एंजाइमी डाइजेस्ट और ढाल जुदाई का उपयोग माउस त्वचा से घुसपैठ कर Leukocytes का अलगाव

1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota
Published 1/25/2016
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Immunology and Infection

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Benck, C. J., Martinov, T., Fife, B. T., Chatterjea, D. Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation. J. Vis. Exp. (107), e53638, doi:10.3791/53638 (2016).

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Abstract

Introduction

संपर्क जिल्द की सूजन, एक्जिमा, सोरायसिस, cellulitis, गैर मेलेनोमा त्वचा कैंसर के लिए फंगल संक्रमण और फोड़े से लेकर त्वचा की स्थिति दुनिया भर में 50 सबसे अधिक प्रचलित रोगों के बीच में होना पाया गया है, और 2010 1 में गैर-घातक रोगों का चौथा प्रमुख वैश्विक कारण। तदनुसार, विविध त्वचा विकृतियों अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच के अनुसंधान का एक जरूरी और सक्रिय क्षेत्र है। कृंतक मॉडल ऐसे atopic जिल्द की सूजन 2, सोरायसिस 3, या स्ताफ्य्लोकोच्चुस संक्रमण 4 के रूप में भड़काऊ त्वचा की स्थिति की समझ में उल्लेखनीय उपयोगी किया गया है। माउस त्वचा के ऊतकों के enzymatic पाचन के लिए सस्ती, कुशल, और सरल प्रोटोकॉल बेहतर त्वचा रोगों के pathophysiology को समझने के बहाव के अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कोशिकाओं की तैयारी प्रदान कर सकते हैं। इधर, एक सरल और किफायती तरीका माउस त्वचा के enzymatic पचाने के लिए वर्णित हैऊतक और सेल संस्कृति, इन विवो दत्तक हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि त्वचा में घुसपैठ leukocytes के अलगाव, cytometric विश्लेषण और छँटाई या जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के प्रवाह। इस प्रक्रिया के समग्र लक्ष्य आम तौर पर कस्टम अभिकर्मक किट और यांत्रिक dissociators के साथ जुड़े लागत को कम करते हुए उच्च सेल व्यवहार्यता के साथ त्वचा में घुसपैठ leukocytes के एक एकल कक्ष निलंबन को तैयार है।

मौजूदा त्वचा ऊतक हदबंदी तरीकों 5-7 कम सेल व्यवहार्यता और सतह मार्कर अखंडता में परिणाम है, या कस्टम एंजाइम किट और महंगा ऊतक हदबंदी मशीनों 8-11 आवश्यकता हो सकती है। माउस कान त्वचा के ऊतकों के पाचन यथोचित, 12-13 प्रचलित अत्यधिक keratinized त्वचा के ऊतकों को पचाने है (उदाहरण के पार्श्व से) गैर सेलुलर मलबे की बड़ी मात्रा के साथ दूषित सेल तैयारी में परिणाम कर सकते हैं। हाल के एक अध्ययन में, हमदानी और उनके सहयोगियों 2.5 मिलीग्राम में 90 मिनट के लिए माउस पार्श्व त्वचा पचा / एमएल Dispase, follo3 मिलीग्राम / एमएल कोलैजिनेज़ 7 में 45 मिनट से शादी की। एक अन्य अध्ययन में इन शोधकर्ताओं / trypsin EDTA, कोलैजिनेज़ III के उपयोग सहित, 2.5 घंटे की एक संयुक्त पाचन के साथ कई incubations के लिए प्रयोग किया जाता है, और 5 dispase। विभिन्न निर्माताओं से trypsin के साथ उपचार हद स्तनधारी कोशिकाओं पर 14-15 कोशिका की सतह प्रोटीन की अखंडता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है के रूप में trypsin के उपयोग, एंजाइमी त्वचा पाचन के लिए सिफारिश नहीं है। इसके अतिरिक्त, Dispase CD4 और CD8α टी कोशिकाओं के proliferative क्षमताओं पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है और इस तरह के CD62L 16 के रूप में आम टी सेल सक्रियण मार्कर सहित कम से कम 20 अणुओं की सतह बहुतायत प्रभावित करते हैं। अन्य प्रोटोकॉल पाचन मध्यम 6 में 1640 RPMI का उपयोग करें। हालांकि, RPMI में 2 मिलीग्राम + और ​​सीए 2 की उपस्थिति व्यापक सेल एकत्रीकरण 17 का कारण बन सकता है।

ऊतक हदबंदी के लिए एक आदर्श प्रोटोकॉल उच्च सेल व्यवहार्यता, कम करने के लिए उद्देश्य होना चाहिएसेल एकत्रीकरण, और कम से कम नुकसान के स्तर को सतह प्रोटीन सेल। उच्च गुणवत्ता लिम्फ नोड stromal सेल की तैयारी में कम एंजाइम incubations, सीए 2 और 2 मिलीग्राम + स्वतंत्र मीडिया का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल के साथ पूरा किया, और trypsin बचने के लिए और 18 dispase कर दिया गया है। हालांकि, इस प्रकार के प्रोटोकॉल पूरे माउस त्वचा की हदबंदी के लिए स्थापित किया गया है।

इधर, एक प्रोटोकॉल, अलग कर देना अलग, और allergen को चुनौती दी माउस पार्श्व त्वचा से त्वचा में घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स बेहतर बनाने के लिए वर्णित है। संक्षेप में, excised त्वचा पाचन के लिए ऊतक नरम और किसी भी अतिरिक्त मृत त्वचा या वसा ऊतकों को दूर करने के लिए 1 घंटे के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) में पूर्व incubated है। यह 0.7 मिलीग्राम के साथ एक 30 मिनट enzymatic पाचन कदम से पीछा किया जाता है / एमएल कोलैजिनेज़ डी कोलेजिनेस डी यह कर रही है, कम से कम कोशिका की सतह मार्करों के घनत्व पर प्रभाव, और इन विट्रो 16,18 में टी सेल प्रसार पर कोई प्रभाव नहीं हैसतह प्रोटीन के लक्षण वर्णन जुड़े अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक उपयुक्त है। Enzymatic पाचन के बाद, असंतत घनत्व ढाल centrifugation एकल कोशिका निलंबन से उपकला कोशिकाओं और मलबे को हटाने और hematopoietic कोशिकाओं के लिए बेहतर बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। महत्वपूर्ण बात, इस प्रक्रिया महंगा स्तंभ आधारित चुंबकीय सेल जुदाई अभिकर्मकों और ऊतक हदबंदी मशीनों 8-11 से बचा जाता है, और एक बुनियादी जैव चिकित्सा अनुसंधान प्रयोगशाला में पाया उपकरणों और सामग्री के साथ किया जा सकता है। यहाँ इस प्रोटोकॉल (19 से अनुकूलित) पहले से अवगत ND4 स्विस चूहों में hapten oxazolone (बैल) के साथ पार्श्व त्वचा से चुनौती दी तीन बार ल्यूकोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रकोष्ठों बहु पैरामीट्रिक फ्लो का उपयोग विश्लेषण किया गया। इस तकनीक को न्यूनतम मलबे और cytometry प्रभावित एसके में टी lymphocytes और जीवाणुओं की घुसपैठ को मापने के लिए बहु-पैरामीट्रिक प्रवाह से विश्लेषण किया गया है, जो पृथक लिम्फोसाइटों के> 95% व्यवहार्यता के साथ एक सेल निलंबन झुकेंगेमें।

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Protocol

नोट: पारंपरिक भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ रखे 8-12 सप्ताह पुराने महिला ND4 स्विस वेबस्टर चूहों, इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया गया (B13S1) का इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल Macalester कॉलेज के IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया था।।

Oxazolone के साथ 1. संवेदीकरण और चैलेंज

  1. 0 दिवस
    1. एक 4 एल lidded ग्लास जार के तल पर जाल के नीचे रखा शोषक तौलिए को 3 मिलीग्राम isoflurane जोड़कर संज्ञाहरण कक्ष तैयार करें। विषय पर्याप्त रूप से anesthetized है जब तक यहां इस्तेमाल ND4 मादा चूहों के लिए, कक्ष में समय 30-60 सेकंड है; माउस तनाव इस्तेमाल किया जा रहा संवेदनाहारी प्रशासन का अनुकूलन।
    2. प्रत्येक anesthetized माउस की पीठ दाढ़ी और एक पशु बाल trimmer का उपयोग पार्श्व।
  2. पहला दिन
    1. पूर्ण इथेनॉल में 4-ethoxymethylene-2-फिनाइल-2-oxazolin-5-एक (बैल) की एक 2% समाधान करें, और एक मशीन में एक घूर्णन थाली पर 15 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. संक्षेप में anesthetize1.1.1 में वर्णित है और लगभग 20 μl प्रत्येक के कई धारावाहिक अनुप्रयोगों में वापस मुंडा को 2% बैल के 100 μl लागू के रूप में isoflurane संज्ञाहरण का प्रयोग चूहों। सूखे के लिए समाधान के लिए धारावाहिक अनुप्रयोगों के बीच 5-10 मिनट रुको।
    3. पीठ के अलावा अन्य क्षेत्रों पर 2% बैल समाधान spilling से बचने, और अनुप्रयोगों के बीच सूखे के लिए समाधान के लिए प्रतीक्षा करने के लिए ध्यान रखना।
  3. दिनों 5-7
    1. पूर्ण इथेनॉल में (बैल) के एक 1% समाधान करें, और एक मशीन में एक घूर्णन थाली पर 15 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. धीरे लेकिन दृढ़ता से सामना करना पड़ रहा पेट के साथ गर्दन और पूंछ आधार के कूड़ा पर माउस स्थिर और गर्दन थोड़ा (एक intraperitoneal इंजेक्शन के लिए एक पकड़ के समान) नीचे की ओर झुका हुआ है और कई धारावाहिक अनुप्रयोगों में मुंडा पार्श्व 1% बैल के 100 μl लागू जैसा कि ऊपर वर्णित और समय देने के बाद में सूखी त्वचा के लिए।
    3. चूहों पर नियंत्रण के लिए, मुंडा फ्लान को पूर्ण इथेनॉल वाहन के 100 μl लागूकश्मीर।

2. पार्श्व त्वचा हार्वेस्ट

  1. कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना का प्रयोग चूहों Euthanize, और ध्यान से 10 सेमी शल्य कैंची के साथ पार्श्व त्वचा (~ त्वचा के 25 मिमी x 25 मिमी) के वांछित क्षेत्र आबकारी।
  2. एक साफ, तेज सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करना, पार्श्व त्वचा से अतिरिक्त वसा और संयोजी ऊतक दूर परिमार्जन।
  3. कैल्शियम और मैग्नीशियम, 5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), बिना, फिनोल लाल के साथ 10 मिलीलीटर आरटी HBSS [युक्त एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 3 चूहों से पार्श्व त्वचा के 3 टुकड़े की जगह 10 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1 piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)]।

3. पूर्व पाचन ऊतक धुलाई

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक सूखी गैर मार डाला इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए एक घूर्णन थाली पर त्वचा के टुकड़े युक्त जगह ट्यूब।
  2. ऊष्मायन अवधि के अंत में सख्ती 10 सेकंड के लिए भंवर।
  3. एक 70 माइक्रोन के माध्यम से ट्यूब की सामग्री तनावझरनी धोने बफर त्यागने और ऊतक लेने के लिए। एक एकल झरनी एक जैविक उपचार समूह के भीतर पूरी प्रक्रिया के दौरान पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  4. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, (जैसा कि ऊपर वर्णित EDTA, HEPES, और FBS युक्त) ताजा, आरटी HBSS मीडिया के 10 मिलीग्राम से युक्त एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में झरनी से पार्श्व त्वचा हस्तांतरण।
  5. ऊतक की औसत टुकड़ा क्षेत्र में लगभग 2.2 मिमी x 2.2 मिमी इतना है कि ट्यूब में डूबे शल्य विदारक कैंची की एक 12.5 सेमी जोड़ी के साथ, पार्श्व त्वचा का एक टुकड़ा कीमा।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक सूखी गैर मार डाला इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए एक घूर्णन थाली पर त्वचा के टुकड़े युक्त जगह ट्यूब।
  7. ऊष्मायन के अंत में सख्ती 10 सेकंड के लिए भंवर

त्वचा की 4. collagenase पाचन

  1. एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से ट्यूब की सामग्री तनाव को इकट्ठा करने और एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार युक्त ट्यूब 10 मिलीलीटर fre में पार्श्व त्वचा टुकड़े हस्तांतरणश, आरटी HBSS मीडिया 0.7 मिलीग्राम के साथ पूरक / डी collagenase मिलीलीटर
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक सूखी गैर मार डाला इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए एक घूर्णन थाली पर पाचन मध्यम और त्वचा के टुकड़े युक्त जगह ट्यूब।
  3. ऊष्मायन के अंत में सख्ती 10 सेकंड के लिए ट्यूब के भंवर सामग्री।
  4. एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से ट्यूब के फ़िल्टर सामग्री; पचा ऊतक युक्त प्रवाह के माध्यम से रखने के लिए और झरनी त्यागने और त्वचा मलबे पार्श्व।
  5. 350 ग्राम से कम 5 मिनट के लिए HBSS मीडिया, सेंट्रीफ्यूज की 50 मिलीलीटर में प्रवाह के माध्यम से धो लें, और सतह पर तैरनेवाला छानना।

5. घनत्व ढाल centrifugation

  1. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, प्रत्येक नमूना के लिए एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 1X फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 3 मिलीग्राम आर टी 67% घनत्व ढाल centrifugation मीडिया जोड़ें।
  2. फिनोल लाल के साथ HBSS में 5 मिलीलीटर आर टी 44% घनत्व ढाल centrifugation मीडिया में सेल गोली Resuspend।
  3. सज्जनLy परत एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर 67% घनत्व ढाल centrifugation मीडिया नमूना के शीर्ष पर कोशिकाओं से युक्त 44% घनत्व ढाल centrifugation मीडिया के 5 मिलीलीटर। धीमी गति के लिए pipettor का सेट, और शंक्वाकार ट्यूब की दीवार के साथ पिपेट जगह करने के लिए सुनिश्चित करें। हिला नहीं सावधान रहना बाधित, या ढाल पलटना।
  4. सबसे कम सेटिंग करने के लिए सेट त्वरण, सेंट्रीफ्यूज संतुलित है, यकीन है कि आरटी पर 20 मिनट के लिए 931 XG पर ढाल ब्रेक छुड़ाना, और सेंट्रीफ्यूज।
  5. Centrifugation के बाद, ध्यान सेंट्रीफ्यूज से ढाल हटाने, और धीरे ईमानदार ट्यूब पकड़े प्रयोगशाला बेंच करने के लिए परिवहन। एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को 44% और 67% घनत्व ढाल centrifugation मीडिया और हस्तांतरण के इंटरफेस में सेल परत को हटा दें। इंटरफ़ेस दिखाई नहीं देता है, तो बस 67% -44% सीमा पर तरल के बारे में 2 मिलीलीटर हटा दें।
  6. बौद्धिक अत्याधुनिक से कोशिकाओं से युक्त शंक्वाकार ट्यूब भरें2% 1x ठंडा पीबीएस में FBS, 350 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, और सतह पर तैरनेवाला छानना साथ rface।
    नोट: पाचन कदम 37 डिग्री सेल्सियस पर कर रहे हैं और घनत्व ढाल centrifugation मीडिया कदम आरटी पर कर रहे हैं, क्योंकि यह कोशिकाओं को ठंडा किया जा सकता है कि पहली बार है / ठंडा रखा। प्रकोष्ठों एक 1 में resuspended जा सकता है: 1 Trypan नीले कमजोर पड़ने और मायने रखता है और व्यवहार्यता जानकारी इस बिंदु पर प्राप्त किया जा सकता है।

6. अवरुद्ध और धुंधला प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए

  1. ब्लॉक FcγRII / गैर विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला को रोकने के लिए कोशिकाओं पर तृतीय रिसेप्टर्स। विसंयुग्मित बाध्य करने के लिए CD16 / 32 (2.4G2) के खिलाफ एंटीबॉडी और ब्लॉक FcγRII / तृतीय रिसेप्टर्स की: 100 कमजोर पड़ने यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए, 1 से युक्त 2% FBS के साथ पीबीएस में एंटीबॉडी मास्टर घोला जा सकता है।
  2. CD3ɛ (145-2C11), सीडी 4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b (एम 1/70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 (खिलाफ एंटीबॉडी की उचित मास्टर घोला जा सकता है के साथ अवरुद्ध कोशिकाओं को सेते 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (एमईएल-14), और घातक-6G / Ly-6C (जीआर 1) (RB6-8C5), और साथ ही बहुत खूब वायलेट 510 लाइव / मृत दाग मृत कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। कमजोर पड़ने निर्माताओं द्वारा सिफारिश या पहले से शोधकर्ताओं द्वारा अनुकूलित पर सभी एंटीबॉडी का उपयोग करें। : 100 कमजोर पड़ने यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए, 1 पर सभी एंटीबॉडी का उपयोग करें।
  3. 2% FBS के साथ 50 μl 1X पीबीएस धुंधला बफर में कोशिकाओं और resuspend धो लें। प्रतिदीप्ति डेटा कोशिकामापी एक प्रवाह पर प्राप्त किया जा सकता जब तक बर्फ पर रखें।
    नोट: यह मुआवजा मापदंडों के प्रतिदीप्ति डेटा के अधिग्रहण से पहले एक लसीकावत् ऊतक और (सीडी 4 या सीडी 8) की तरह एक आम कोशिका की सतह प्रतिजन के साथ पहले से अनुकूलित होना बहुत जरूरी है।
  4. , Cytometry विश्लेषण बहाव के प्रवाह के लिए कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि दाग कोशिकाओं की पूरी नमूनों से डेटा प्राप्त करने के लिए।

7. नीचे उल्लिखित चरणों को पूरा करने के लिए मानक तरीकों का उपयोग फ्लो डेटा का विश्लेषण

  1. आगे बिखराव की लिम्फोसाइट क्षेत्र पर सबसे पहले, गेटपक्ष तितर बितर (क्षेत्र) साजिश से (क्षेत्र)।
  2. फिर, दोहरी का विश्लेषण करने से बचने के लिए पक्ष तितर बितर (चौड़ाई) से आगे तितर बितर (चौड़ाई) का उपयोग कर एकल कक्षों का चयन करें। यह भी पक्ष तितर बितर ऊंचाई साजिश से एक आगे तितर बितर ऊंचाई के साथ पूरा किया जा सकता है।
  3. फिर, वंश पर फाटक (CD11b, CD11c, और CD45R / B220) -negative और CD3 पॉजिटिव घटनाओं, बाहर करने के लिए मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं, और बी कोशिकाओं, क्रमशः, और लक्ष्य है कि अगर सीमित, टी सेल डिब्बे का विश्लेषण करती है, यह यहाँ है, के रूप में टी कोशिकाओं में घुसपैठ का आकलन करने के लिए।
  4. इसके बाद, लाइव / मृत दाग को बहिष्कृत कि जीवित कोशिकाओं पर गेट।
  5. अंत में, ब्याज की सेल की आबादी पर फाटक (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें)।

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Representative Results

कोलेजिनेस डी मीडिया का इलाज नियंत्रण की तुलना में जब splenocytes टी कोशिकाओं पर CD4 और CD8 α के समान स्तर दिखाने का इलाज किया
सबसे पहले, टी सेल सबसेट पर वंश और सक्रियण मार्कर की आवृत्ति और सतह बहुतायत पर कोलैजिनेज़ डी के किसी भी संभावित प्रभाव के लिए एक नियंत्रण के रूप में माध्यमिक लसीकावत् ऊतक का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया। Splenocytes के निलंबन ND4 चूहों से प्राप्त और HBSS मीडिया के साथ 1 घंटे के लिए धोया गया था। (उपरोक्त धारा 4 में वर्णित है) इसके बाद, आधा कोशिकाओं / एमएल Collagenase डी 0.7 मिलीग्राम के अधीन है। शेष कोशिकाओं नियंत्रण HBSS के मध्यम में resuspended थे। इसके बाद, दोनों splenocyte अंशों ऊपर धारा 5 में वर्णित के रूप में एक घनत्व centrifugation ढाल का उपयोग संसाधित किया गया। कोशिकाओं तो सतह CD4 और CD8α के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग, और प्रवाह पर विश्लेषण किया गया। एकल, जीना, CD45 +, गैर टी वंश - (B220 - CD11b -CD11c -), CD3ɛ + कोशिकाओं बी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, वृक्ष के समान कोशिकाओं को बाहर करने के लिए, विश्लेषण के लिए gated थे। कोशिकाओं और 30% सीडी 4 - - CD4 और CD8α प्रोटीन समान रूप से विकास पाचन collagenase के अधीन किया गया था और उन लोगों के लगभग 60% सीडी 4 + CD8α साथ एंजाइम को उजागर नहीं किया गया था कि splenocytes की सतह पर पाया गया CD8α + कोशिकाओं या तो उपचार के साथ पाया ( चित्रा 1 ए)। इसलिए, कोलैजिनेज़ डी डाइजेस्ट CD4 और CD8α के सापेक्ष आवृत्ति को प्रभावित नहीं किया। इन कैंपेन्स पर सतह CD4 और CD8α ज्यामितीय मतलब प्रतिदीप्ति इकाइयों (gMFI) की तीव्रता भी दो उपचार के बीच बराबर थे; सीडी 4 के लिए gMFI मूल्यों नियंत्रण splenocytes के लिए एंजाइम का इलाज और 2243 में क्रमश: के लिए 2271 में थे, और CD8α के लिए gMFI मूल्यों के लिए 536 थे एंजाइम का इलाज और नियंत्रण splenocytes के लिए 520। Enzymatic उपचार भी टी सेल सक्रियण की सतह घनत्व पर कोई प्रभाव नहीं सी मार्करों थासीडी 4+ टी कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) पर D44 या CD62L। CD44 के लिए ज्यामितीय मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों के लिए 669 थे नियंत्रण splenocytes के लिए एंजाइम का इलाज और 654; CD62L के लिए gMFI मूल्यों के लिए 1523 थे नियंत्रण splenocytes के लिए एंजाइम का इलाज और 1517। कोलेजिनेस डी पाचन अलग कक्षों पर सतह प्रोटीन की अखंडता को बरकरार रखता है, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल cytometry विश्लेषण बहाव के प्रवाह के लिए विश्वास के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।

एंजाइम पाचन और उच्च सेलुलर व्यवहार्यता में पार्श्व त्वचा कोशिकाओं के परिणामों की ढाल शुद्धि
ऊपर प्राप्त सेल निलंबन के सेल उपज और प्रतिशत व्यवहार्यता Trypan ब्लू डाई बहिष्कार 20 का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया। यह पाचन और ढाल जुदाई प्रोटोकॉल बैल को चुनौती दी चूहों में पार्श्व ऊतक का मिमी 2 के बारे में प्रति 250 व्यवहार्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं और वाहन को चुनौती दी चूहों में ऊतक के 2 मिमी प्रति के बारे में 4 व्यवहार्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं झुकेंगेकि पहले से बैल (तालिका 1) के साथ अवगत थे।

एंजाइम पाचन और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मजबूत वसूली में पार्श्व त्वचा कोशिकाओं के परिणामों की ढाल शुद्धि
इसके बाद, त्वचा में प्रतिरक्षा घुसपैठ की हद तक बैल को चुनौती दी है और यहाँ वर्णित विधियों का उपयोग कर त्वचा घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की वसूली का आकलन करने के लिए चूहों पर नियंत्रण की ओर से अलग कक्षों पर CD45 सतह प्रोटीन की प्रचुरता का विश्लेषण करके निर्धारित किया गया था। CD45 अखिल hematopoietic वंश मार्कर 21 है। आगे कम और पक्ष बिखराव, एकल कक्षों का 95% बैल को चुनौती दी चूहों में (नहीं दिखाया gating) और वाहन को चुनौती दी नियंत्रण में इन कोशिकाओं के 71% लाइव CD45 + कोशिकाओं (चित्रा 2) थे। घुसपैठ CD45 + प्रतिरक्षा कोशिकाओं में एक ~ 67 गुना वृद्धि के साथ साथ वर्णित प्रक्रिया (तालिका 1) का उपयोग 3 दैनिक बैल चुनौतियों निम्नलिखित पार्श्व त्वचा में पाया गया था।

तीन पार्श्व बैल चुनौतियों टी कोशिकाओं और जीवाणुओं का स्पष्ट घुसपैठ का परिणाम
हमारी तकनीक ऐसी जीआर -1 न्यूट्रोफिल 22, सीडी 4 टी कोशिकाओं और CD8α टी कोशिकाओं के रूप में माइलॉयड और लसीकावत् सेल सबसेट की एक किस्म का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पार्श्व त्वचा से एक सेल की आबादी झुकेंगे। हम 7 गुना ~ 6 गुना, ~ मनाया, और ~ न्यूट्रोफिल में 73 गुना बढ़ जाती है, सीडी 4 टी कोशिकाओं, और CD8α टी कोशिकाओं, क्रमश: 3 दैनिक बैल चुनौतियों (तालिका 1) के बाद। हम प्राप्त व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या से गुणा करके इन बढ़ जाती गणना प्रवाह cytometric विश्लेषण के दौरान व्यवहार्य कोशिकाओं गेट के बाहर दिया प्रतिरक्षा सेल टुकड़ा प्रतिशत से (Trypan नीले बहिष्कार का उपयोग कर गिना)। हम तो हमें दे रही है, वाहन नियंत्रण चूहों के लिए इसी नंबर से बैल इलाज चूहों में व्यवहार्य कुल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या, जीआर -1, सीडी 4 +, या CD8α + कोशिकाओं विभाजितलिम्फोसाइट सबसेट में बढ़ जाती गुना। CD11b - - CD11c - बैल इलाज चूहों में कोशिकाओं और EtOH इलाज चूहों में इस आबादी का 10% जीआर -1 न्यूट्रोफिल एकल, लाइव CD45 + B220 का 42% के लिए जिम्मेदार (चित्रा 2 बी)। बैल इलाज चूहों में, ~ गेटेड CD3 + टी कोशिकाओं के 52% CD8α + और ​​~ थे 34% थे सीडी 4+, वाहन नियंत्रण में, ~ टी कोशिकाओं की 9% CD8α + थे और 57% थे, जबकि सीडी 4 + (चित्रा -2) । तकनीक यहाँ वर्णित के साथ इसलिए, एलर्जी और गैर एलर्जी पार्श्व त्वचा प्रतिरक्षा सेल सबसेट घुसपैठ के उच्च संकल्प प्रवाह cytometric लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त एकल कक्ष निलंबन की उपज के लिए कार्रवाई की जा सकती।

माउस पार्श्व त्वचा से कोशिकाओं सबसेट बैल / बैल (3) बैल / EtOH (3) विस्तार गुना (बैल / ईthanol)
मिमी 2 टिशू प्रति
कोशिकाओं की कुल संख्या 262.7 5.3 49.3
CD45 + प्रतिरक्षा कोशिकाओं 250.7 3.8 66.7
सीडी 4 + सीडी 8 - कोशिकाओं 6.5 0.9 7.2
सीडी 4 - सीडी 8 + कोशिकाओं 10.6 0.1 72.9
न्यूट्रोफिल 8.6 1.5 5.6

टेबल ND4 मादा चूहों में एलर्जी की दिशा त्वचा से 1. सेल पैदावार। पार्श्व त्वचा से अलग व्यवहार्य कोशिकाओं आज़ादी प्रति जमा कोशिकाओं को अलग त्वचा के क्षेत्र और चूहों की संख्या के आधार पर / 2 मिमी ऊतक Trypan ब्लू बहिष्कार का उपयोग कर गिना, और सामान्यीकृत थेतैयारी के खिलाफ मुकदमा। हम वंश विशेष सतह मार्करों के आधार पर रक्त कोशिका की सतह पर प्रतिजन CD45, और लिम्फोसाइट सबसेट पैदावार का पता लगाने के आधार पर कुल प्रतिरक्षा सेल उपज की गणना की। हम तो हमें लिम्फोसाइट सबसेट में बढ़ जाती गुना दे रही है, वाहन चूहों पर नियंत्रण के लिए संख्या से बैल इलाज चूहों में कोशिकाओं की संख्या से विभाजित। दिखाया गया डेटा इलाज के प्रति 2-3 चूहों से जमा डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं, और दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं।

आकृति 1
Splenocytes की चित्रा 1. एंजाइम पाचन और ढाल शुद्धि लिम्फोसाइट कैंपेन्स और सेल सक्रियण मार्कर रक्षा करता है। Splenocytes कोलैजिनेज़ डी या HBSS मीडिया अकेले और मलबे और लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए एक घनत्व ढाल का उपयोग कर शुद्ध के साथ या तो incubated HBSS मीडिया के साथ 1 घंटे के लिए धोया। टी कोशिकाओं (B220, CD11b, CD11c), CD45 + लाइव वंश के रूप में पहचान की गई <sup> -, और CD3ɛ +। CD4 और CD8α टी कोशिकाओं की आवृत्ति enzymatic पाचन (ए) के बाद भी नहीं बदला। सीडी 4+ टी कोशिकाओं पर CD44 और CD62L की सतह घनत्व enzymatic पाचन (बी) के बाद भी नहीं बदला। दिखाया गया डेटा एक ही प्रयोग से इलाज के प्रति 2-3 चूहों से डेटा जमा का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 एंजाइम पाचन और त्वचा कोशिकाओं की ढाल शुद्धि allergen को चुनौती दी माउस पार्श्व त्वचा बनाम नियंत्रण में विशिष्ट प्रतिरक्षा घुसपैठ का पता चलता है। तीन पार्श्व बैल चुनौतियों पहले से अवगत ND4 स्विस चूहों में त्वचा घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं (में एक ~ 67 गुना वृद्धि का उत्पादन ए)। तीन बैल चुनौतियों का भी provजीआर -1 न्यूट्रोफिल (बी) में एक ~ 6 गुना वृद्धि oked, और ~ 73- और CD8α + और ​​सीडी 4+ टी कोशिकाओं में क्रमश: (सी) के ~ 7 गुना वृद्धि हुई है। लाइव CD45 + प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एकल आगे कम और पक्ष तितर बितर कोशिकाओं से gated हैं; CD11b - - CD11c - B220 से गेटेड न्यूट्रोफिल और टी कोशिकाओं को लाइव एकल कक्षों। ढाल घनत्व जुदाई के बाद एक Trypan नीले रंग घोला: गिनता एक 1 का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। दिखाया गया डेटा प्रत्येक उपचार समूह में 2-3 चूहों से डेटा जमा है, और दो ​​स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ऐसे atopic जिल्द की सूजन या सोरायसिस के रूप में त्वचा रोगों के कृंतक मॉडल में त्वचा निवासी ल्यूकोसाइट्स में परिवर्तन निस्र्पक भड़काऊ सेल बाढ़ और रोग विकृति के बीच यंत्रवत कनेक्शन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ हम सबसे जैव चिकित्सा अनुसंधान प्रयोगशालाओं में पाया बुनियादी उपकरणों के साथ त्वचा के ऊतकों से ल्यूकोसाइट्स को अलग-थलग करने के लिए एक किफायती तकनीक का वर्णन है। यह अपेक्षाकृत तेजी से तकनीक प्रयोगशाला बेंच पर समय पर हाथों जबकि कम से कम संसाधनों के संरक्षण के लिए मदद, महंगा ऊतक हदबंदी मशीनों और कस्टम ट्यूब और अभिकर्मकों के उपयोग से बचा जाता है। कोमल एंजाइमी पचाने और असंतत ढाल जुदाई उपकला कोशिकाओं और मलबे, और अलग कक्षों के बहुमत के प्रवाह cytometric विश्लेषण, सेल छँटाई, स्थानांतरण, सेल संस्कृति और इन विट्रो उत्तेजना assays में सहित बहाव के अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हटा दें। कोलेजिनेस डी के साथ enzymatic डाइजेस्ट टी कोशिका की सतह मार्कर अखंडता, और preser पर कोई प्रभाव नहीं हैVes सेल व्यवहार्यता। इस प्रोटोकॉल आसानी से पार्श्व के अलावा अन्य क्षेत्रों से त्वचा पर कार्रवाई करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

त्वचा की कटाई करते समय इस प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं 1) अच्छी तरह से किसी भी वसा और संयोजी ऊतक को हटाने, 2) हैंडलिंग और प्रसंस्करण ऊतक तेजी से ध्यान), कोशिका मृत्यु को कम से कम 3) धीरे ढाल लेयरिंग, जबकि सेल उपज घुसपैठ को अधिकतम, और 4 को ढाल के इंटरफेस निकालने। एक बड़े पैमाने पर प्रयोग शुरू करने से पहले यह घनत्व ढाल centrifugation मीडिया लेयरिंग और इंटरफ़ेस हटाने का अभ्यास करने के लिए महत्वपूर्ण है। भी इसे देख और बीच इंटरफेस को निकालने के लिए बहुत आसान है 1X पीबीएस धुंधला बफर में एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से एक पूरी murine तिल्ली कुचल और चरण 5 में ऊपर वर्णित के रूप घनत्व ढाल के प्रदर्शन से एक असंतत घनत्व ढाल से कटाई कोशिकाओं अभ्यास कर सकते हैं 44% घनत्व ढाल centrifugation मीडिया और सपा का उपयोग कर 67% घनत्व ढाल centrifugation मीडियाकारण वर्तमान प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बड़ी संख्या के lenocytes।

घनत्व ढ़ाल के साथ काम करते हैं, बुलबुले जबकि pipetting से बचा जाना चाहिए, और ढाल अवरोधों को कम से कम किया जाना चाहिए। ढाल युक्त शंक्वाकार ट्यूब धीरे संभाला और हर समय खड़ी आयोजित किया जाना चाहिए। घनत्व ढाल centrifugation मीडिया समाधान हमेशा आरटी पर होना चाहिए, ध्यान से ख़ाली ब्रेक के साथ कम त्वरण के लिए सेट धीमी संभव रिहाई की गति, आरटी पर बनाए रखा सेंट्रीफ्यूज, करने के लिए सेट, और सीरम वैज्ञानिक pipettors कताई से पहले संतुलित। घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स की कम संख्या उपज है कि त्वचा की तैयारी के साथ काम कर रहे हैं, कोशिकाओं हमेशा ढाल इंटरफेस में दिखाई नहीं देते हैं। इस प्रकार, यह इंटरफेस आसानी से कोशिकाओं की एक परत रीति से नहीं किया जा सकता, तब भी जब कल्पना की जा सकती है, ताकि HBSS फिनोल लाल युक्त के साथ 44% घनत्व ढाल centrifugation मीडिया बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, यह कोमल, लेकिन निकालने जब स्विफ्ट, वाशिंग होना जरूरी हैत्वचा HBSS के मीडिया में रखा गया है और इससे पहले कि त्वचा के ऊतक प्रसंस्करण कोशिका मृत्यु से बचने के लिए।

सेल व्यवहार्यता या पवित्रता कम है, तो कम (~ 20 मिनट) पाचन बार, अधिक पतले ऊतक क़ीमा कोलैजिनेज़ डी (~ 0.5 मिलीग्राम / एमएल), या थोड़ा कम सांद्रता मददगार हो सकती है। ओवर-पाचन और ऊतकों का क्षरण कोशिका मृत्यु के लिए योगदान कर सकता है, क्योंकि जांचकर्ताओं को एक बड़ा पर्याप्त सेल नमूने का आकार 17 में प्रावधान है कि कम से कम पाचन समय का अनुकूलन करने की आवश्यकता होगी। प्रक्रिया संभावना तकनीक का मानकीकरण करने के लिए व्यक्तिगत जांचकर्ताओं के हाथ में अनुकूलन के कई दौर की आवश्यकता होगी। कोलेजिनेस विकास गतिविधियों के स्तर का भी इस्तेमाल किया एंजाइम से प्रत्येक के लिए बहुत कुछ किया जाना है जाएगा विनिर्माण बहुत सारे और पाचन समय के लिए समायोजन के बीच भिन्न हो सकते हैं। अनुकूलन के दौरान, यह प्रतिरक्षा सेल लिन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक विश्वसनीय लाइव / मृत दाग के साथ कदम को पचाने के साथ और एक enzymatic बिना शुद्ध दाग संदर्भ सेल निलंबन (जैसे तिल्ली) के लिए महत्वपूर्ण हैEage मार्कर (जैसे CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, आदि) सेल आबादी और ब्याज की सतह मार्कर ऊतक पाचन प्रक्रिया के माध्यम से संरक्षित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करना। यदि संभव हो तो, यह है कि आगे उपाय कर सकते हैं और पक्ष तितर बितर चौड़ाई या ऊंचाई के साथ ही क्षेत्र, सेल समुच्चय बाहर करने के लिए एक प्रवाह cytometer पर अनुकूलन प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी है। अन्त में, सेल निलंबन व्यवहार्यता का दृश्य मूल्यांकन और सामान्य सेलुलर आकृति विज्ञान के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जानी चाहिए। कोशिकाओं को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे या गिनती के मनकों का उपयोग कर एक प्रवाह cytometer पर 0.4% Trypan ब्लू डाई बहिष्कार का उपयोग कर मैन्युअल गिना जा सकता है। Excised ऊतकों में विशेष सेल प्रकार के और अधिक कड़े मात्रा का ठहराव की आवश्यकता है कि पढ़ाई के लिए, शोधकर्ताओं का वजन या पहले और पाचन के बाद ऊतक टुकड़े की मात्रा को मापने, और अधिक सही ऊतक किया जा रहा है में मौजूद सेल सबसेट की संख्या का अनुमान लगाने के पाचन की हद तक उपयोग कर सकते हैं विश्लेषण किया।

इस की एक सीमाप्रोटोकॉल यह विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की शुद्धि के लिए अनुकूल है कि है। एक अलगाव, शुद्धि, और एक अन्य सेलुलर आबादी (जैसे त्वचा उपकला कोशिकाओं) के विश्लेषण में रुचि है, घनत्व ढाल सेट-अप और enzymatic प्रोटोकॉल संभावना जरूरत के दोनों संशोधित और सबसे अच्छा ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जाना होगा पचाने। हालांकि, इस प्रोटोकॉल दोनों लसीकावत् और माइलॉयड सेल सबसेट के अलगाव और शुद्धि के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार सबसे प्रतिरक्षात्मक आवेदन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एक और सीमा इस प्रोटोकॉल डर्मिस बनाम त्वचा की एपिडर्मिस घुसपैठ सेल आबादी के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। भेदभाव के इस स्तर को पूरा करने के लिए, इस प्रोटोकॉल आगे enzymatically डर्मिस अलग करने के लिए अतिरिक्त कदम के साथ अनुकूलित किया जाना है और पहले या बजाय यहां उल्लिखित चरणों के epidermis होगा। इधर, नमूने के लिए यह कठिन बना मल्टी पैरामीटर प्रवाह cytometric विश्लेषण की सुविधा के लिए ~ 3 चूहों से जमा कर रहे हैंजैविक प्रतिकृति के बीच परिवर्तनशीलता का पता लगाने। हालांकि, चुनाव के बहाव के आवेदन के आधार पर, इस प्रोटोकॉल आसानी से उपज और उपयोग के नमूने एकल विषयों से संशोधित किया जा सकता है। अंत में, प्रोटोकॉल यहाँ युवा के लिए प्रस्तुत किया है, ND4 मादा चूहों शोधकर्ताओं की जरूरतों के हिसाब से अलग अलग उम्र, लिंग या स्ट्रेन के चूहों के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है।

सारांश में, कोमल एंजाइमी के इस संयोजन को पचाने और असंतत ढाल जुदाई चूहों में सूजन त्वचा के घावों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एक सरल, प्रभावी और किफायती तरीका प्रदान करता है। यह प्रयोग किया जाता है और प्रतिरक्षा घुसपैठ का आकलन और बहाव के अनुप्रयोगों के लिए ल्यूकोसाइट्स का एक शुद्ध, व्यवहार्य आबादी को अलग-थलग करने के लिए एक सुविधाजनक उपकरण के रूप में त्वचा विकृतियों के कृंतक मॉडल की एक विविध रेंज भर में मोटे तौर पर रूपांतरित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए वित्तीय या अन्य हितों कोई है।

Acknowledgements

राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (डीसी के लिए एनआईएच R15 NS067536-01A1), राष्ट्रीय Vulvodynia एसोसिएशन (डीसी के लिए पुरस्कार), और Macalester कॉलेज इस काम का समर्थन किया। सीबी अर्नोल्ड और माबेल बैकमैन फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित Macalester कॉलेज बैकमैन विद्वान कार्यक्रम, से एक फैलोशिप प्राप्त किया। BTF और टीएम JDRF 2-2011-662 द्वारा समर्थित हैं। हम तकनीकी सलाह के लिए डॉ जेसन Schenkel और डॉ जुलियाना लुईस का शुक्र है, और उनकी मदद और समर्थन के लिए Chatterjea प्रयोगशाला के सभी वर्तमान और पूर्व सदस्य हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid Sigma Aldrich 55021C Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma Aldrich H3375
EDTA disodium salt solution Sigma Aldrich E7889 Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select MidSci S01520HI Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) Sigma Aldrich P1644 Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201  Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one Sigma Aldrich E0753-10G Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) Tonbo Biosciences 70-0161 Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) Becton Dickinson 564378 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) eBioscience 47-0042-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8α-BV785 (53-6.7) BioLegend 100749 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) eBioscience 48-0112-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418) eBioscience 48-0114-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7) Becton Dickinson 563971 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11) Tonbo Biosciences 35-0451-U025 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) eBioscience 48-0452-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) BioLegend 104431 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) BioLegend 108407 Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510 Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa Becton Dickinson N/A Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum Roche Applied Science 11088858001 Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice Harlan 0-32 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. 

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References

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