Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota
Published 1/25/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Benck, C. J., Martinov, T., Fife, B. T., Chatterjea, D. Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation. J. Vis. Exp. (107), e53638, doi:10.3791/53638 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Kontakt dermatit, egzama, sedef hastalığı, selülit, melanom dışı cilt kanserleri için mantar enfeksiyonları ve apseler arasında değişen cilt koşulları dünya çapında 50 en yaygın hastalıklar arasında olduğu tespit edildi ve 2010 yılında 1 ölümcül olmayan hastalıkların dördüncü önde gelen global neden olur. Buna göre, çeşitli cilt patolojilerin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaların araştırılması araştırma gerekli ve etkin bir alandır. Kemirgen modellerinde, atopik dermatit 2, sedef hastalığı 3 ya da Staphylococcus aureus enfeksiyonu 4 gibi enflamatuar cilt hastalıklarının anlaşılması son derece yararlı olmuştur. Fare deri dokusunun enzimatik sindirimi için, ucuz, etkili ve basit bir protokol daha iyi cilt hastalıklarının patofizyolojisi anlamak için alt çeşitli uygulamalar için kullanılabilir hücre preparatları sağlayabilir. Burada, basit ve ekonomik bir yöntem, sıçan derisine enzimatik sindirimi için açıklanandoku ve hücre kültürü, in vivo adoptif transfer için kullanılabilecek cilt süzücü lökositlerin izolasyonu, sitometrik analizi ve ayırma ya da gen ifade etüdlerinde akar. Bu prosedürün genel amacı, tipik olarak, özel reajan takımına ve mekanik dissociators ile ilişkili maliyetlerin en aza düşürülmesini yüksek hücre canlılığı cilt nüfuz eden lökositler için tek bir hücre süspansiyonu hazırlamaktır.

Mevcut cilt dokusu ayrılma yöntemleri 5-7 düşük hücre canlılığı ve yüzey işaretleyici bütünlüğü neden veya özel enzim kitleri ve pahalı doku ayrılma makineleri 8-11 gerektirebilir. Fare kulak cilt dokusunun sindirim makul 12-13 yaygın yüksek keratinize deri dokusu sindirim ise (örneğin zayıf) hücresel olmayan kalıntı büyük miktarda kirlenmiş hücre hazırlama neden olabilir. Yeni bir çalışmada, Zeyd ve arkadaşları 2.5 mg 90 dakika fare böğür cildi sindirilmiş / ml dispase, Follo3 mg / ml kollajenaz 7 45 dakika ile evli. Başka bir çalışmada, araştırmacılar, bu tripsin / EDTA, kolajenaz III kullanımı da dahil olmak üzere, 2.5 saat bir araya sindirimi ile birden inkubasyon kullanılan ve 5 dispaz. Farklı üreticilerin tripsin ile tedavi ölçülebilir memeli hücreleri 14-15 hücre yüzey proteinlerinin bütünlüğünü etkilediği gösterilmiştir gibi tripsin kullanımı enzimatik cilt sindirimi için tavsiye edilmez. Buna ek olarak, dispaz, CD4 ve CD8α T hücrelerinin çoğalma yetenekleri üzerinde önemli etkilere sahip olabilir ve örneğin CD62L 16 ortak T lenfosit aktivasyonu da dahil olmak üzere, en az 20 moleküllerinin yüzey bolluk etkiler. Diğer protokoller sindirim ortamında 6 RPMI 1640 kullanır. Bununla birlikte, RPMI Mg + 2 ve Ca + 2 varlığı detaylı yuvar toplanmasını 17 neden olabilir.

Doku ayrışma için ideal bir protokol, yüksek hücre canlılığı, düşük hedeflemelidirHücre toplama ve en az zarar seviyesi hücre yüzeyine. Yüksek kaliteli lenf nodu stromal hücre preparatları kısa enzim inkubasyon, Ca 2 + ve Mg 2 + ücretsiz medya kullanımı protokoller ile gerçekleştirilir ve tripsin önlemek ve 18 dispase oylandı. Bununla birlikte, bu tip protokolleri bütün sıçan derisine ayrışması için tesis edilmemiştir.

Burada, bir protokol, ayrışır izole ve alerjen-fare meydan yan yüz derisinden deri süzücü lökositlerin zenginleştirmek için tarif edilmektedir. Kısaca, deri kesilir sindirimi için doku yumuşatmak ve herhangi bir fazla ölü deri ya da yağlı doku kaldırmak için 1 saat süre ile,% 10 fetal bovin serumu içeren Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde önceden inkübe edilir. Bu 0.7 mg ile 30 dakika enzimatik sindirim aşaması izlemektedir / ml kollajenaz D kollajenaz D yapma, en az hücre yüzeyi markerlerinin yoğunluğu üzerindeki etkileri ve in vitro 16,18 T hücresi çoğalması üzerinde bir etkisi yokturyüzey proteinleri karakterizasyonu içeren uygulamalar için son derece uygundur. Enzimatik sindirim takiben, aralıklı yoğunluk gradyan santrifüj tek hücre süspansiyonu epitel hücreleri ve atıklar giderilmiştir ve hematopoietik hücrelerin zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. Önemli olarak, bu prosedür pahalı sütunlara göre manyetik hücre ayrıştırma reaktifler ve doku ayrılma makineleri 8-11 önler ve bir bazik biyomedikal araştırmalar laboratuarında bulunan ekipman ve malzeme ile yapılabilir. Aşağıda, bu protokolü (19 uyarlanmıştır) önceden duyarlılaştırılmış ND4 İsviçre farelerinde hapten oksazolon (Ox) ile yan yüz derisinden meydan üç kez lökositleri izole etmek için kullanılmıştır. Hücreler çok parametrik akış sitometri kullanılarak analiz edildi. Bu teknik, minimum enkaz ve sitometri etkilenen sk fazla miktarda T lenfositleri ve nötrofiller infiltrasyonu ölçmek için çok parametre akış sitometrisi ile analiz edilmiştir izole edilmiş lenfositlerin>% 95 canlılık ile bir hücre süspansiyonu elde edildiiçinde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: geleneksel gıda ve suya serbest erişim ile yer 8-12 haftalık dişi ND4 Swiss Webster fareleri, bu çalışmalar için kullanılmıştır (B13S1) deneysel protokol kullanılır; Macalester College IACUC tarafından onaylandı..

Oksazolon ile 1. Hassasiyet ve Mücadelesi

  1. Gün 0
    1. 4 L kapaklı cam kavanoz dibinde örgü altına yerleştirilen emici havlu 3 ml izofluran ekleyerek anestezi odasına hazırlayın. Denek uyuşturulduktan kadar burada kullanılan ND4 dişi fareler için, odasında süresi 30-60 sn; fare suşu kullanılan anestezik yönetimini optimize edin.
    2. Her anestezi farenin sırtını Tıraş ve bir hayvan saç düzeltici kullanarak kanadını.
  2. 1.gün
    1. Mutlak etanol içinde 4-etoksimetilen-2-fenil-2-oksazolin-5-on (Ox) içindeki bir% 2 solüsyonu yapmak ve bir inkübatör içerisinde dönen bir plaka üzerinde 15 dakika boyunca 50 ° C'de inkübe edin.
    2. Kısaca uyutmak1.1.1 açıklanan ve yaklaşık 20 ul her birkaç seri uygulamalar geri traş% 2 Ox 100 ul uygulamak olarak izofluran anestezi ile fareler. Kuru çözelti seri uygulamalar arasında 5-10 saniye bekle.
    3. Arka dışındaki bölgelerde% 2 Öküz çözümü dökülmesini önlemek ve uygulamalar arasında kurumasını çözüm beklemek için özen gösterin.
  3. Gün 5-7
    1. Mutlak etanol (Ox) bir% 1 çözeltisi olun ve bir inkübatör içerisinde dönen bir plaka üzerinde 15 dakika boyunca 50 ° C'de inkübe edin.
    2. Nazikçe ama sıkı yukarı bakacak şekilde karın boyun ve kuyruk tabanı ense de fare hareketsiz ve boyun hafifçe (intraperitoneal enjeksiyon için bir beklemeye benzer) aşağıya doğru eğik ve birkaç seri uygulamalarda traş kanadını% 1 Ox 100 ul uygulamak Yukarıda tarif edildiği gibi zaman alan daha sonra kuru cilt.
    3. Kontrol fareleri için, traş turta mutlak etanol araç 100 ul geçerlidirk.

2. Kanat Cilt Hasat

  1. Karbon dioksit inhalasyonu ile fareler Euthanize, ve dikkatli bir şekilde 10 cm, cerrahi makas ile cenah derinin (~ cilt 25 mm x 25 mm) istenen alanı tüketim.
  2. Temiz, keskin cerrahi bıçak kullanarak, gögüs cilt aşırı yağ ve bağ dokusu kazınması.
  3. Kalsiyum ya da magnezyum, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), olmadan fenol kırmızısı 10 mi RT HBSS [ihtiva eden bir 50 mL konik tüp içine 3 fareden cenah cilt 3 parçalarını yerleştirin 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1 piperazinetansülfonik asit (HEPES), ve% 10 cenin sığır serumu (FBS)].

3. Ön sindirim Doku Yıkama

  1. 37 ° C 'de muhafaza edilen bir kuru, gazı alınmış kuluçka makinesi içinde 30 dakika için bir döner levha üzerine deri parçacıklarını ihtiva eden bir yer tüpü.
  2. İnkübasyon süresinin sonunda, kuvvetli bir şekilde 10 saniye vorteksleyin.
  3. 70 um ve tüp içeriğini süzünsüzgeç yıkama tamponu atmak ve doku toplamak. Tek bir süzgeç, bir biyolojik tedavi grubu içinde tüm işlem boyunca yeniden kullanılabilir.
  4. Forseps bir çift kullanılarak, (yukarıda tarif edildiği gibi EDTA, HEPES ve FBS ihtiva eden) taze RT HBSS ortam 10 ml içeren, yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp içine süzgeçten cenah deri aktarın.
  5. Doku Ortalama bir alanında yaklaşık 2.2 mm x 2.2 mm olacak şekilde bir tüp içine daldırılmış bir cerrahi kesme makası bir 12.5 cm çifti ile, cenah derinin her parça kıyma.
  6. 37 ° C 'de muhafaza edilen bir kuru, gazı alınmış kuluçka makinesi içinde 30 dakika için bir döner levha üzerine deri parçacıklarını ihtiva eden bir yer tüpü.
  7. İnkübasyonun sonunda, kuvvetli bir şekilde 10 saniye vorteksleyin

Derinin 4. kollajenaz sindirimi

  1. , 70 mikron süzgecinden tüpün içeriğini süzün toplamak ve yeni bir 50 ml konik içeren tüp 10 ml fre içine gögüs deri parçalarını aktarmaksh, RT HBSS ortam 0,7 mg ile takviye / D kolajenaz ml
  2. 37 ° C 'de muhafaza edilen bir kuru, gazı alınmış kuluçka makinesi içinde 30 dakika için bir döner plaka sindirim orta ve deri parçacıklarını ihtiva eden bir yer tüpü.
  3. İnkübasyonun sonunda, kuvvetli bir şekilde 10 saniye için tüpün vorteks içeriği.
  4. Yeni 50 ml konik tüp içine 70 mikron süzgecinden tüpün Filtre içeriği; sindirilmiş doku içeren Flow-through tutmak ve süzgeci atmak ve cilt enkaz kanadını.
  5. 350 g'da 5 dakika için HBSS ortamı, santrifüj 50 ml akış yoluyla yıkayın ve süpernatant süzün.

5. Yoğunluk Gradient Santrifüj

  1. Serolojik bir pipet kullanarak, her bir örnek için, yeni bir 15 ml'lik konik bir tüp içine 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 3 mi% 67 RT yoğunluk gradyan santrifüj ortamı eklenir.
  2. Fenol kırmızısı ile HBSS 5 ml RT% 44 yoğunluk gradyan santrifüj medya hücre pelletini.
  3. Centilmenly tabakası serolojik bir pipet kullanarak 67% yoğunluk gradyan santrifüj ortam numunesi üzerine hücreleri ihtiva eden% 44 yoğunluk gradyan santrifüj ortamı 5 mi. Yavaş hıza pipet ayarlayın ve konik tüp duvar boyunca pipet yerleştirmek için emin olun. , Sallamak için dikkatli olun bozabilir veya degrade ters çevirin.
  4. En düşük ayara hızlanma, santrifüj dengeli olduğundan emin olduktan oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 931 xg'de degrade frenini boşa ve santrifüj.
  5. Santrifüj işleminden sonra, dikkatlice santrifüj degrade kaldırmak ve yavaşça dik tüp tutan laboratuar tezgah ulaşım. Bir 5 ml'lik plastik transfer pipeti kullanarak, yeni bir 15 ml'lik konik tüpe 44 ve% 67,% yoğunluk gradyan santrifüj ortam transfer arayüzünde hücre tabakasını çıkarın. Arabirim görünmüyorsa, sadece% 67 -44% sınırında sıvının yaklaşık 2 ml kaldırın.
  6. Entegrasyon hücreleri içeren konik tüp doldurun% 2 1X buz soğukluğunda PBS FBS, 350 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri ve süpernatant süzün ile rface.
    Not: sindirim adım 37 ° C 'de ve yoğunluk gradyan santrifüj ortam adım oda sıcaklığında olduğundan bu hücreler soğutulabilir ilk defa / soğuk tutulur. Hücreler 1 içinde yeniden süspanse edilebilir: 1 tripan mavisi seyreltme ve sayısı ve canlılığı bilgileri bu noktada elde edilebilir.

6. Engelleme ve Boyama Akış Sitometrik Analizi

  1. Blok FcyRII / non-spesifik antikor lekelenmesini önlemek için hücreleri III reseptörleri. Konjuge olmayan bağlanma CD16 / 32 (2.4G2) karşı antikor ve bir blok FcyRII / III reseptörlerinin 100 seyreltme: Burada tarif edilen deneyler için, 1 ihtiva eden% 2 FBS içeren PBS antikor ana karışımları yapmak.
  2. CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 (karşı antikorların uygun ana karışımları ile bloke hücreleri inkübe 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) ve Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), hem de parlak mor 510 ölü / canlı leke ölü hücreleri tanımlamak için. Seyreltme üreticileri tarafından tavsiye edilen veya daha önce araştırmacılar tarafından optimize bütün antikorları kullanın. 100 seyreltme: Burada tarif edilen deneyler için, 1 tüm antikorlar kullanılır.
  3. % 2 FBS ile 50 ul 1X PBS tampon boyama hücreleri ve tekrar süspansiyon yıkayın. Floresan verileri bir akış sitometresinde elde edilebilir kadar buz üzerinde tutun.
    Not: dengeleme parametreleri floresans veri edinimi önce lemfoid doku ve (CD4 ya da CD8'e gibi), ortak bir hücre yüzey antijeni ile önceden iyileştirilmiş olması önemlidir.
  4. , Sitometri analizi alt akış hücre sayısını arttırmak boyanmış hücrelerin tüm numunelerden veri elde etmek için.

7. Aşağıda belirtilen adımları Tamamladılar standart metodlar kullanılarak Sitometrisi Verileri Analiz

  1. Ileri dağılım lenfosit bölgeye Birincisi, kapıyan dağılım (bölge) arsa göre (bölge).
  2. Ardından, çiftleri analiz önlemek için yan dağılım (genişlik) ileri dağılım (genişlik) kullanarak tek hücre seçin. Bu aynı zamanda, yana saçılım yüksekliği noktalaması ile ileri saçılma yüksekliği ile gerçekleştirilebilir.
  3. Daha sonra, soyu üzerindeki kapısı (CD11b, CD11c, CD45R ve / B220) artı ve CD3-pozitif olaylar, dışlamak için makrofajlar, dendritik hücreler ve B hücreleri, sırasıyla, ve hedef ise, confine, T hücre bölmesine analizleri, Burada olduğu gibi, T hücrelerinin infiltre değerlendirmek.
  4. Sonraki canlı / ölü leke hariç, canlı hücreler üzerinde kapısı.
  5. Son olarak, ilgi hücre popülasyonu üzerinde kapısı (temsilcisi sonuçları bölümüne bakınız).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kollajenaz D ortam ile muamele edilmiş kontrol grubu ile karşılaştırıldığında splenositler T hücreleri üzerindeki CD4 ve CD8 a benzer seviyelerde göstermektedir tedavi
İlk olarak, T hücre alt üzerinde soy ve aktivasyon belirteçlerinin sıklığı ve yüzey bolluk kollajenaz D olası etkileri kontrol olarak ikincil lenfoid doku kullanılarak değerlendirildi. Splenositlerin bir süspansiyon ND4 farelerden elde edilen ve HBSS ortamı ile 1 saat boyunca yıkandı. (Yukarıdaki bölüm 4'te tarif edildiği gibi), sonra, yarım hücre / ml kollajenaz D 0.7 mg tabi tutuldu. Kalan hücreler kontrol HBSS ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi. Daha sonra, her iki splenosit fraksiyonlar yukarıdaki bölüm 5'de tarif edildiği gibi, bir yoğunluk santrifüj gradyanı kullanılarak işlenmiştir. Hücreler daha sonra yüzeyi CD4 ve CD8α karşı antikorlar ile boyanmış ve akış sitometresi üzerinde analiz edilmiştir. Tek, canlı, CD45 +, non-T soyu - (B220 - CD11b -CD11c -), CD3ɛ + hücreleri B hücrelerini, makrofajları, dendritik hücreleri hariç, analiz için geçitlendi. Hücreleri ve% 30 CD4 - - CD4 ve CD8α proteinleri eşit D sindirim kollajenaz uğradığını ve bu yaklaşık% 60 CD4 + CD8α ile enzim maruz olmasaydı splenositlerin yüzeyinde tespit edildi CD8α + hücreleri ya tedavi ile tespit ( Şekil 1A). Bu nedenle, kollajenaz D sindirmek CD4 ve CD8α göreceli sıklığını etkilemedi. Bu alt-yüzey CD4 ve CD8α geometrik ortalama floresan üniteleri (gMFI) yoğunlukları da iki tedavi arasında karşılaştırılabilir; CD4 gMFI değerleri kontrol splenositler enzim ile muamele edilmiş ve 2243 için sırasıyla 2271 idi ve CD8α için gMFI değerleri için 536 idi, enzim ile muamele edilmiş ve kontrol splenosit 520. Enzimatik tedavinin T-hücresi aktivasyonunun yüzey yoğunluğunun hiçbir etkisi C belirteçleriCD4 + T hücreleri (Şekil 1B) üzerine D44 ya da CD62L. CD44 için geometrik ortalama floresan yoğunluğu değerleri için 669 idi kontrol splenositler enzim ile muamele edilmiş ve 654; CD62L için gMFI değerleri için, 1523 idi kontrol splenositler enzim ile muamele edilmiş ve 1517. Kollajenaz D sindirim izole hücreler üzerindeki yüzey proteinlerini, bütünlüğünü koruyan gibi, burada açıklanan protokol sitometri analizi alt akış için güvenle kullanılabilir.

Enzim sindirim ve yüksek hücresel canlılığı gögüs deri hücreleri sonuçlarının degrade arıtma
Yukarıda elde edilen hücre süspansiyonu, hücre verimi ve yüzde canlılığı, tripan mavi boyasıyla tutulmasına 20 kullanılarak değerlendirildi. Bu sindirim ve degrade ayırma protokolü Ox-meydan farelerde cenah dokusunun mm 2 başına yaklaşık 250 canlı bağışıklık hücrelerini ve araç-meydan farelerde doku mm 2 başına yaklaşık 4 canlı bağışıklık hücrelerini vermiştirdaha önce Ox (Tablo 1) ile hassaslaştırılmıştır.

Enzim sindirim ve bağışıklık hücrelerinin sağlam kurtarma gögüs deri hücreleri sonuçlarının degrade arıtma
Daha sonra, deri immün infiltrasyonu ölçüde Ox-meydan burada tarif edilen yöntemler kullanılarak deri nüfuz eden bağışıklık hücreleri kurtarma değerlendirmek için kontrol farelerinin bacak eteği izole hücreler üzerindeki CD45 yüzey proteini miktarını analiz ile tespit edildi. CD45 bir pan-hematopoetik soy işaretleyici 21'dir. İleri ve düşük yan dağılım, tek hücreler 95% Ox farelerde görülen (gösterilmemiştir yolluk) ve araç-yükleme yapılmış kontrollerde bu hücrelerin% 71 canlı CD45 + hücreleri (Şekil 2) idi. Infiltre CD45 + bağışıklık hücrelerinde A ~ 67 kat bir artış, burada tarif edilen prosedür (Tablo 1) kullanılarak 3 gün Ox zorlukları, aşağıdaki yan yüz derisinde tespit edildi.

Üç böğür Öküz zorluklar T hücrelerinin ve nötrofillerin belirgin infiltrasyonu sonucu
Bizim teknik, Gr-1 +, nötrofillerin 22, CD4 T hücreleri ve T hücreleri gibi CD8α myeloid ve lenfoid hücre alt çeşitli tespit etmek için kullanılabilir dış yan yüz derisinden bir hücre popülasyonu bulunmuştur. Bu 7-kat ~ 6-kat, ~ gözlendi ve ~ nötrofillerde 73-kat artışlar, CD4 T hücrelerinin ve CD8α T hücreleri, sırasıyla, 3 günlük Ox zorlukları (Tablo 1), aşağıdaki. Biz elde edilen canlı hücrelerin toplam sayısı çarpılarak bu artışlar hesaplanan akım sitometri analizi sırasında canlı hücreler kapıdan verilen bağışıklık hücre fragmanı oranında (Tripan mavisi dışlanma kullanılarak sayılır). Daha sonra bize veren bir araç kontrol fareleri için ilgili sayı ile Ox-ile tedavi edilmiş farelerde canlı toplam immün hücrelerin sayısını, Gr-1 +, CD4 + ya da CD8α + hücreleri ayrılmıştırlenfosit alt artışları katlayın. CD11b - - CD11c - Ox-ile tedavi edilmiş farelerde hücrelerin ve EtOH ile muamele edilmiş farelerde, bu popülasyonda% 10 Gr-1 +, nötrofiller, tek canlı CD45 + B220% 42 oluşturmaktadır (Şekil 2B). Ox ile tedavi edilen farelerde, ~ kapı CD3 + T hücrelerinin% 52 CD8α + ve • edildi% 34 idi CD4 + araç kontrol grubuna, T hücrelerinin% 9 CD8α + ve% 57 iken, CD4 + (Şekil 2C) . Burada anlatılan teknik, ile, bu nedenle, alerjik ve alerjik olmayan dış yan yüz deri immün hücre alt infiltre yüksek çözünürlüklü akış sitometrik karakterizasyonu için uygun tek hücre süspansiyonları vermek üzere işlenebilir.

Fare dış yan yüz derisinden hücreleri alt takımlarının Öküz / Ox (3) Ox / EtOH (3) Genişletme katlayın (Öküz / E-metanol)
aa 2 dokuya
Hücre sayısı 262,7 5.3 49.3
CD45 + hücreleri, bağışıklık 250,7 3.8 66.7
CD4 + CD8 - hücreleri 6.5 0.9 7.2
CD4 - CD8 + hücreleri, 10.6 0.1 72.9
Nötrofiller 8.6 1.5 5.6

Tablo ND4 dişi farelerde alerjik cenah deriden 1. Hücre verimleri. Dış yan yüz derisinden izole edilen Canlı hücreler tis başına toplanmış hücrelere izole deri bölgesine ve fare sayısına göre / mm2 doku mavi Tripan çıkışı kullanarak sayıldı ve normalize edildihazırlık dava. Bu seri spesifik yüzey belirteçleri göre hematopoietik hücre yüzeyi üzerinde bir antijen CD45 ve lemfosit alt-küme verimlerinin tespitine dayanan toplam immün hücre verimi hesaplanmıştır. Bunun üzerine, lenfosit subsetlerinde kat artış veren araç kontrol fareleri için numaralarıyla Ox-ile tedavi edilmiş farelerde hücrelerin sayısı ayrılır. Gösterilen veriler, tedavi başına 2-3 fareden elde edilen verileri temsil etmektedir ve iki bağımsız deneyin temsilcisidir.

figür 1
Splenositlerin Şekil 1. Enzim sindirim ve gradyan saflaştırma lenfosit alt grupları ve hücre aktivasyonu işaretleri korur. Splenositler kolajenaz D veya HBSS ortam, tek başına ve enkaz ve kırmızı kan hücreleri çıkarmak için, bir yoğunluk gradyanı kullanılarak saflaştınldı, ya kuluçkaya HBSS ortamı, 1 saat süre ile yıkandı. T hücreleri (B220, CD11b, CD11c), CD45 +, canlı soy olarak tespit edildi <sup> - ve CD3ɛ +. CD4 ve CD8α T hücrelerinin frekansı enzimatik sindirimi (A) sonra değişmedi. CD4 + T hücreleri üzerinde CD44 ile CD62L yüzey yoğunluğu enzimatik sindirimi (B) Aşağıdaki değişmemiştir. Gösterilen veriler, tek bir deneyden elde tedavi başına 2-3 fareden verileri toplanmış temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Enzim sindirim ve deri hücrelerinin degrade arıtma alerjen meydan fare kanat deri vs kontrolünde belirgin bağışıklık infiltrasyon ortaya koyuyor. Üç böğür Öküz zorlukları önceden duyarlı ND4 İsviçreli farelerde deri-infiltre bağışıklık hücreleri (bir ~ 67 kat artış üretmek A). Üç Öküz zorluklar da provGr-1 + nötrofil (B) 'de bir p 6-katlık bir artış oked ve ~ 73- ve CD8α + ve CD4 + T hücreleri, sırasıyla, (C)' nin ~ 7-katlık bir artış. Canlı CD45 + bağışıklık hücreleri, tek ileri ve düşük yan dağılım hücrelerinden kapılı; CD11b - - CD11c'nin - B220 den kapılı nötrofiller ve T hücreleri canlı tek hücreler. Degrade yoğunluk ayırma takip eden 1 Tripan mavi seyreltme: Sayımlar 1 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gösterilen veriler, her tedavi grubunda 2-3 fareden verileri toplanmış ve iki bağımsız deneyler temsilcisi olan temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Atopik dermatit veya sedef hastalığı gibi deri hastalıklarının, kemirgen modellerinde deri lökositlerin değişiklikleri karakterize enflamatuar hücre influksu ve hastalık patolojisi arasında mekanik bağlantılar anlamak için önemlidir. Burada en biyomedikal araştırma laboratuvarlarında bulunan temel donanımları ile cilt dokusundan lökosit izole etmek için ekonomik bir tekniği açıklar. Bu nispeten hızlı bir tekniktir laboratuarlarında zamanında eller en aza indirerek kaynaklarını korumak için yardımcı pahalı doku ayrılma makineleri ve özel tüpler ve reaktiflerin kullanımını önler. Yumuşak enzimatik sindirimi ve süreksiz gradyan ayırma epitel hücreleri ve döküntü ve izole edilmiş hücrelerin çoğunluğu akış sitometrik analizi, hücre sınıflandırılması; transferi, hücre kültürü ve in vitro stimülasyon deneyler de dahil olmak üzere alt çeşitli uygulamalar için kullanılabilir çıkarın. Kollajenaz D enzimatik sindirimi T hücresi yüzey işaretleyici bütünlüğü ve preser üzerinde hiçbir etkisi yokturves hücredeki mevcudiyetini göstermektedir. Bu protokol, kolayca kanadını dışındaki bölgelerde cildin işlemek için modifiye edilebilir.

Cildi hasat sırasında bu prosedürün en kritik adımlar vardır 1) iyice herhangi yağ ve bağ dokusu çıkarılması, 2) taşıma ve işleme doku hızla dikkatle), hücre ölümünü minimize 3) yavaşça degrade katman ise hücre verimi en üst düzeye çıkarmak sızan ve 4 degrade arayüzü ayıklanan. Büyük çaplı bir deney başlamadan önce, yoğunluk gradyanlı santrifüj ortam katmanlarını ve arayüz kaldırma uygulama için önemlidir. Bir Bu görmek arasında arayüz çıkarmak için çok daha kolaydır 1X PBS lekeleme tampon maddesi içinde 70 mikron süzgecinden bütün bir sıçangil dalak ezme ve adım 5'te tarif edildiği gibi yoğunluk gradyanı gerçekleştirerek süreksiz yoğunluk gradyanı hasat hücreleri uygulama olabilir % 44 yoğunluk gradyan santrifüj medya ve sp kullanarak% 67 yoğunluk gradyan santrifüj medyanedeniyle, bu bağışıklık hücrelerinin çok sayıda lenocytes.

Yoğunluk geçişlerini çalışırken, kabarcıklar ise pipetlenmesini kaçınılmalıdır ve degrade aksamalar minimize edilmelidir. Degrade içeren konik tüp hafifçe ele ve her zaman dik tutulmalıdır. Yoğunluk degrade santrifüj medya çözümleri hep oda sıcaklığında olmalıdır dikkatle devre dışı frenli düşük ivme ayarlanmış yavaş mümkün bırakma hızı, oda sıcaklığında muhafaza santrifüj, ayarlanır ve serolojik pipetör iplik önce dengeli. Infiltre lökositler az sayıda elde cilt hazırlıkları ile çalışırken, hücreler her zaman gradyan arayüzünde görünmez. Bu nedenle, bu arayüzü kolayca bir hücre tabakası ayırt edilemez bile görselleştirilebilir böylece HBSS fenol kırmızısı içeren% 44 yoğunluk gradyan santrifüj ortamı yapmak için önemlidir. Ayrıca, nazik ama çıkartırken hızlı yıkama olmak önemlidirCilt HBSS medyada yerleştirilmeden önce ve cilt dokusunu işleme hücre ölümünü önlemek için.

Hücre canlılığı ve saflıkta düşük ise, daha kısa (~ 20 dakika), sindirim kez daha ince doku kıyma kolajenaz D (~ 0.5 mg / ml) ya da biraz daha düşük konsantrasyonlarda yararlı olabilir. Aşırı sindirim ve doku bozulması hücre ölümüne katkıda bulunabilir, çünkü araştırmacılar yeterince büyük bir hücre örneklem büyüklüğü 17 sağlayan minimal sindirim süresini optimize etmek gerekir. Süreç muhtemelen tekniği standardize etmek, bireysel araştırmacıların elinde optimizasyonu birkaç tur gerektirecektir. Kollajenaz D aktivite seviyesi de kullanılan enzimin her bir lot için yapılmış gerekecek üretim çok ve sindirim zaman ayarlamalar arasında değişebilir. Optimizasyon esnasında, bağışıklık hücresi lin gibi güvenilir bir ölü / canlı leke ayak sindirimi ile, bir enzimatik olmaksızın daha çok arıtılabilir leke referans hücre süspansiyonları (örneğin dalak) için önemlidireage belirteçleri (örneğin CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, vb) hücre popülasyonları ve ilgi yüzey belirteçleri doku sindirim sürecinde korunur emin olmak için. Eğer mümkünse, o ileri ölçebilir ve yan dağılım genişliği veya yüksekliği yanı sıra bölge, hücre agrega dışlamak bir akış sitometresinde optimizasyonlar gerçekleştirmek için yardımcı olur. Son olarak, hücre süspansiyonları canlılığı görsel değerlendirme ve genel hücresel morfoloji için ışık mikroskobu altında incelenmelidir. Hücreler ışık mikroskobu altında veya sayım boncuklar kullanarak bir akış sitometresinde% 0.4 Tripan Mavi boya dışlanma kullanarak elle sayılabilir. Eksize dokusunda spesifik hücre tiplerinin daha sıkı miktarının gerektiren çalışmalarda, araştırmacılar tartmak ya da daha önce ve sindirim sonra doku parçalarının hacmini ölçmek ve daha doğru doku varlık mevcut hücre alt sayıları tahmin etmek sindirim ölçüde kullanabilir analiz edilmiştir.

Bu bir sınırlamaprotokolü özellikle bağışıklık hücrelerinin saflaştırılması için uyarlanmış olmasıdır. Tek izolasyon, saflaştırma ve başka hücresel nüfus (örneğin deri epitel hücreleri) analizinde ilgilenen varsa, yoğunluk gradyan set-up ve enzimatik protokolü muhtemel ihtiyaç hem de modifiye ve en iyi ilgi hücreleri izole etmek için optimize edilmesi olacaktır sindiremez. Bununla birlikte, bu protokol, hem lenfoid ve miyeloid hücre alt izolasyonu ve saflaştırılması için izin verir ve böylece en immünolojik uygulamalara uyarlanabilir. Başka bir sınırlama bu protokol dermis vs cildin epidermis infiltre hücre popülasyonu ayırt etmek kullanılamaz olmasıdır. Farklılaşma bu seviyede gerçekleştirmek için, bu protokol daha enzimatik dermis ayırmak için ek adımlar ile adapte olmak zorunda ve önce veya burada yerine özetlenen adımlar epidermis olacaktır. Burada, örnekler güçleştirir çok parametreli akış sitometrik analizi kolaylaştırmak için ~ 3 fareden birleştirilmişsebiyolojik çoğaltır arasındaki değişkenliği algılar. Bununla birlikte, tercih edilen alt-uygulamaya bağlı olarak, bu protokol, kolayca elde ve kullanım örnekleri, tek deneklerden için modifiye edilebilir. Son olarak, protokol burada genç sunulan ND4 dişi fareler araştırmacıların ihtiyaçlarına göre farklı yaşlarda, cinsiyet veya soyların fareler için modifiye edilmesi gerekebilir.

Özet olarak, yumuşak enzimatik bu kombinasyon sindirimi ve süreksiz gradyan ayırma farelerde inflamatuar deri lezyonları immün hücrelerin saflaştırılması bir basit, etkili ve ekonomik bir yöntem sağlar. Kullanılan ve bağışıklık infiltrasyonu değerlendirmek ve aşağı doğru uygulamalar için lökositlerin saf, uygun bir popülasyonu izole etmek üzere uygun bir araç olarak deri patolojilerin kemirgen modellerinde çeşitli bir aralığı boyunca büyük ölçüde adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek mali ya da diğer çıkarları hiçbir var.

Acknowledgements

Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH DC R15 NS067536-01A1), Ulusal Vulvodini Derneği (DC ödül) ve Macalester College bu işi destekledi. CB Arnold ve Mabel Beckman Vakfı tarafından finanse Macalester College Beckman Scholars Programı, bir burs aldı. BTF ve TM JDRF 2-2011-662 tarafından desteklenmektedir. Biz teknik danışmanlık Dr. Jason Schenkel ve Dr. Juliana Lewis teşekkür ve onların yardım ve destek için Chatterjea laboratuar tüm mevcut ve eski üyeleri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid Sigma Aldrich 55021C Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma Aldrich H3375
EDTA disodium salt solution Sigma Aldrich E7889 Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select MidSci S01520HI Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) Sigma Aldrich P1644 Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201  Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one Sigma Aldrich E0753-10G Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) Tonbo Biosciences 70-0161 Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) Becton Dickinson 564378 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) eBioscience 47-0042-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8α-BV785 (53-6.7) BioLegend 100749 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) eBioscience 48-0112-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418) eBioscience 48-0114-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7) Becton Dickinson 563971 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11) Tonbo Biosciences 35-0451-U025 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) eBioscience 48-0452-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) BioLegend 104431 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) BioLegend 108407 Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510 Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa Becton Dickinson N/A Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum Roche Applied Science 11088858001 Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice Harlan 0-32 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134, (6), 1-8 (2013).
  2. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133, (2), 303-315 (2013).
  3. Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127, (6), 1292-1308 (2007).
  4. Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
  5. Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
  6. Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199, (9), 1265-1275 (2004).
  7. Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, (14), 5307-5312 (2014).
  8. Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132, (7), 1869-1876 (2012).
  9. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
  10. Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
  11. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
  12. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, (6), 973-984 (2011).
  13. Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35, (4), 562-571 (2011).
  14. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (36), (2010).
  15. Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6, (1), 10-20 (2014).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
  18. Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
  19. Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8, (10), e78673 (2013).
  20. Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40, (9), 557-560 (2009).
  21. Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9, (10), 320-326 (1988).
  22. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83, (1), 64-70 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats