Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Immunology and Infection

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Benck, C. J., Martinov, T., Fife, B. T., Chatterjea, D. Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation. J. Vis. Exp. (107), e53638, doi:10.3791/53638 (2016).

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Abstract

Introduction

Doenças da pele que variam de dermatite de contato, eczema, psoríase, celulite, infecções fúngicas e abcessos para cânceres de pele não-melanoma foram encontrados para estar entre as 50 doenças mais prevalentes em todo o mundo, ea quarta causa líder global de doenças não fatais em 2010 1. Por conseguinte, a investigação dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes diversas patologias da pele é uma área de investigação activa e necessário. Modelos de roedores têm sido notavelmente útil na compreensão de condições inflamatórias da pele tais como dermatite atópica 2, 3 psoríase, ou infecção por Staphylococcus aureus 4. Protocolos de baixo custo, eficiente, simples e de digestão enzimática dos tecidos da pele do rato podem proporcionar preparações de células que podem ser utilizadas para uma variedade de aplicações a jusante para melhor compreender a fisiopatologia de doenças de pele. Aqui, um método simples e econômica é descrito por digestão enzimática da pele do ratode tecido e isolamento de leucócitos que se infiltram na pele que pode ser utilizado para cultura de células, in vivo, a transferência adoptiva, análise de citometria de fluxo e classificação ou estudos de expressão de genes. O objetivo geral deste procedimento é para preparar uma suspensão única célula de leucócitos infiltrantes da pele com a viabilidade celular elevada, minimizando os custos tipicamente associados a custom kits de reagentes e dissociadores mecânicos.

Métodos existentes de dissociação do tecido da pele 5-7 pode resultar em baixa viabilidade celular e da superfície integridade marcador, ou requerem kits de enzimas personalizadas e caras máquinas de dissociação tecido 8-11. Enquanto a digestão do tecido da pele da orelha rato é razoavelmente prevalente 12-13, digerindo o tecido da pele altamente queratinizadas (por exemplo, a partir do flanco) pode resultar em preparações de células contaminadas com grandes quantidades de detritos não celular. Em um estudo recente, Zaid e colegas digerido rato pele flanco, durante 90 minutos em 2,5 mg / ml dispase, folloconduzida por 45 min em 3 mg / ml de colagenase 7. Em outro estudo, estes investigadores usaram várias incubações com uma digestão combinada de 2,5 horas, incluindo a utilização de tripsina / EDTA, colagenase III, e dispase 5. A utilização de tripsina não é recomendado para a digestão enzimática da pele, como o tratamento com tripsina a partir de diferentes fabricantes, tem sido demonstrado que afecta de forma mensurável a integridade de proteínas da superfície celular em células de mamífero 14-15. Além disso, dispase pode ter efeitos significativos sobre a capacidade proliferativa das células CD4 e CD8u T e afetar a abundância de superfície de pelo menos 20 moléculas, incluindo T comum marcadores de ativação celular, como CD62L 16. Outros protocolos usar RPMI 1640 no meio de digestão 6. No entanto, a presença de Mg 2+ e Ca 2+ em RPMI pode causar agregação extensiva de células 17.

Um protocolo ideal para a dissociação do tecido deve apontar para a viabilidade celular elevada, baixoníveis de agregação das células, e o mínimo de danos para a célula proteínas de superfície. Alta qualidade preparações de células do linfonodo estromal ter sido realizado com protocolos que utilizam incubações enzimáticas mais curtos, Ca 2+ e Mg 2+ meios de comunicação livres e evitar tripsina e dispase 18. No entanto, não foram estabelecidas protocolos deste tipo para a dissociação da pele inteira do rato.

Aqui, é descrito um protocolo para dissociar, isolar e enriquecer leucócitos infiltrantes de pele desafiados com alergénio pele de ratinho flanco. Resumidamente, pele excisada é pré-incubada em Solução de Sal Equilibrada de Hank (HBSS) com 10% de soro fetal bovino durante 1 h para amaciar o tecido para a digestão e remover qualquer excesso de pele ou tecido gordo morto. Isto é seguido por um passo de 30 min de digestão enzimática com 0,7 mg / mL de colagenase D. colagenase D tem efeitos mínimos sobre a densidade de marcadores da superfície celular, e nenhum efeito sobre a proliferação de células T in vitro, 16,18, tornando-altamente adequados para aplicações que envolvem a caracterização de proteínas de superfície. A seguir à digestão enzimática, centrifugação descontínua de gradiente de densidade foi utilizada para remover as células epiteliais e os detritos a partir da suspensão de célula única e para enriquecer células hematopoiéticas. Importante, este procedimento evita os reagentes caros de separação baseados em colunas de células magnético e máquinas de dissociação de tecido 8-11, e pode ser realizada com equipamento e materiais encontrada num laboratório de investigação biomédica de base. Aqui este protocolo foi utilizado para isolar leucócitos de pele flanco desafiados três vezes com o hapteno de oxazolona (OX) em ratos previamente sensibilizados ND4 suíços (adaptado a partir de 19). As células foram analisadas utilizando citometria de fluxo multi-paramétrico. Esta técnica proporcionou uma suspensão de células com detritos mínima e> 95% de viabilidade de linfócitos isolados que foram analisadas por fluxo multiparamétrica de citometria de medir a infiltração de linfócitos T e de neutrófilos para o SK afectadadentro.

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Protocol

Nota: os ratos 8-12 semanas de idade do sexo feminino ND4 Swiss Webster, convencionalmente alojados com livre acesso a comida e água, foram utilizados para estes estudos O protocolo experimental utilizado (B13S1) foi aprovado pelo IACUC do Macalester College..

1. Sensibilização e Desafio com Oxazolona

  1. Dia 0
    1. Prepare a câmara de anestesia por adição de 3 ml de isoflurano para toalhas absorventes colocados por baixo da malha na parte inferior de um frasco de 4 L com tampa de vidro. Para os ratinhos fêmea ND4 usado aqui, o tempo na câmara é de 30-60 segundos até que o sujeito está adequadamente anestesiados; otimizar a administração do anestésico para a cepa do mouse está sendo usado.
    2. Raspar as costas de cada rato anestesiado e flanquear usando um aparador de pêlos do animal.
  2. Dia 1
    1. Adicione uma solução a 2% de 4-etoximetileno-2-fenil-2-oxazolin-5-ona (Ox) em etanol absoluto, e incuba-se a 50 ° C durante 15 min numa placa numa incubadora rotativa.
    2. Resumidamente anestesiarcamundongos, usando anestesia isoflurano, conforme descrito no ponto 1.1.1 e aplique 100 l de 2% Ox ao raspou de volta em várias aplicações em série de cerca de 20 mL cada. Espera 5-10 seg entre aplicações em série para que a solução seque.
    3. Tome cuidado para não derramar a solução 2% boi em outras regiões do que a parte de trás, e esperar que a solução para secar entre as aplicações.
  3. Dias 5-7
    1. Adicione uma solução de 1% (OX) em etanol absoluto, e incuba-se a 50 ° C durante 15 min numa placa numa incubadora rotativa.
    2. Gentil mas firmemente imobilizar o mouse na nuca do pescoço e base do rabo com abdômen virado para cima e pescoço ligeiramente inclinada para baixo (semelhante a uma espera por uma injecção intraperitoneal) e aplicam-se 100 ul de 1% do boi para o flanco raspada em várias aplicações em série e tendo o tempo necessário para secar a pele depois como descrito acima.
    3. Para ratinhos de controlo, aplicar 100 ml de etanol absoluto veículo para o flan raspadak.

2. Flanco Pele Colheita

  1. Eutanásia ratinhos utilizando dióxido de carbono inalação, e excisar cuidadosamente a área desejada da pele do flanco (~ 25 mm x 25 mm de pele) com 10 cm tesouras cirúrgicas.
  2. Usando uma lâmina cirúrgica limpo, afiado, raspar o excesso de gordura e tecido conjuntivo da pele do flanco.
  3. Colocar 3 pedaços de pele do flanco de 3 ratinhos em um tubo de 50 ml contendo 10 ml de HBSS RT [com vermelho de fenol, sem cálcio ou magnésio, 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazinoetanossulfónico (HEPES), e 10% de soro fetal de bovino (FBS)].

3. Pré-lavagem de tecidos digestão

  1. Colocar o tubo contendo os fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C.
  2. Vortex vigorosamente durante 10 seg, no final do período de incubação.
  3. Coe o conteúdo do tubo por meio de um 70 uMfiltro para descartar o tampão de lavagem e recolher o tecido. Um único filtro pode ser reutilizada durante todo o procedimento dentro de um grupo de tratamento biológico.
  4. Utilizando um par de pinças, transferir a pele do flanco do filtro para um novo tubo de 50 ml contendo 10 ml de fresco, meios RT (HBSS contendo EDTA, HEPES, e FBS como descrito acima).
  5. Com um par de 12,5 cm de tesouras de dissecção cirúrgica imersos no interior do tubo, mediu cada pedaço de pele do flanco de modo a que o pedaço de tecido média é de aproximadamente 2,2 mm x 2,2 mm na área.
  6. Colocar o tubo contendo os fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C.
  7. Vortex vigorosamente durante 10 seg, no final da incubação

4. A digestão de colagenase da pele

  1. Coe o conteúdo do tubo através de um filtro de 70 | iM, recolher e transferir os pedaços de pele do flanco para um novo tubo de 50 ml contendo 10 ml de freSH, meios RT HBSS suplementado com 0,7 mg / ml de colagenase D.
  2. Colocar o tubo contendo o meio de digestão e fragmentos de pele sobre uma placa rotativa durante 30 min numa incubadora não gaseificada seco mantida a 37 ° C.
  3. Conteúdo vórtice de tubo vigorosamente durante 10 seg, no final da incubação.
  4. Filtrar o conteúdo de tubo através de um filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml; manter o fluxo através contendo o tecido digerido e descartar o filtro e flanquear os restos da pele.
  5. Lavar o fluxo de passagem em 50 ml de meio HBSS, centrifuga-se durante 5 min a 350 g, e decanta-se o sobrenadante.

5. centrifugação em gradiente de densidade

  1. Usando uma pipeta serológica, adicionar 3 ml de RT 67% de gradiente de densidade de meios de centrifugação em 1X tampão fosfato salino (PBS) para um novo tubo de 15 ml para cada amostra.
  2. Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de RT 44% de densidade de meios de centrifugação em gradiente em HBSS com vermelho de fenol.
  3. CavalheiroLY camada de 5 ml da centrifugação em gradiente de densidade media de 44%, contendo as células na parte superior da centrifugação em gradiente de densidade de amostra media de 67%, utilizando uma pipeta serológica. Certifique-se de definir a pipeta para a velocidade mais lenta, e coloque a pipeta ao longo da parede do tubo cônico. Tenha cuidado para não agitar, perturbar, ou inverter o gradiente.
  4. Definir aceleração para a configuração mais baixa, desengatar o travão de, e centrifugar o gradiente a 931 xg durante 20 min à temperatura ambiente para garantir que a centrífuga é equilibrada.
  5. Após a centrifugação, retirar cuidadosamente o gradiente da centrífuga, e transportar gentilmente para a bancada do laboratório segurando o tubo na posição vertical. Usando uma pipeta de 5 ml de transferência de plástico, remover a camada de células na interface dos 44% e 67% de gradiente de densidade de meios de centrifugação e transferência para um novo tubo de 15 ml. Se a interface não é visível, basta remover cerca de 2 ml de líquido a 67% a -44% do limite.
  6. Encha o tubo cônico contendo células do interface com FBS a 2% em 1X PBS gelado, as células de centrifugação durante 5 minutos a 350 xg, e decanta-se o sobrenadante.
    Nota: Esta é a primeira vez que as células podem ser arrefecido / mantido frio desde passos de digestão são a 37 ° C e os passos de centrifugação de gradiente de densidade media são à TA. As células podem ser ressuspendidas numa solução 1: 1 de tripano azul e contagens de diluição e informação viabilidade pode ser obtido neste ponto.

6. Bloqueio e coloração para análise de citometria de fluxo

  1. Bloco FcyRII / receptores em células III para evitar coloração não específica de anticorpos. Para as experiências aqui descritas, tornar misturas principais de anticorpo em PBS com 2% de FBS contendo 1: 100 de diluição do anticorpo não conjugado contra CD16 / 32 (2.4G2) para se ligar e bloquear os receptores FcyRII / III.
  2. Incubar as células bloqueadas com misturas principais adequados de anticorpos contra CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8u (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), e Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), bem como violeta brilhante 510 ao vivo / morto mancha para identificar as células mortas. Use todos os anticorpos, quer a diluição recomendada pelos fabricantes ou previamente otimizado por pesquisadores. Para as experiências aqui descritas, utilizar todos os anticorpos de 1: 100 de diluição.
  3. Lave as células e ressuspender em 50 ul de tampão de coloração 1X PBS com 2% de FBS. Manter em gelo até que os dados de fluorescência pode ser adquirido num citómetro de fluxo.
    Nota: É importante ter parâmetros de compensação pré-optimizada com o tecido linfóide e um antigénio da superfície celular comum (como CD4 ou CD8) antes da aquisição de dados de fluorescência.
  4. Para aumentar o número de células por citometria de fluxo a jusante análise, a aquisição de dados a partir de amostras inteiras de células coradas.

7. Analisar Citometria de Fluxo de dados usando métodos padrão para realizar a passos descritos abaixo

  1. Primeiro, portão na região de linfócitos da dispersão para a frente(área) por dispersão lateral (área) enredo.
  2. Em seguida, selecione as células individuais usando a dispersão para a frente (largura) por dispersão lateral (largura), para evitar analisando parelhas. Isto também pode ser conseguido com uma altura de dispersão para a frente pela altura dispersão lateral trama.
  3. Então, portão na linhagem (CD11b, CD11c, e CD45R / B220) -negative e CD3-positivo eventos, para excluir macrófagos, células células dendríticas, e B, respectivamente, e confine análises para compartimento de células T, se o objetivo é, como é aqui, para avaliar as células T infiltrantes.
  4. Em seguida, portão em células vivas que excluem a vivo / morto mancha.
  5. Finalmente, portão à população de células de interesse (ver secção resultados representante).

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Representative Results

A colagenase D tratada esplenócitos mostram níveis semelhantes de CD4 e CD8 α em células T, quando comparado com controlos tratados com media
Em primeiro lugar, quaisquer efeitos potenciais de colagenase D sobre a frequência e abundância de superfície de linhagem e de ativação marcadores em subpopulações de células T foram avaliados utilizando tecido linfóide secundário como um controle. Uma suspensão de esplenócitos de ratos foi obtido ND4 e lavou-se durante 1 h com meio HBSS. Em seguida, metade das células submetidas a 0,7 mg / ml de colagenase D (tal como descrito na secção 4 acima). As restantes células foram ressuspensas em meio de controlo HBSS. Em seguida, ambas as frações esplenócitos foram processadas utilizando um gradiente de centrifugação de densidade, conforme descrito na Seção 5 acima. As células foram então coradas com anticorpos contra CD4 e CD8a superfície, e analisadas no citómetro de fluxo. Único, vivo, CD45 +, não-T linhagem - (B220 - CD11b -CD11c -), as células foram CD3ɛ + fechado para a análise, para excluir as células B, macrófagos, células dendríticas. Proteínas CD4 e CD8a foram igualmente detectado na superfície dos esplenócitos que tinha sido submetido a colagenase digestão D e os que não tinham sido expostos a enzimas com aproximadamente 60% ​​de CD4 + CD8a - células e 30% de CD4 - células CD8a + detectada quer com o tratamento ( Figura 1A). Portanto, colagenase D digest não afetou a freqüência relativa de CD4 e CD8u. As intensidades de superfície CD4 e CD8a unidades de fluorescência média geométrica (gMFI) nestes subconjuntos também foram comparáveis ​​entre os dois tratamentos; valores gMFI para CD4 foram 2,271 para tratados com enzima e 2243 para esplenócitos de controlo, respectivamente, e os valores gMFI para CD8a foram 536 para tratados com enzima e 520 para esplenócitos de controlo. Tratamento enzimático também não teve qualquer efeito sobre a densidade da superfície de marcadores de activação de células T CD44 ou CD62L nas células T CD4 + (Figura 1B). Valores de intensidade de fluorescência média geométrica para CD44 foram 669 para tratados com enzima e 654 para esplenócitos de controlo; valores gMFI para CD62L foram tratados com 1,523 para a enzima e 1517 para esplenócitos de controlo. Como digestão com colagenase D preserva a integridade de proteínas de superfície em células isoladas, o protocolo aqui descrito pode ser utilizado com confiança, para a análise de citometria de fluxo a jusante.

Digestão com enzimas de purificação e gradiente de pele flanco células resulta em alta viabilidade celular
Rendimento celular e viabilidade por cento da suspensão de células obtida acima foram avaliados utilizando exclusão com azul de tripano de corante 20. Este protocolo separação digestão e gradiente rendeu cerca de 250 células imunes viáveis ​​por mm 2 de tecido flanco em camundongos Ox-desafiados e cerca de 4 células imunes viáveis ​​por mm 2 de tecido em camundongos desafiados com veículoque foram previamente sensibilizados com Ox (Tabela 1).

Digestão com enzimas de purificação e gradiente de pele flanco células resulta na recuperação robusta de células imunitárias
Em seguida, a extensão de infiltração imune na pele foi determinada através da análise da abundância de proteínas de superfície de CD45 em células isoladas a partir do flanco de Ox-desafiado e ratinhos de controlo para avaliar a recuperação de células do sistema imunológico que se infiltram pele usando os métodos descritos aqui. CD45 é um marcador de linhagem hematopoiética pan-21. 95% de baixo para a frente e de lado de dispersão, as células individuais (gating não mostrado) em ratinhos desafiados-boi e 71% destas células nos controlos desafiados com veículo eram CD45 + células vivo (Figura 2). Foi detectado um aumento de ~ 67 vezes na infiltração de células CD45 + imunes na pele do flanco seguinte 3 desafios diárias boi, utilizando o processo aqui descrito (Tabela 1).

Três desafios flanco boi resultar em infiltração acentuada de células T e neutrófilos
A nossa técnica produziu uma população de células a partir da pele do flanco que poderia ser usado para detectar uma grande variedade de células mielóides e linfóides subconjuntos tais como Gr-1 + 22 neutrófilos, células T CD4 + e células T CD8a. Observamos ~ 6 vezes, 7 vezes ~, e ~ aumentos de 73 vezes na neutrófilos, células T CD4 + e células T CD8a, respectivamente, na sequência de 3 Ox desafios diários (Tabela 1). Foram calculados os aumentos multiplicando o número total de células viáveis ​​(exclusão de azul de contadas utilizando Trypan) por a percentagem de o fragmento de célula imune determinado para fora da porta de células viáveis ​​durante a análise de citometria de fluxo. Em seguida, dividiu o número de células viáveis ​​totais imunes, as células CD8a + Gr-1 +, CD4 +, ou nos ratinhos tratados com Ox pelos números correspondentes para os ratos de controlo do veículo, dandodobrar aumentos nos subgrupos de linfócitos. Gr-1 + neutrófilos representaram 42% de, CD45 + B220 único vivo - CD11b - CD11c - células em ratinhos tratados-boi e 10% desta população em ratinhos tratados com EtOH (Figura 2B). Em ratinhos tratados com boi, ~ 52% de células T CD3 + bloqueadas foram CD8a + e ~ 34% eram CD4 +, enquanto que em controlos de veículo, ~ 9% de células T foram CD8a + e 57% eram células CD4 + (Figura 2C) . Portanto, com a técnica descrita aqui, pele alérgica e não alérgica flanco pode ser processado para produzir suspensões de células individuais adequadas para alta-resolução caracterização de citometria de fluxo de infiltração de células imunes subconjuntos.

Células subconjuntos de pele do rato flanco Ox / Ox (3) Ox / EtOH (3) Dobre Expansão (Ox / EThanol)
por mm 2 de tecido
Número total de células 262.7 5.3 49,3
As células CD45 + imunes 250,7 3.8 66,7
CD4 + CD8 - 6.5 0,9 7.2
As células CD8 + - CD4 10,6 0,1 72,9
Os neutrófilos 8.6 1,5 5.6

Tabela 1. rendimentos celulares de pele flanco alérgica em camundongos fêmeas ND4. As células viáveis ​​isoladas da pele do flanco foram contadas utilizando exclusão com azul de tripano, e normalizado para células de tecido / mm 2, com base na área da pele isolada e o número de ratinhos agrupados por tissue preparação. Calculou-se a produção total de células imunes com base na detecção do antigénio CD45 hematopoiético na superfície da célula, e os rendimentos de subconjuntos de linfócitos com base em marcadores de superfície específica da linhagem. Em seguida, dividiu o número de células em ratinhos tratados-Ox pelos números de ratos de controlo do veículo, dando-nos dobrar aumentos nos subgrupos de linfócitos. Os dados apresentados representam dados combinados 2-3 ratos por tratamento, e são representativos de duas experiências independentes.

figura 1
Figura 1. enzima de digestão e purificação de gradiente de esplenócitos preservar subpopulações de linfócitos e marcadores de activação de células. Os esplenócitos lavada durante 1 h com meio HBSS, incubadas ou com colagenase D ou apenas meio HBSS e purificado utilizando um gradiente de densidade para remover detritos e células vermelhas do sangue. As células T foram identificadas como ao vivo, CD45 +, linhagem (B220, CD11b, CD11c) <sup> - e CD3ɛ +. Frequência de células CD4 e células T CD8a não se alterou após a digestão enzimática (A). Densidade de superfície de CD44 e CD62L em células T CD4 + não se alterou após a digestão enzimática (B). Os dados apresentados representam dados agrupados 2-3 ratos por tratamento de um único experimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. digestão com enzimas de purificação e gradiente de células da pele revelam infiltração imune distinta no controlo vs. desafiados de alergénio pele de ratinho flanco. Três desafios flanco Ox produzir um aumento de ~ 67 vezes em células imunitárias infiltrantes da pele em ratinhos previamente sensibilizados (ND4 suíços A). Três desafios do boi também provoked um aumento de ~ 6 vezes na Gr-1 + neutrófilos (B), e ~ 73- e ~ aumento de 7 vezes de células CD8a + e CD4 +, respectivamente (C). CD45 + células do sistema imunológico ao vivo são fechados a partir de células de dispersão de solteiro, de baixa para a frente e laterais; neutrófilos e células T fechado de B220 - CD11b - CD11c - células individuais ao vivo. As contagens foram realizadas usando um 1: 1 Trypan azul diluição após a separação em gradiente de densidade. Os dados mostrados representa dados agrupados 2-3 ratos em cada grupo de tratamento, e são representativos de duas experiências independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Caracterização alterações em leucócitos-pele residente em modelos de roedores de doenças da pele tais como dermatite atópica ou psoríase é importante para a compreensão de ligações mecânicas entre o influxo de células inflamatórias e a patologia da doença. Aqui nós descrevemos uma técnica econômica para isolar leucócitos de tecido da pele com equipamento básico encontrado na maioria dos laboratórios de pesquisa biomédica. Esta técnica relativamente rápida evita a utilização de máquinas de dissociação de tecidos caros e tubos personalizados e reagentes, ajudando a conservar os recursos, minimizando hands-on tempo na bancada do laboratório. Enzimático suave digerir e separação de gradiente descontínuo remover a maioria das células e detritos epiteliais, e as células isoladas podem ser utilizadas para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo a análise de citometria de fluxo, separação de células, a transferência, a cultura de células e em ensaios de estimulação in vitro. Digestão enzimática com colagenase D não tem efeito sobre T superfície celular integridade marcador, e presera viabilidade celular ves. Este protocolo pode ser facilmente modificado para processar tecidos de outras regiões de flanco.

Os passos mais críticos neste processo são 1) cuidadosamente remover qualquer adiposo e tecido conjuntivo durante a colheita da pele, 2) manipulação e tecido processamento rapidamente para maximizar a infiltração rendimento de célula enquanto minimiza a morte celular, 3) camadas suavemente o gradiente, e 4) cuidadosamente extracção da interface do gradiente. Antes de iniciar um experimento em grande escala é importante para a prática de densidade gradiente de centrifugação e remoção de camadas media interface. Pode-se praticar a colheita de células de um gradiente de densidade descontínuo, por trituração todo um baço murino através de um filtro de 70 | iM em tampão de coloração 1X PBS e realizando o gradiente de densidade, tal como descrito acima na etapa 5. É muito mais fácil de ver e extrai-se o interface entre o 44% mídia gradiente de densidade de centrifugação e os media 67% de densidade de gradiente usando splenocytes, devido ao grande número de células imunes presentes.

Quando trabalhando com um gradiente de densidade, de bolhas deve ser evitada durante a pipetagem, e perturbações do inclinação deve ser minimizado. O tubo cónico que contém o gradiente devem ser manuseados com cuidado, mantido verticalmente em todos os momentos. Soluções de mídia centrifugação de gradiente de densidade deve estar sempre à RT, pipetas serológicos definidos para a velocidade mais lenta possível libertação, a centrífuga mantida a RT, definida como baixa aceleração com o travão desengatado, e cuidadosamente equilibrado antes de girar. Quando se trabalha com preparações para a pele que produzem pequenas quantidades de leucócitos infiltrantes, as células não são sempre visíveis na interface do gradiente. Assim, é importante fazer a centrifugação em gradiente de densidade media de 44% com HBSS contendo vermelho de fenol de modo que a interface pode ser facilmente visualizado, mesmo quando uma camada de células não pode ser discernido. Além disso, é importante ser gentil, mas rápida ao extrair, lavageme processar o tecido da pele para evitar a morte de células antes de a pele é colocada nos meios de HBSS.

Se a viabilidade celular é baixa pureza ou, mais curto (~ 20 min) tempos de digestão, as concentrações ligeiramente mais baixas de colagenase D (~ 0,5 mg / ml), ou picagem do tecido mais finamente pode ser útil. Como sobre-digestão e degradação de tecidos pode contribuir para a morte da célula, investigadores terá de optimizar o tempo de digestão mínima que fornece um tamanho suficientemente grande amostra de células 17. O processo provavelmente vai exigir várias rodadas de otimização nas mãos de investigadores individuais de padronizar a técnica. Nível de actividade de colagenase D também podem variar entre os lotes de fabrico e adaptações tempo de digestão terá de ser feita para cada lote de enzima utilizada. Durante a otimização, é importante para as suspensões de células de referência (por exemplo mancha baço) purificados com e sem digestão enzimática com um passo vivo / morto mancha confiável, bem como célula imunológica linEAGE marcadores (por exemplo, CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, etc.) para certificar-se que as populações de células e marcadores de superfície de interesse são preservados durante o processo de digestão do tecido. Se possível, é útil para executar optimizações num citómetro de fluxo que pode medir a frente e a largura ou altura de dispersão lateral, bem como área, para excluir os agregados celulares. Por último, as suspensões de células devem ser examinadas sob o microscópio de luz para a avaliação visual de viabilidade e morfologia celular geral. As células pode ser contado manualmente, utilizando 0,4% de corante azul de tripano exclusão sob um microscópio de luz ou num citómetro de fluxo usando esferas de contagem. Para estudos que necessitam de quantificação mais rigorosa de tipos de células específicas no tecido excisado, os investigadores podem pesar ou medir o volume de fragmentos de tecido antes e após a digestão, e usar a extensão da digestão para estimar com mais precisão o número de subconjuntos de células presentes no ser tecidos analisada.

Uma limitação do presenteprotocolo é que é especificamente adaptada para a purificação de células do sistema imunológico. Se se está interessado em isolamento, purificação e análise de outra população celular (por exemplo, pele células epiteliais), o gradiente de densidade com a configuração e a digestão enzimática protocolo ambos provavelmente necessidade de ser modificado e optimizado para melhor isolar as células de interesse. No entanto, este protocolo permite o isolamento e purificação de ambos os subconjuntos de células linfóides e mielóides e pode assim ser adaptado para a maioria das aplicações imunológicas. Outra limitação é que este procedimento não pode ser utilizado para diferenciar entre as populações de células que se infiltram na derme contra a epiderme da pele. Para alcançar este nível de diferenciação, este protocolo teria que ser ainda adaptado com passos adicionais para separar enzimaticamente da derme e epiderme, antes de ou em vez dos passos descritos aqui. Aqui, as amostras são reunidas a partir de 3 ~ ratinhos para facilitar a múltiplos parâmetros de análise de citometria de fluxo o que torna difícildetectar variabilidade entre repetições biológicas. No entanto, dependendo da aplicação a jusante de escolha, este protocolo pode ser facilmente modificado para produzir e utilizar amostras de sujeitos individuais. Finalmente, o protocolo apresentado aqui para jovens, os ratos fêmeas ND4 podem precisar de ser modificados para ratinhos de diferentes idades, sexo ou estirpes de acordo com as necessidades dos investigadores.

Em resumo, esta combinação de digestão enzimática suave e separação descontínua de gradiente proporciona um método simples, eficaz e económico para a purificação a partir de células imunes lesões inflamatórias da pele em ratos. Ele pode ser usado e adaptado amplamente através de uma variada gama de modelos de roedores de patologias da pele como uma ferramenta conveniente para avaliar a infiltração imune e isolar uma população pura, de leucócitos viável para aplicações a jusante.

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Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros ou outros para divulgar.

Acknowledgements

Os Institutos Nacionais de Saúde (NIH R15 NS067536-01A1 para DC), a Associação Nacional Vulvodynia (prêmio para DC), e Macalester College apoiaram este trabalho. CB recebeu uma bolsa do Macalester College Beckman Scholars Programa, financiado pela Fundação Arnold e Mabel Beckman. BTF e TM são suportados por JDRF 2-2011-662. Agradecemos ao Dr. Jason Schenkel e Juliana Dr. Lewis para o conselho técnico, e todos os membros atuais e antigos do laboratório Chatterjea pela sua ajuda e apoio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid Sigma Aldrich 55021C Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma Aldrich H3375
EDTA disodium salt solution Sigma Aldrich E7889 Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select MidSci S01520HI Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) Sigma Aldrich P1644 Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201  Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one Sigma Aldrich E0753-10G Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) Tonbo Biosciences 70-0161 Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) Becton Dickinson 564378 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) eBioscience 47-0042-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8α-BV785 (53-6.7) BioLegend 100749 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) eBioscience 48-0112-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418) eBioscience 48-0114-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7) Becton Dickinson 563971 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11) Tonbo Biosciences 35-0451-U025 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) eBioscience 48-0452-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) BioLegend 104431 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) BioLegend 108407 Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510 Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa Becton Dickinson N/A Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum Roche Applied Science 11088858001 Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice Harlan 0-32 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. 

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References

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