Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

1Department of Biology, Macalester College, 2Department of Medicine, Division of Rheumatic and Autoimmune Diseases, Center for Immunology, University of Minnesota
Published 1/25/2016
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Immunology and Infection

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Benck, C. J., Martinov, T., Fife, B. T., Chatterjea, D. Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation. J. Vis. Exp. (107), e53638, doi:10.3791/53638 (2016).

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Abstract

Introduction

Hauterkrankungen, die von Kontaktdermatitis, Ekzem, Schuppenflechte, Zellulitis, Pilzinfektionen und Abszesse, um Nicht-Melanom-Hautkrebs wurden gefunden, um unter den 50 häufigsten Krankheiten weltweit zu sein, und die vierte weltweit führende Ursache für nicht-tödlichen Krankheiten im Jahr 2010 1. Dementsprechend ist die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen vielfältige Hautpathologien ist ein notwendiger und aktives Forschungsgebiet. Nagetiermodellen haben im Verständnis von entzündlichen Hautzuständen bemerkenswert nützlich gewesen wie atopische Dermatitis 2, Psoriasis 3 oder Staphylococcus aureus Infektion 4. Kostengünstige, effiziente und einfache Protokolle für die enzymatische Verdauung von Maushautgewebe kann Zubereitungen von Zellen, die für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen verwendet werden kann, um die Pathophysiologie von Haut Krankheiten besser zu verstehen. Hier ist ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur enzymatischen Spaltung von Mäusehaut beschriebenGewebe und die Isolierung von Haut infiltrierenden Leukozyten, die für die Zellkultur, in vivo adoptiven Transfer genutzt werden können, durchflusszytometrische Analyse und Sortierung oder Genexpressionsstudien. Das übergeordnete Ziel dieser Vorgehensweise ist, um eine Einzelzellsuspension aus haut infiltrieren Leukozyten mit hoher Zelllebensfähigkeit vorzubereiten, während die Kosten in der Regel mit eigenen Reagenzien-Kits und mechanische dissociators assoziiert zu minimieren.

Bestehende Hautgewebe Dissoziation Verfahren 5-7 können in geringen Zelllebensfähigkeit und Oberflächenmarker Integrität führen oder erfordern kundenspezifische Enzym-Kits und teuer Gewebedissoziation Maschinen 8-11. Während der Verdauung der Mausohr Hautgewebe ist recht verbreitet 12-13, Verdauen stark verhornte Hautgewebe (zB von der Flanke) in Zellpräparaten mit großen Mengen an nicht-Zelltrümmer kontaminiert führen. In einer aktuellen Studie, Zaid und Kollegen verdaut Maus Flankenhaut für 90 Minuten in 2,5 mg / ml Dispase, Follovon 45 min in 3 mg / ml Kollagenase 7 vermählen. In einer anderen Studie verwendet diese Forscher mehreren Inkubationen mit einem kombinierten Aufschluss von 2,5 Stunden, einschließlich der Verwendung von Trypsin / EDTA, Collagenase III und Dispase 5. Die Verwendung von Trypsin ist nicht für die enzymatische Verdauung Haut empfohlen, da die Behandlung mit Trypsin von verschiedenen Herstellern wurde gezeigt, meßbar beeinflussen die Integrität von Zelloberflächenproteinen auf Säugetierzellen 14-15. Zusätzlich kann Dispase signifikante Wirkungen auf proliferative Fähigkeit der CD4 T-Zellen und CD8a auswirken und Oberflächenfluss von wenigstens 20 Molekülen, einschließlich der gemeinsamen T-Zellaktivierung Marker wie CD62L 16. Andere Protokolle verwenden RPMI 1640 bei der Verdauung Medium 6. Jedoch kann die Anwesenheit von Mg 2+ und Ca 2+ in RPMI verursachen umfangreiche Zellaggregation 17.

Ein ideales Protokoll für Gewebedissoziation sollte für Hochzelllebensfähigkeit, geringe zielenEbenen der Zellaggregation und minimale Beschädigung Oberflächenproteine ​​zu Zelle. Hochwertige Lymphknoten Stromazellen Vorbereitungen mit Protokollen, die kürzer Enzyminkubationen, Ca 2+ und Mg 2+ freien Medien zu verwenden erreicht worden, und Trypsin zu vermeiden und Dispase 18. Jedoch haben Protokolle dieser Art nicht für die Dissoziation von ganzen Mäusehaut nachgewiesen.

Hier wird ein Protokoll beschrieben zu distanzieren, zu isolieren und zu bereichern haut infiltrieren Leukozyten aus allergenfochten Maus Flanke Haut. Kurz gesagt, herausgeschnitten Haut in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10% fötalem Rinderserum für 1 Stunde vorinkubiert, um das Gewebe für die Verdauung zu erweichen und zu entfernen überschüssiges tote Haut oder Fettgewebe. Dies wird durch eine 30 min enzymatischen Aufschlußschritt mit 0,7 mg gefolgt / ml Kollagenase D. Kollagenase D hat minimale Auswirkungen auf Dichte der Zelloberflächenmarker und keine Wirkung auf die T-Zellproliferation in vitro 16,18, so dass essehr gut geeignet für Anwendungen, die die Charakterisierung von Oberflächenproteinen. Folgende enzymatische Verdauung wurde diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation zum Epithelzellen und Schmutz von der Einzelzellsuspension zu entfernen und anzureichern hämatopoetischen Zellen. Wichtiger ist, vermeidet dieses Verfahren teuer spaltenbasierten Magnetzellseparation Reagenzien und Gewebedissoziation Maschinen 8-11 und können mit Geräten und Materialien in einem basischen biomedizinischen Forschungslabors gefunden geführt werden. Hier wurde dieses Protokoll verwendet, um Leukozyten aus Flankenhaut dreimal herausgefordert mit dem Hapten Oxazolon (Ox) bei bereits sensibilisierten ND4 Swiss Mäuse (ab 19 angepasst) zu isolieren. Zellen wurden unter Verwendung von Mehrparameter Durchflusszytometrie analysiert. Diese Technik ergab eine Zellsuspension mit minimalem Rückstand und> 95% Lebensfähigkeit der isolierten Lymphozyten, die von Mehrparameter Flow-Zytometrie analysiert wurden, um die Infiltration von T-Lymphozyten und Neutrophilen in die betroffene sk messenim.

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Protocol

Hinweis: 8-12 Wochen alte weibliche ND4 Swiss Webster-Mäusen, konventionell mit freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht sind, wurden für diese Studien verwendet Das verwendete Experimentalprotokoll (B13S1) wurde vom Macalester College IACUC genehmigt..

1. Sensibilisierung und Herausforderung mit Oxazolon

  1. Tag 0
    1. Bereiten Anästhesieraum durch Zugabe von 3 ml Isofluran auf saugfähige Handtücher unterhalb Masche am unteren Rand eines 4 L mit Deckel Glas platziert. Zur ND4 weiblichen Mäusen hier verwendete Zeit in der Kammer 30-60 sec, bis das Objekt ausreichend betäubt; Optimierung der Verabreichung des Anästhetikums für die Mausstamm verwendet wird.
    2. Rasur narkotisierten Maus hin und flankieren mit einem Tierhaarschneider.
  2. Tag 1
    1. Einen 2% igen Lösung von 4-Ethoxymethylen-2-phenyl-2-oxazolin-5-on (Ox) in absolutem Ethanol und Inkubation bei 50 ° C für 15 min auf einer rotierenden Platte in einem Inkubator.
    2. Kurz betäubenMäuse mit Isofluran-Narkose, wie in 1.1.1 beschrieben und anwenden 100 ul 2% Ox in mehreren Serienanwendungen von etwa 20 & mgr; l jeder der rasierten Rücken. Warten Sie 5-10 Sekunden zwischen seriellen Anwendungen für die Lösung zu trocknen.
    3. Achten Sie darauf, zu verschütten die 2% Ox-Lösung auf anderen als den Rücken Regionen, und warten auf die Lösung, um zwischen Anwendungen zu trocknen.
  3. Tage 5-7
    1. Einen 1% igen Lösung (Ox) in absolutem Ethanol und Inkubation bei 50 ° C für 15 min auf einer rotierenden Platte in einem Inkubator.
    2. Sanft, aber bestimmt die Maus zu immobilisieren am Genick und Schwanzbasis mit Leib nach oben und Hals leicht nach unten geneigt ist (ähnlich wie bei einem Halt für eine intraperitoneale Injektion) und anwenden 100 ul 1% Ox auf die rasierte Flanke in mehreren Serienanwendungen und sich die Zeit nehmen, um die Haut danach trocknen, wie oben beschrieben.
    3. Für Kontrollmäusen, gelten 100 ul absolutem Ethanol Fahrzeug auf die rasierte Flank.

2. Flank Haut Ernte

  1. Euthanize Mäusen unter Verwendung von Kohlendioxid Einatmen, Verschlucken und vorsichtig herauszuschneiden den gewünschten Bereich der Flankenhaut (~ 25 mm x 25 mm der Haut) mit 10 cm chirurgische Scheren.
  2. Mit einem sauberen, scharfen chirurgischen Klinge, kratzen Sie das überschüssige Fett und Bindegewebe von der Flanke Haut.
  3. Platzieren 3 Stück Flanke Haut von 3 Mäusen in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 10 ml HBSS RT [mit Phenolrot, ohne Calcium oder Magnesium, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1- piperazinethansulfonsäure (HEPES) und 10% fötalem Rinderserum (FBS)].

3. Pre-Verdauung Tissue Wasch

  1. Das Röhrchen enthaltenden Hautstücke auf einem Drehteller für 30 min in einem trockenen nicht-begasten Brutschrank bei 37 ° C gehalten.
  2. Vortex kräftig für 10 Sekunden am Ende der Inkubationszeit.
  3. Der Stamm der Inhalt des Röhrchens durch einen 70 & mgr; mSchmutzfänger, um den Waschpuffer verwerfen und sammeln das Gewebe. Ein einzelnes Sieb kann während des gesamten Verfahrens in einer biologischen Behandlungsgruppe wiederverwendet werden.
  4. Verwendung eines Paars von Zangen, übertragen die Flankenhaut von dem Sieb in ein neues 50 ml konischen Röhrchen, die 10 ml frisches, RT HBSS Medium (enthaltend EDTA, HEPES und FBS, wie oben beschrieben).
  5. Mit einer 12,5 cm Paar chirurgische Dissektion in das Rohr eingetaucht ist, Hackfleisch jedes Stück Flanke Haut, so dass die mittlere Gewebestück ist etwa 2,2 mm x 2,2 mm in der Umgebung.
  6. Das Röhrchen enthaltenden Hautstücke auf einem Drehteller für 30 min in einem trockenen nicht-begasten Brutschrank bei 37 ° C gehalten.
  7. Vortex kräftig für 10 Sekunden am Ende der Inkubationszeit

4. Kollagenaseverdau der Haut

  1. Der Stamm der Inhalt des Röhrchens durch einen 70 & mgr; m Sieb, sammeln und übertragen Sie die Flankenhautstücke in ein neues 50 ml konischen Röhrchen mit 10 ml fresh, RT HBSS Medium mit 0,7 mg ergänzt / ml D. Kollagenase
  2. Das Röhrchen enthaltenden Digestionsmedium und Hautstücke auf einem Drehteller für 30 min in einem trockenen nicht-begasten Brutschrank bei 37 ° C gehalten.
  3. Wirbel Inhalt Rohr kräftig für 10 Sekunden am Ende der Inkubationszeit.
  4. Filterinhalt des Rohres durch ein 70 um Sieb in ein neues 50 ml konischen Röhrchen; halten den Durchfluss mit dem verdauten Gewebe und entsorgen Sie das Sieb und flankieren Haut Schutt.
  5. Die Durchströmungswäsche in 50 ml HBSS Medium, Zentrifuge für 5 Minuten bei 350 g, und dekantiert den Überstand.

5. Dichte-Zentrifugation

  1. Verwendung einer serologischen Pipette 3 ml 67% RT Dichtegradientenzentrifugation Medien in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in ein neues 15 ml konischen Röhrchen für jede Probe.
  2. Zellpellet in 5 ml 44% RT Dichtegradientenzentrifugation Medien in HBSS mit Phenolrot.
  3. Gently Schicht 5 ml des 44% Dichtegradientenzentrifugation Medium, das die Zellen auf der Oberseite des 67% Dichtegradientenzentrifugation Medien Probe unter Verwendung einer serologischen Pipette. Achten Sie auf die Pipette auf die langsamste Geschwindigkeit eingestellt, und legen Sie die Pipette entlang der Wand des konischen Rohrs. Seien Sie vorsichtig, nicht zu zittern, zu stören oder zu invertieren die Steigung.
  4. Beschleunigung auf die niedrigste Einstellung, löst die Bremse, und Zentrifuge die Gradienten bei 931 × g für 20 min bei RT, sicherzustellen, dass die Zentrifuge ausgeglichen ist.
  5. Nach der Zentrifugation vorsichtig den Gradienten aus der Zentrifuge und schonend zu transportieren, um die Laborbank hält das Rohr aufrecht. Unter Verwendung einer 5 ml-Plastiktransferpipette Entfernen der Zellschicht an der Grenzfläche der 44% und 67% Dichtegradientenzentrifugation Medien und in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. Wenn die Schnittstelle nicht angezeigt wird, entfernen Sie einfach etwa 2 ml Flüssigkeit an der 67% -44% Grenze.
  6. Füllen Sie das konische Röhrchen mit Zellen aus der inten-Schnittstelle mit 2% FBS in 1X eiskaltem PBS, Zentrifuge Zellen für 5 Minuten bei 350 · g, und dekantieren Sie den Überstand.
    Anmerkung: Dies ist das erste Mal, dass die Zellen abgekühlt werden / kalt gehalten, da Aufschlussschritte werden bei 37 ° C und Dichtegradientenzentrifugation Medien Schritte sind bei RT. Die Zellen können in einem 1 resuspendiert werden: 1 Trypanblau Verdünnung und zählt und Lebensfähigkeit Information kann an dieser Stelle erreicht werden.

6. Sperren und Färbung für Analyse über Durchflusszytometrie

  1. Block FcyRII / III-Rezeptoren auf Zellen, die nicht-spezifische Antikörperfärbung zu verhindern. Für die hier beschriebenen Experimente machen Antikörper Mastermixe in PBS mit 2% FBS, das 1: 100-Verdünnung von unkonjugiertem Antikörper gegen CD16 / 32 (2.4G2) zu binden und zu blockieren FcyRII / III-Rezeptoren.
  2. Blockiert Inkubieren Zellen mit entsprechenden Mastermixen von Antikörpern gegen CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) und Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5) sowie Brilliant Violet 510 lebend / tot-Färbung, um tote Zellen zu identifizieren. Verwenden Sie alle Antikörper entweder an der Verdünnung durch Hersteller empfohlen oder zuvor von Forschern optimiert. Für die hier beschriebenen Experimente verwenden alle Antikörper bei 1: 100 Verdünnung.
  3. Waschen und resuspendieren Zellen in 50 ul 1X PBS Färbepuffer mit 2% FBS. Halten auf Eis bis Fluoreszenzdaten auf einem Durchflusszytometer erfasst werden.
    Anmerkung: Es ist wichtig, dass Kompensationsparameter mit einer lymphatischen Gewebe und einen gemeinsamen Zelloberflächenantigen (wie CD4 oder CD8) vor dem Erwerb von Fluoreszenzdaten voroptimierte.
  4. Um die Anzahl der Zellen, die für Downstream-Durchflusszytometrie zu erhöhen, Daten zu erfassen vom gesamten Proben von gefärbten Zellen.

7. Analysieren Sie Flow Cytometry Daten mit Standardmethoden, um die unten aufgeführten Schritten Accomplish

  1. Ersten Gate auf die Lymphozyten Bereich der Vorwärtsstreuung(Fläche), die durch Seitenstreuung (Bereich) Plot.
  2. Wählen Sie dann einzelne Zellen mit Hilfe der Vorwärtsstreuung (Breite) durch Seitenstreuung (Breite), um zu vermeiden, die Analyse Dubletten. Dies kann auch mit einem Vorwärtsstreuhöhe von Seitenstreuhöhe Grundstück durchgeführt werden.
  3. Dann Tor auf Linie (CD11b, CD11c und CD45R / B220) -negativen und CD3-positive Ereignisse, die auszuschließen sind Makrophagen, dendritische Zellen und B-Zellen sind und beschränken Analysen der T-Zelle Fach, wenn das Ziel ist, wie es hier ist, um zu beurteilen infiltrierenden T-Zellen.
  4. Nächstes Tor auf lebende Zellen, die das Live / Dead-Färbung auszuschließen.
  5. Schließlich Tor auf der Zellpopulation von Interesse (siehe repräsentative Ergebnisse Abschnitt).

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Representative Results

Kollagenase D behandelten Splenozyten zeigen ähnliche Niveaus von CD4- und CD8-α auf T-Zellen im Vergleich zu Medien behandelten Kontrollen
Zunächst wurden die möglichen Auswirkungen Kollagenase D von der Frequenz und Oberflächen Fülle von Abstammung und Aktivierungsmarkern auf T-Zell-Untergruppen mit sekundären lymphatischen Gewebe als Kontrolle bewertet. Eine Suspension von Splenocyten aus Mäusen erhalten ND4 und für 1 Stunde mit HBSS-Medium gewaschen. Als nächstes wird die Hälfte der Zellen, um 0,7 mg zogen / ml Collagenase D (wie vorstehend in Abschnitt 4 beschrieben). Die verbleibenden Zellen wurden in HBSS Steuer Medium resuspendiert. Als nächstes wurden beide Fraktionen Splenozyten unter Verwendung einer Dichtezentrifugation Gradienten, wie oben in Abschnitt 5 beschrieben, verarbeitet. Zellen wurden dann mit Antikörpern gegen Oberflächen CD4 und CD8a gefärbt und am Durchflusszytometer analysiert. Single, leben, CD45 +, nicht-T-Linie - (B220 - CD11b -CD11c -) wurden CD3ɛ + Zellen für die Analyse gated, um B-Zellen, Makrophagen, dendritische Zellen auszuschließen. Zellen und 30% CD4 - - CD4 und CD8a Proteine ​​wurden ebenfalls auf der Oberfläche von Splenozyten, die unterzogen worden war, um D-Verdau Kollagenase und jene nicht ausgesetzt wurde, mit ungefähr 60% CD4 + CD8a Enzym erkannt CD8a + Zellen mit Behandlung entweder erkannt ( Abbildung 1a). Daher Kollagenase D digest keinen Einfluss auf die relative Häufigkeit von CD4 und CD8a. Die Intensitäten der Oberfläche CD4 und CD8a geometrische mittlere Fluoreszenzeinheiten (gMFI) auf diesen Untergruppen waren ebenfalls vergleichbar zwischen den beiden Behandlungen; gMFI Werte für CD4 waren 2271 für die Enzym-behandelt und 2243 zur Steuerung Milzzellen sind, und Werte für gMFI CD8a waren 536 für enzymbehandelten und 520 zur Steuerung Splenozyten. Enzymatische Behandlung keine Wirkung auf die Oberflächendichte der T-Zellaktivierungsmarker C hatte auchD44 oder CD62L auf CD4 + T-Zellen (1B). Geometrische mittlere Fluoreszenzintensität Werte für CD44 waren 669 für die Enzym-behandelten und 654 für die Steuerung Splenozyten; gMFI Werte für CD62L waren 1523 für die Enzym-behandelten und 1517 für die Kontrolle Splenozyten. Wie Collagenase D Verdauung bewahrt die Integrität von Oberflächenproteinen auf isolierten Zellen kann das hier beschriebene Protokoll mit Zuversicht für nachgeschaltete Durchflusszytometrie Analyse verwendet werden.

Enzymverdauung und Gradientenreinigung Flankenhautzellen führt zu einer hohen Zelllebensfähigkeit
Zellausbeute und prozentuale Lebensfähigkeit der vorstehend erhaltenen Zellsuspension wurden mit Trypan-Blau-Farbstoffausschluss 20 beurteilt. Diese Verdauung und Gradiententrennung Protokoll ergab etwa 250 lebensfähige Immunzellen pro mm 2 des Flankengewebe in Ox-Mäusen herausgefordert und etwa 4 brauchbare Immunzellen pro mm 2 des Gewebes in Fahrzeuggerechte Mäusendie zuvor mit Ox (Tabelle 1) sensibilisiert waren.

Enzymverdauung und Gradientenreinigung Flankenhautzellen führt zu robusten Erholung der Immunzellen
Als nächstes wurde das Ausmaß der Immuninfiltration in die Haut durch eine Analyse der Häufigkeit des CD45-Oberflächenproteine ​​auf Zellen, die aus der Flanke des OX-gestellt und Kontrollmäusen, die Gewinnung von Haut infiltrierende Immunzellen unter Verwendung der hier beschriebenen Methoden beurteilt getrennt bestimmt. CD45 ist ein pan-hämatopoetischen Linienmarker 21. 95% der Nieder Vorwärts- und Seitenstreuung, Einzelzellen (Gating nicht gezeigt) in Ox-fochten Mäusen und 71% dieser Zellen im Fahrzeug angefochten Kontrollen waren Live-CD45 + Zellen (Abbildung 2). A ~ 67-fache Steigerung der infiltrierenden CD45 + Immunzellen wurde in der Flanke Haut nach 3 tägliche Ox Herausforderungen Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren (Tabelle 1) nachgewiesen.

Drei Flanke Ox Herausforderungen ergeben sich ausgeprägte Infiltration von T-Zellen und Neutrophilen
Unsere Technik ergab eine Zellpopulation von Flanken Haut, die verwendet werden könnten, um eine Vielzahl von myeloiden und lymphoiden Zellen-Untergruppen erkennen, wie Gr-1 + Neutrophile 22, CD4 T-Zellen und T-Zellen CD8a. Wir beobachteten, ~ 6-fach, ~ 7-fache, und ~ 73-fachen Anstieg der Neutrophilen, CD4 T-Zellen und T-Zellen CD8a jeweils folgenden 3 tägliche Ox Herausforderungen (Tabelle 1). Wir berechneten diese Erhöhungen durch Multiplizieren der Gesamtzahl an lebensfähigen Zellen erhalten werden durch den Prozentsatz des gegebenen Immunzellfragment aus der lebensfähigen Zellen Tor während durchflusszytometrische Analyse (unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss gezählt). Dann dividiert die Anzahl der lebensfähigen Gesamtimmunzellen, Gr-1 +, CD4 + oder CD8a + -Zellen in Ox-behandelte Mäuse durch die entsprechenden Zahlen für die Fahrzeugkontrollmäuse, die unsfache Erhöhung der Lymphozytensubpopulationen. Gr-1 + Neutrophilen entfielen 42% der Single, Live-CD45 + B220 - CD11b - CD11c - Zellen in Ox-behandelten Mäusen und 10% dieser Bevölkerung in EtOH-behandelten Mäusen (2B). In Ox-behandelten Mäusen, ~ 52% der gated CD3 + T-Zellen wurden CD8a + und ~ 34% CD4 +, während in Fahrzeugsteuerungen, ~ 9% der T-Zellen wurden CD8a + und 57% CD4 + (2C) . Daher kann mit der hier beschriebenen Technik, allergische und nicht-allergische Haut Flanke verarbeitet werden, um Einzelzellsuspensionen geeignet für hochauflösende durchflusszytometrische Charakterisierung infiltrierenden Immunzellpopulationen zu erhalten.

Cells Teilmengen aus der Maus Flankenhaut Ox / Ox (3) Ox / EtOH (3) Falten Expansion (Ox / ETHANOL)
pro mm 2 Gewebe
Gesamtzahl der Zellen 262,7 5.3 49,3
CD45 + Immunzellen 250,7 3.8 66,7
CD4 + CD8 - Zellen 6.5 0.9 7.2
CD4 - CD8 + -Zellen 10.6 0.1 72,9
Neutrophile 8.6 15 5.6

Tabelle 1 Die Zellausbeuten von allergischen Haut Flanke in ND4 weiblichen Mäusen. Lebensfähigen Zellen von Flanken Haut isoliert wurden mittels Trypanblau-Färbung von Zellen gezählt, und der normalisierten / mm 2 Gewebe basierend auf den Bereich der Haut isoliert und die Anzahl der Mäuse pro gepoolt tisverklagen Vorbereitung. Wir berechneten Gesamtimmunzellausbeute basiert auf dem Nachweis von hämatopoetischen CD45-Antigen auf der Zelloberfläche, und Lymphozyten-Untergruppe Ausbeuten bezogen auf linienspezifische Oberflächenmarker. Dann dividiert die Anzahl der Zellen in Ox-behandelte Mäuse durch die Zahlen für Fahrzeugkontrollmäusen, was uns facher Anstieg der Lymphozytensubsets. Die gezeigten Daten repräsentieren gepoolte Daten aus 2-3 Mäusen pro Behandlung und sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die Enzymverdauung und Gradientenreinigung von Splenozyten erhalten Lymphozytensubsets und Zellaktivierungsmarker. Splenozyten gewaschen für 1 h mit HBSS Medium, entweder mit Kollagenase D oder HBSS Medium allein und mit einem Dichtegradient, um Schmutz und roten Blutzellen zu entfernen, gereinigt inkubiert. T-Zellen wurden als Live, CD45 +, Abstammungslinie (B220, CD11b, CD11c) identifiziert <sup> - und CD3ɛ +. Frequenz von CD4 und CD8a T-Zellen nicht nach enzymatische Verdauung (A) zu ändern. Oberflächendichte von CD44 und CD62L auf CD4 + T-Zellen nicht folgende enzymatische Verdauung (B) zu ändern. Die gezeigten Daten repräsentieren 2-3 Mäuse pro Behandlung aus einem einzigen Experiment gepoolten Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Enzym-Verdauung und Gradientenreinigung der Hautzellen zu offenbaren deutliche Immuninfiltration in Steuer vs. allergenfochten Maus Flanke Haut. Drei Flanke Ox Herausforderungen erzeugen ein ~ 67-fache Steigerung der haut infiltrieren Immunzellen bei bereits sensibilisierten ND4 Swiss Mäuse ( A). Drei Ox Herausforderungen auch provoked eine ca. 6-fache Steigerung der Gr-1 + Neutrophilen (B) und ~ 73- und ~ 7-fache Erhöhung der CD8a + und CD4 + T-Zellen, bzw. (C). Live-CD45 + Immunzellen werden aus einzelnen, niedrige Vorwärts- und Seitenstreuzellen gated; Neutrophile und T-Zellen aus B220 gated - CD11b - CD11c - Live-Einzelzellen. Zählungen wurden mit einem 1: 1 Trypanblau Verdünnungs folgenden Gradienten Dichtetrennung. Gezeigten Daten repräsentieren gepoolte Daten 2-3 Mäusen in jeder Behandlungsgruppe, und sind repräsentativ für zwei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Charakterisierung von Veränderungen der Hautansässigen Leukozyten in Nagetiermodellen von Hauterkrankungen wie Neurodermitis oder Psoriasis ist wichtig für das Verständnis der mechanistischen Zusammenhänge zwischen entzündlichen Zell Zustrom und Krankheitspathologie. Hier beschreiben wir eine wirtschaftliche Technik, um Leukozyten aus Hautgewebe mit Grundausstattung in den meisten biomedizinischen Forschungslabors gefunden zu isolieren. Diese relativ schnelle Technik vermeidet die Verwendung von teuren Gewebedissoziation Maschinen und kundenspezifische Rohre und Reagenzien und hilft, Ressourcen zu schonen und minimiert Hands-on-Zeit an der Laborbank. Sanften enzymatischen Verdauung und diskontinuierlichen Gradiententrennung entfernen die Mehrzahl von Epithelzellen und Schutt, und die isolierten Zellen können für eine Vielzahl von nachfolgenden Anwendungen einschließlich durchflusszytometrischen Analyse der Zellsortierung, die Übertragung, Zellkulturen und in vitro-Stimulation Assays verwendet werden. Enzymatischer Verdau mit Kollagenase D keine Wirkung auf T-Zell-Oberflächenmarker, Integrität und preserves Lebensfähigkeit der Zellen. Dieses Protokoll kann leicht modifiziert werden, um die Haut von anderen als dem Flankenbereichen zu verarbeiten.

Die kritischsten Schritte in diesem Verfahren sind 1) gründlich Entfernen von Fett- und Bindegewebe, während die Ernte der Haut, 2) Handhabung und Verarbeitung Gewebe rasch auf 4 zu maximieren infiltrieren Zellausbeute bei gleichzeitiger Minimierung Zelltod, 3) vorsichtig Schichtung des Gradienten und) vorsichtig Extrahieren der Grenzfläche des Gradienten. Vor Beginn einer groß angelegten Versuchs ist es wichtig, Dichtegradientenzentrifugation Medienlagerung und Schnittstellenentfernung zu üben. Man Ernte Zellen aus einem diskontinuierlichen Dichtegradienten üben durch Zerkleinern eine gesamte murine Milz durch ein 70 um Sieb in 1X PBS Färbepuffer und Durchführen des Dichtegradienten, wie oben in Schritt 5 beschrieben, ist es sehr viel einfacher zu sehen und zu extrahieren, die Schnittstelle zwischen dem 44% Dichtegradientenzentrifugation Medien und die 67% Dichtegradientenzentrifugation Medien mit splenocytes, aufgrund der großen Anzahl der vorhandenen Immunzellen.

Bei der Arbeit mit Dichtegradienten, sollten Luftblasen vermieden werden, während Pipettieren und Gradienten Störungen minimiert werden. Die konische Röhrchen mit dem Farbverlauf sollte schonend behandelt und vertikal zu jeder Zeit stattfinden. Dichtegradientenzentrifugation Media-Lösungen sollten immer bei RT werden, serologischen Pipetten auf die langsamste mögliche Freisetzung Geschwindigkeit der Zentrifuge bei Raumtemperatur gehalten wird, um niedriger Beschleunigung mit der Bremse ausgerückt gesetzt und vorsichtig vor dem Spinnen ausgeglichen. Beim Arbeiten mit Hautpräparate, die eine kleine Anzahl von infiltrierenden Leukozyten zu erhalten, sind Zellen, nicht immer an der Gradientengrenzfläche sichtbar. Somit ist es wichtig, die 44% Dichtegradientenzentrifugation Medien mit HBSS mit Phenolrot so dass die Schnittstelle kann leicht sichtbar, selbst wenn eine Schicht von Zellen nicht erkennbar werden zu machen. Darüber hinaus ist es wichtig, sanfte, aber geschickter beim Extrahieren, Waschen seinund Verarbeitung von Hautgewebe Zelltod zu verhindern, bevor die Haut in der HBSS Medium gegeben.

Wenn die Lebensfähigkeit der Zellen oder die Reinheit gering ist, kürzer ist (~ 20 min) Aufschlusszeiten geringfügig geringeren Konzentrationen von Collagenase D (~ 0,5 mg / ml) oder Zerkleinern des Gewebes feiner hilfreich sein könnte. Weil Über Verdauung und Abbau von Gewebe kann zum Zelltod beitragen wird Ermittler brauchen, um die minimale Kochzeit, die eine ausreichend große Zellprobengröße 17 bietet zu optimieren. Der Prozess wird wahrscheinlich erfordern mehrere Runden von Optimierung in den Händen der einzelnen Forscher, um die Technik zu standardisieren. Collagenase D Aktivitätsniveau kann auch zwischen Fertigungsplätzen und Anpassungen, um die Verdauung der Zeit ändern müssen für jedes Los des Enzyms verwendet werden. Bei der Optimierung ist es wichtig, Fleck Referenzzellsuspensionen (zB Milz) mit und ohne eine enzymatische Verdauung Schritt mit einem zuverlässigen lebend / tot-Färbung als auch Immunzellen lin gereinigteage Marker (zB CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, etc.), um sicherzustellen, dass Zellpopulationen und Oberflächenmarker von Interesse sind, durch das Gewebe Verdauung erhalten. Wenn möglich, ist es hilfreich, Optimierungen auf einer Flussführen Zytometer, dass zukunfts messen kann und Seitenstreubreite oder -höhe sowie Bereich, um Zellaggregate aus. Schließlich sollte die Zellsuspensionen unter dem Lichtmikroskop für die visuelle Beurteilung der Lebensfähigkeit und allgemeine Zellmorphologie untersucht werden. Die Zellen können manuell mit 0,4% Trypanblau Ausgrenzung unter einem Lichtmikroskop oder einem Durchflusszytometer mit Zählen Perlen gezählt werden. Für Studien, die strenger Quantifizierung von spezifischen Zelltypen in der herausgeschnittenen Gewebe erfordern, können Forscher Wiegen oder Messung des Gewebevolumens Fragmente vor und nach der Verdauung, und verwenden das Ausmaß der Verdauung, weitere Abschätzungen Zahl von Zell-Untergruppen, die in dem Gewebe, das analysiert.

Eine Einschränkung bei dieserProtokolls ist, dass es speziell für die Reinigung von Immunzellen angepasst. Wenn man sich für Isolierung, Reinigung und Analyse von anderen Zellpopulation (zB Haut Epithelzellen) ist, der Dichtegradient Set-up und die enzymatische Verdauung Protokoll wird sowohl wahrscheinlich Notwendigkeit, modifiziert und optimiert, um beste Isolierung der Zellen von Interesse werden. Allerdings ermöglicht dieses Protokoll zur Isolierung und Reinigung der beiden lymphoide und myeloide Zellen-Untergruppen und können somit für die meisten immunologischen Anwendungen angepasst werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass dieses Protokoll kann nicht verwendet werden, um zwischen Zellpopulationen Infiltration der Dermis gegen die Epidermis der Haut zu unterscheiden. Dieses Maß an Differenzierung zu erreichen, würde das Protokoll müssen weiter mit zusätzlichen Schritten, um enzymatisch trennen die Dermis angepasst und Epidermis vor oder anstelle der hier beschriebenen Schritte. Dabei werden Proben von ~ 3 Mäusen gepoolt, um Multi-Parameter-Durchflusszytometrieanalyse erleichtern es schwierig macht,erkennen Variabilität zwischen biologischen Replikaten. Allerdings, je nach der nachgeschalteten Anwendung der Wahl, dieses Protokoll kann leicht geändert werden, um zu ergeben und die Verwendung Proben von einzelnen Themen. Schließlich stellte das Protokoll hier für die jungen, muss ND4 weiblichen Mäusen für Mäusen unterschiedlichen Alters, des Geschlechts oder der Stämme gemäß den Bedürfnissen von Forschern modifiziert werden.

Zusammengefaßt zeigte diese Kombination von sanft enzymatische verdauen und diskontinuierlichen Gradienten Trennung liefert ein einfaches, wirksames und wirtschaftliches Verfahren zur Reinigung von Immunzellen aus entzündlichen Hautläsionen in Mäusen. Es kann verwendet werden, und im Großen und Ganzen in einem breiten Spektrum von Nagetiermodellen von Hauterkrankungen als ein geeignetes Mittel, um Immuninfiltration zu bewerten und zu isolieren, eine reine, lebensfähige Population von Leukozyten für Downstream-Anwendungen angepasst werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keine finanziellen oder sonstigen Interessen offen zu legen.

Acknowledgements

Die National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 zu DC), der National Vulvodynia Association (Auszeichnung an DC) und Macalester College unterstützt diese Arbeit. CB Im Rahmen eines Stipendiums der Macalester College Beckman Scholars Program, durch das Arnold und Mabel Beckman-Stiftung. BTF und TM werden von JDRF 2-2011-662 unterstützt. Wir danken Dr. Jason Schenkel und Dr. Juliana Lewis für die technische Beratung, und alle aktuellen und ehemaligen Mitglieder des Chatterjea Labor für ihre Hilfe und Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid Sigma Aldrich 55021C Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration) Sigma Aldrich H3375
EDTA disodium salt solution Sigma Aldrich E7889 Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select MidSci S01520HI Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) Sigma Aldrich P1644 Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit Kent Scientific CL9990-1201  Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one Sigma Aldrich E0753-10G Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) Tonbo Biosciences 70-0161 Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3ε-BV650 (145-2C11) Becton Dickinson 564378 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) eBioscience 47-0042-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8α-BV785 (53-6.7) BioLegend 100749 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) eBioscience 48-0112-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418) eBioscience 48-0114-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7) Becton Dickinson 563971 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11) Tonbo Biosciences 35-0451-U025 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) eBioscience 48-0452-80 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) BioLegend 104431 Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) BioLegend 108407 Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510 Tonbo Biosciences 13-0870-T100 Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa Becton Dickinson N/A Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum Roche Applied Science 11088858001 Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice Harlan 0-32 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. 

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References

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