التوالي، وكانت القيم gMFI لCD8α 536 لالمعالجة الإنزيم و 520 لsplenocytes السيطرة. كان العلاج الأنزيمية أيضا أي تأثير على كثافة سطح تنشيط الخلايا T علامات CD44 أو CD62L على خلايا CD4 + T (الشكل 1B). وكانت هندسية متوسط ​​قيم الكثافة مضان لCD44 669 لالمعالجة الإنزيم و 654 لsplenocytes السيطرة؛ وكانت القيم gMFI لCD62L 1523 لالمعالجة انزيم و1517 لsplenocytes السيطرة. كما كولاجيناز D الهضم يحافظ على سلامة البروتينات على سطح خلايا معزولة، وبروتوكول الموصوفة هنا يمكن استخدامها مع الثقة لتدفق المصب تحليل الخلوي.

انزيم الهضم وتنقية التدرج من الجلد الجناح خلايا النتائج في جدوى الخلوية عالية
تم تقييم العائد الخلية والجدوى في المئة من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها أعلاه باستخدام التريبان الأزرق صبغ استبعاد 20. هذا البروتوكول الفصل الهضم والتدرج أسفرت عن 250 الخلايا المناعية قابلة للحياة في ملم 2 من الأنسجة الجناح في الفئران الثور طعن، وحوالي 4 خلايا مناعية قادرة على البقاء في ملم 2 من الأنسجة في الفئران تحدى السيارة التي تم المتحسسة سابقا مع الثور (الجدول 1).

انزيم الهضم وتنقية التدرج من الجلد الجناح خلايا النتائج في انتعاش اقتصادي قوي من الخلايا المناعية
بعد ذلك، تم تحديد مدى تسلل المناعي في الجلد عن طريق تحليل وفرة من البروتينات السطحية CD45 على الخلايا المعزولة من الجهة الثور طعن والسيطرة على الفئران لتقييم الانتعاش من الخلايا المناعية تسلل الجلد باستخدام الأساليب المذكورة هنا. CD45 هو النسب علامة عموم المكونة للدم 21. 95٪ من منخفض إلى الأمام والجانب مبعثر، خلايا مفردة (النابضة لا يظهر) في الفئران الثور طعن وكانت 71٪ من هذه الخلايا في الضوابط تحدى السيارة CD45 + الخلايا الحية (الشكل 2). تم الكشف عن A ~ زيادة 67 أضعاف في التسلل CD45 + المناعة الخلايا في الجلد الجناح التالية 3 التحديات الثور اليومية باستخدام الإجراء الموضح في هذه الوثيقة (الجدول 1).

الصورة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "1"> ثلاثة تحديات الجناح الثور يؤدي إلى تسلل واضح للخلايا T والعدلات
أسلوبنا أثمرت السكان خلية من الجلد الجهة التي يمكن استخدامها للكشف عن مجموعة متنوعة من النخاعي ومجموعات فرعية الخلايا اللمفاوية مثل GR-1 + العدلات 22، خلايا CD4 T والخلايا CD8α T. لاحظنا ~ 6 أضعاف، ~ 7 أضعاف، و~ زيادة 73 أضعاف في العدلات، وخلايا CD4 T، وخلايا T CD8α، على التوالي، بعد 3 التحديات الثور اليومية (الجدول 1). حسبنا هذه الزيادات عن طريق ضرب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة التي تم الحصول عليها (تحسب باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد) من قبل في المئة من جزء الخلايا المناعية تعطى للخروج من البوابة خلايا قابلة للحياة خلال تحليل تدفق cytometric. نحن ثم يقسم العدد الإجمالي للخلايا المناعية قابلة للحياة، GR-1 CD4 أو CD8α + الخلايا في الفئران الثور المعاملة على أيدي الأرقام المقابلة للفئران السيطرة على السيارة، مما يتيح لناأضعاف الزيادة في مجموعات فرعية لمفاوية. وشكلت GR-1 + العدلات عن 42٪ من واحد، CD45 الحية + B220 - CD11b - CD11c و- الخلايا في الفئران الثور المعاملة و 10٪ من هذه الفئة من السكان في الفئران ETOH المعاملة (الشكل 2B). في الفئران الثور المعاملة، ~ 52٪ من بوابات الخلايا CD3 + T كانت CD8α + و~ 34٪ كانت CD4 بينما في الضوابط مركبة، ~ 9٪ من خلايا T كانت CD8α + وكانت 57٪ CD4 + (الشكل 2C) . لذلك، مع تقنية وصفها هنا، يمكن معالجتها حساسية وغير حساسية الجلد الجناح لانتاج تعليق خلية واحدة مناسبة لعالية الدقة تدفق cytometric توصيف تسلل مجموعات فرعية الخلايا المناعية.

خلايا فرعية من الجلد الماوس الجناح ثور / ثور (3) ثور / ETOH (3) أضعاف التوسع (الثور / Ethanol)
في مم 2 الأنسجة
إجمالي عدد الخلايا 262.7 5.3 49.3
CD45 + الخلايا المناعية 250.7 3.8 66.7
CD4 + CD8 - الخلايا 6.5 0.9 7.2
CD4 - CD8 + الخلايا 10.6 0.1 72.9
العدلات 8.6 15 5.6

الجدول 1. غلة خلية من حساسية الجلد الجناح في الفئران الإناث ND4. احصي الخلايا قادرة على البقاء معزولة عن الجلد الجناح باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد، وتطبيع خلية / ملم 2 الأنسجة استنادا إلى منطقة من الجلد معزولة وعدد من الفئران المجمعة في تيسمقاضاة الإعداد. حسبنا مجموع العائد الخلايا المناعية على أساس الكشف عن CD45 المكونة للدم مستضد على سطح الخلية، واللمفاويات عوائد فرعية على أساس علامات سطح نسب محددة. نحن بعد ذلك بقسمة عدد الخلايا في الفئران الثور المعاملة على أيدي الأرقام بالنسبة للفئران السيطرة على السيارة، وهذا يعطينا أضعاف الزيادة في مجموعات فرعية لمفاوية. تمثل البيانات الواردة البيانات المجمعة 2-3 الفئران في العلاج، وهي تمثيلية من تجربتين مستقلة.

الشكل 1
الشكل 1. انزيم الهضم والتدرج تنقية splenocytes الحفاظ على مجموعات فرعية لمفاوية وعلامات تنشيط الخلايا. غسلها Splenocytes لمدة 1 ساعة مع HBSS وسائل الإعلام، حضنت مع أي كولاجيناز D أو وسائل الإعلام HBSS وحده، وتنقيته باستخدام التدرج الكثافة لإزالة الحطام وخلايا الدم الحمراء. وقد تم تحديد الخلايا T كما يعيش، CD45 النسب (B220، CD11b، CD11c و) <سوب> -، وCD3ɛ +. لم تواتر CD4 والخلايا T CD8α لن يتغير بعد الهضم الأنزيمي (A). لم كثافة سطح CD44 وCD62L على خلايا CD4 + T لن تتغير بعد الهضم الأنزيمي (B). البيانات الواردة تمثل تجميع البيانات 2-3 الفئران في العلاج من تجربة واحدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. انزيم الهضم وتنقية التدرج من خلايا الجلد تكشف تسلل المناعة واضح في السيطرة مقابل تحدى حساسية الماوس الجناح الجلد. ثلاثة تحديات الجناح الثور تنتج الزيادة ~ 67 أضعاف في الخلايا المناعية تسلل الجلد في المتحسسة سابقا الفئران ND4 السويسري ( A). الأقليم ثلاثة تحديات الثور أيضاoked زيادة ~ 6 أضعاف في GR-1 + العدلات (B)، و ~ و ~ 73- زيادة بنسبة 7 أضعاف الخلايا CD8α + وCD4 + T على التوالي (C). هي بوابات CD45 + الخلايا المناعية الحية من خلايا مبعثر واحدة، منخفضة إلى الأمام والجانب. العدلات وخلايا T بوابات من B220 - CD11b - CD11c و- الخلايا وحيدة حية. أجريت التهم باستخدام 1: 1 التريبان تخفيف الأزرق بعد الانفصال كثافة التدرج. البيانات الواردة يمثل تجميع البيانات 2-3 الفئران في كل مجموعة العلاج، وتكون تمثيلية من تجربتين مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تميز التغيرات في الكريات البيضاء والجلد المقيمين في نماذج القوارض من الأمراض الجلدية مثل الاكزيما أو الصدفية المهم لفهم الاتصالات الآلية بين تدفق الخلايا الالتهابية وعلم الأمراض. نحن هنا وصف تقنية اقتصادية لعزل الكريات البيض من أنسجة الجلد مع المعدات الأساسية الموجودة في معظم مختبرات الأبحاث الطبية الحيوية. هذه التقنية السريعة نسبيا يتجنب استخدام آلات تفارق الأنسجة مكلفة وأنابيب مخصصة والكواشف، مما يساعد على الحفاظ على الموارد وتقليل الأيدي في الوقت المحدد على مقاعد البدلاء المختبر. الأنزيمية لطيف هضم وفصل التدرج متقطع إزالة معظم الخلايا الظهارية والحطام، وخلايا معزولة يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب بما في ذلك تحليل تدفق cytometric، فرز الخلايا، ونقل، زراعة الخلايا وفحوصات التحفيز المختبر. الأنزيمية هضم مع كولاجيناز D له أي تأثير على T سطح الخلية سلامة علامة، وبريزرفيس بقاء الخلية. هذا البروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لمعالجة البشرة من مناطق أخرى من الجناح.

الخطوات الأكثر أهمية في هذا الإجراء هي 1) إزالة تماما أي الدهنية والأنسجة الضامة في حين حصد الجلد، 2) التعامل مع والأنسجة المعالجة السريعة لتحقيق أقصى قدر من التسلل العائد الخلية مع تقليل موت الخلايا، 3) طبقات بلطف التدرج، و4) بعناية استخراج واجهة من التدرج. قبل البدء في تجربة على نطاق واسع أنه من المهم أن ممارسة التدرج الكثافة الطرد المركزي طبقات وسائل الاعلام وإزالة واجهة. يمكن للمرء أن ممارسة خلايا الحصاد من التدرج الكثافة متقطعة عن طريق سحق والطحال الفئران بأكمله من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني 1X العازلة تلطيخ وأداء التدرج الكثافة كما هو موضح أعلاه في الخطوة 5. فمن الأسهل كثيرا أن نرى واستخراج واجهة بين 44٪ سائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي ووسائل الإعلام 67٪ التدرج الكثافة الطرد المركزي تستخدم ليرة سوريةlenocytes، بسبب وجود عدد كبير من الخلايا المناعية الحالية.

عند العمل مع التدرجات كثافة، وينبغي تجنب فقاعات في حين pipetting ل، وينبغي التقليل من اضطرابات التدرج. أنبوب مخروطي يحتوي على التدرج ينبغي التعامل بلطف وعقد عموديا في جميع الأوقات. يجب التدرج الكثافة حلول الوسائط الطرد المركزي أن يكون دائما في RT، pipettors المصلية لتعيين أبطأ سرعة الإفراج الممكنة، وأجهزة الطرد المركزي الحفاظ على RT، لتعيين منخفضة تسارع مع الفرامل فض الاشتباك، وبعناية متوازنة قبل الغزل. عند العمل مع المستحضرات الجلدية التي تحقق أعداد صغيرة من الكريات البيض التسلل، والخلايا ليست دائما واضحة في واجهة التدرج. وبالتالي، فمن المهم لجعل 44٪ كثافة وسائل الإعلام الطرد المركزي التدرج مع HBSS تحتوي على الفينول الأحمر بحيث اجهة يمكن تصور بسهولة حتى عندما طبقة من الخلايا لا يمكن تمييزها. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أن يكون لطيف ولكن سريعا عند استخراج والغسيلومعالجة أنسجة الجلد لتجنب موت الخلايا قبل أن يتم وضعها على الجلد في وسائل الإعلام HBSS.

إذا بقاء الخلية أو نقاء منخفضة، وأقصر (~ 20 دقيقة) مرات الهضم، وتركيزات أقل قليلا من كولاجيناز D (~ 0.5 ملغ / مل)، أو تنميق النسيج أكثر دقة قد تكون مفيدة. بسبب الإفراط في الهضم وتدهور الأنسجة قد تساهم في موت الخلايا، سوف يحتاج الباحثون إلى تحسين الحد الأدنى من الوقت الهضم الذي يوفر كبير بما فيه الكفاية عينة خلية حجم 17. ومن المرجح أن تتطلب العملية عدة جولات من التحسين في أيدي المحققين الفردية لتوحيد هذه التقنية. قد تختلف كولاجيناز D مستوى النشاط أيضا بين التصنيع الكثير وتعديلات لآخر الهضم سوف يتعين القيام بها لكل الكثير من الإنزيم المستخدم. خلال التحسين، من المهم أن الايقاف الخلية إشارة وصمة عار (مثل الطحال) تنقيته مع وبدون الأنزيمية الهضم خطوة مع العيش / وصمة عار الميتة يمكن الاعتماد عليها وكذلك الخلايا المناعية لينعلامات EAGE (مثل CD45، CD3ɛ، CD11b، CD11c و، وما إلى ذلك) للتأكد من أن يتم الاحتفاظ السكان الخلية وعلامات سطح الفائدة من خلال عملية الهضم الأنسجة. إذا كان ذلك ممكنا، فإنه من المفيد لأداء أمثل على تدفق عداد الكريات التي يمكن قياس قدما وعرض الجانب مبعثر أو الارتفاع، وكذلك منطقة، لاستبعاد المجاميع الخلية. وأخيرا، ينبغي دراسة الايقاف الخلية تحت مجهر الضوء المرئي لتقييم الجدوى والتشكل الخلوي العام. الخلايا يمكن عدها يدويا باستخدام 0.4٪ التريبان الأزرق صبغ الإقصاء تحت المجهر الخفيفة أو على قياس التدفق الخلوي باستخدام الخرز العد. للدراسات التي تتطلب تقدير أكثر صرامة من أنواع معينة من الخلايا في الأنسجة استئصاله، يمكن للباحثين تزن أو قياس حجم الشظايا الأنسجة قبل وبعد عملية الهضم، واستخدام مدى الهضم لتقدير أكثر دقة أعداد مجموعات فرعية الخلايا الموجودة في الأنسجة الوجود تحليل.

واحد الحد من هذاالبروتوكول هو أنها مصممة خصيصا لتنقية الخلايا المناعية. إذا كان أحد يهتم في العزلة، وتنقية، وتحليل السكان الخلوي آخر (على سبيل المثال خلايا الجلد الظهارية)، وكثافة التدرج انشاء والأنزيمية هضم على حد سواء حاجة المرجح أن يتم تعديل البروتوكول والأمثل لأفضل عزل خلايا الفائدة. ومع ذلك، هذا البروتوكول يسمح لعزل وتنقية كل من مجموعات فرعية الخلايا اللمفاوية والدم النخاعي وبالتالي يمكن تكييفها لمعظم التطبيقات المناعية. قيود آخر هو أن هذا البروتوكول لا يمكن استخدامها للتمييز بين سكان الخلية بالتسلل إلى الأدمة مقابل البشرة من الجلد. لتحقيق هذا المستوى من التمايز، أن هذا البروتوكول يتعين زيادة تكييفها مع خطوات إضافية لفصل إنزيمي الأدمة والبشرة قبل أو بدلا من الخطوات المذكورة هنا. هنا، يتم تجميع عينات من ~ 3 الفئران لتسهيل متعددة المعلمة تحليل تدفق cytometric مما يجعل من الصعبالكشف عن التباين بين مكررات البيولوجية. ومع ذلك، اعتمادا على تطبيق المصب في الاختيار، وهذا البروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لانتاج واستخدام عينات من المواد واحدة. وأخيرا، قدم بروتوكول هنا للصغار، قد تحتاج ND4 إناث الفئران إلى تعديل للفئران من مختلف الأعمار والجنس أو سلالات وفقا لاحتياجات الباحثين.

باختصار، هذا المزيج من الأنزيمية لطيف الهضم ويتيح الفصل التدرج متقطع طريقة بسيطة وفعالة واقتصادية لتنقية الخلايا المناعية من آفات الجلد التهابات في الفئران. ويمكن استخدامها وتكييفها على نطاق واسع عبر مجموعة متنوعة من نماذج القوارض من أمراض الجلد كأداة ملائمة لتقييم تسلل المناعة، وعزل النقي، والسكان قابلة للحياة الكريات البيض لتطبيقات المصب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية أو غيرها في الكشف عنها.

Acknowledgements

المعاهد الوطنية للصحة (NIH R15 NS067536-01A1 لDC)، والرابطة الوطنية التهاب الأعضاء الأنثوية (الجائزة لDC)، وماك ألستر كلية دعمت هذا العمل. تلقى CB زمالة من برنامج بيكمان علماء ماك ألستر كلية، بتمويل من مؤسسة أرنولد ومابيل بيكمان. معتمدة BTF وTM التي كتبها JDRF 2-2011-662. نشكر الدكتور جيسون شنكل والدكتور جوليانا لويس للحصول على المشورة التقنية، وجميع الأعضاء الحاليين والسابقين في المختبر Chatterjea لما قدموه من مساعدة والدعم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid Sigma Aldrich 55021C Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma Aldrich H3375
EDTA disodium salt solution Sigma Aldrich E7889 Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select MidSci S01520HI Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) Sigma Aldrich P1644 Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201  Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one Sigma Aldrich E0753-10G Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) Tonbo Biosciences 70-0161 Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) Becton Dickinson 564378 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) eBioscience 47-0042-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8α-BV785 (53-6.7) BioLegend 100749 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) eBioscience 48-0112-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418) eBioscience 48-0114-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7) Becton Dickinson 563971 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11) Tonbo Biosciences 35-0451-U025 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) eBioscience 48-0452-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) BioLegend 104431 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) BioLegend 108407 Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510 Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa Becton Dickinson N/A Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum Roche Applied Science 11088858001 Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice Harlan 0-32 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134, (6), 1-8 (2013).
  2. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133, (2), 303-315 (2013).
  3. Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127, (6), 1292-1308 (2007).
  4. Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
  5. Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
  6. Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199, (9), 1265-1275 (2004).
  7. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, (14), 5307-5312 (2014).
  8. Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132, (7), 1869-1876 (2012).
  9. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
  10. Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
  11. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  12. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, (6), 973-984 (2011).
  13. Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35, (4), 562-571 (2011).
  14. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (36), (2010).
  15. Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6, (1), 10-20 (2014).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
  18. Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
  19. Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8, (10), e78673 (2013).
  20. Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40, (9), 557-560 (2009).
  21. Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9, (10), 320-326 (1988).
  22. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83, (1), 64-70 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics