النمذجة العلاج الكيميائي اللوكيميا المقاومة * These authors contributed equally

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Slone, W. L., Moses, B. S., Evans, R., Piktel, D., Martin, K. H., Petros, W., Craig, M., Gibson, L. F. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (108), e53645, doi:10.3791/53645 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. إعداد المتقدم

  1. إعداد جزيئات G10 ديكستران.
    1. إعداد G10 الطين وذلك بإضافة 50 مل برنامج تلفزيوني 1X إلى 10 جزيئات ز G10. مزيج من قبل انقلاب والسماح G10 لتسوية من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات CO / N.
    2. يوم الفصل العمود G10، نضح في برنامج تلفزيوني من الجسيمات G10 استقر وإضافة 50 مل برنامج تلفزيوني جديد. مزيج من قبل انقلاب. كرر مرتين، بإضافة 50 مل برنامج تلفزيوني جديد للجسيمات G10 استقر وتخزينها في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  2. زراعة BMSC وOB.
    1. الحفاظ على حد سواء BMSC أو OB عند 37 درجة مئوية في 6٪ CO 2 ونمت على لوحات زراعة الأنسجة 10 سم حتى يتم التوصل إلى 90٪ confluency.
    2. يعرض للتريبسين BMSC أو خلايا OB وتقسيم 1: 2 على 10 سم لوحات جديدة. تزرع الخلايا لهذه المعايير لحين الحاجة إليها لاللوكيميا شارك في زراعة.

2. إنشاء والحفاظ على المشارك الثقافة

  1. إضافة 5-20 × 10 6 خلايا اللوكيميا طن 10 مل من الورم وسائل الإعلام ثقافة بعينها على 80٪ -90٪ متموجة BMSC أو لوحة OB.
    ملاحظة: يحتفظ مختبرنا المشترك الثقافات عند 37 درجة مئوية في 5٪ O 2 لألخص أفضل المكروية نخاع العظام وهو ما ثبت بما يتراوح بين 1٪ إلى 7٪ 16-18. ومع ذلك، والحفاظ على المشترك الثقافات في هذا التوتر الأكسجين ليست حرجة لإنشاء القطعان اللوكيميا ثلاثة وهو في السلطة التقديرية للمختبر.
  2. كل يوم 4 تشرين إزالة جميع ولكن 1 مل من وسائل الاعلام (بما في ذلك خلايا اللوكيميا في تعليق) واستبدالها مع 9 مل سائل الإعلام والثقافة ابيضاض الدم النقي. عند إزالة 9 مل من وسائل الاعلام من لوحة، ويجب الحرص على عدم تعكير صفو BMSC أو OB طبقة ملتصقة.
    1. إزالة وسائل الاعلام عن طريق إمالة لوحة إلى جانب وسائل الاعلام نضح في زاوية اللوحة. بالإضافة إلى ذلك، عند إضافة وسائل الإعلام الجديدة، ومن المؤكد أن إضافة قطرة من الحكمة في ركن من لوحة على جدار لضمان الحد الأدنى من انقطاع طبقة BMSC أو OB ملتصقة.
  3. بعد اليوم ال 12 من شارك في الثقافة، وشطف خلايا اللوكيميا من BMSC أو طبقة OB قبل pipetting سائل الإعلام والثقافة من الطبق إلى أعلى وأسفل بلطف على طبق ما يقرب من 5 إلى 10 مرات ثم جمع في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. RESEED على الجديدة 80٪ -90٪ BMSC متموجة أو لوحة OB كما هو موضح في الخطوة 2.1.
    ملاحظة: الشطف لطيف من الثقافة المشتركة كما هو موضح في الخطوة 2.3 سيزيل S وPB خلايا اللوكيميا دون تعطيل BMSC أو OB أحادي الطبقة. وهذا يسمح الخلايا السرطانية فقط على أن يتم تحويلها إلى لوحة الثقافة المشتركة القادمة. هذه الدورة 12 يوما ويمكن تكرار عدة مرات حسب الحاجة على أساس احتياجات المستخدمين.

3. إعداد أعمدة G10 الخرزة

ملاحظة: إذا كان مطلوبا تحليل المصب معقمة أو زراعة بعد الانفصال العمود G10 ينبغي إجراء الخطوات التالية خارج باستخدام تقنية معقمة ويجب أن أعمدة G10 يكون الإعداد في غطاء البيولوجي العقيمة.

  1. قبل واجمهورية مقدونيا وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي (~ 30 مل لكل عمود). باستخدام الحقنة 10 مل، إزالة والتخلص الغطاس. إضافة الصوف الزجاجي إلى حقنة.
  2. باستخدام الملقط، مزق الصوف الزجاجي إلى فضفاضة رقيقة. إضافة طبقات متعددة من الصوف الزجاجي معبأة طفيفة إلى حقنة حتى يتم ملء 2/3 من الحقنة مع الصوف الزجاجي.
    ملاحظة: والصوف الزجاجي أمر حاسم لمنع الجزيئات G10 فضفاضة من تلويث جمع خلية اللوكيميا. جعل حزمت متأكد الصوف الزجاجي كافية لدعم الجسيمات G10، ولكن ليس مكتظة جدا لمنع تدفق وسائل الاعلام من خلال العمود.
  3. نعلق 1 في اتجاه ومحبس إلى طرف الحقنة في موقف مغلقة.
  4. المشبك العمود حقنة لعصابة تقف عالية بما فيه الكفاية حتى 50 مل أنبوب مخروطي (أنبوب جمع) يمكن وضعها تحت محبس. وضع أنبوب جمع تحت العمود حقنة.
  5. باستخدام ماصة 10 مل إضافة، وانخفاض الحكيم، والجسيمات G10 معلق في برنامج تلفزيوني للعمود على رأسالصوف الزجاجي. متابعة إضافة جزيئات G10 حتى مل بيليه ~ 2 (مقاسا التخرج على حقنة) من G10 الجسيمات النماذج على أعلى الصوف الزجاجي.
  6. تتوازن العمود G10 مع وسائل الاعلام قبل تحسنت.
    1. إضافة 2 مل من وسائل الاعلام قبل تحسنت إلى العمود. فتح صمام محبس ببطء بحيث يتدفق سائل الإعلام من العمود قطرة من الحكمة.
    2. كرر الخطوة 3.6.1 حتى ما مجموعه 10 مل من وسائل الاعلام استعد مسبقا تم ركض عبر العمود.
      ملاحظة: إذا كان ينظر إلى جسيمات G10 في تدفق عن طريق أنبوب جمع، إما 1) إضافة المزيد من الجسيمات G10 للحفاظ ~ 2 مل بيليه والتأكد من عدم وجود جزيئات G10 إضافية الهروب من العمود أو 2) استبدال عمود مع واحد غير المستخدمة وتكرار الخطوات 3.4-3.6.1.
    3. بعد المصارف وسائل الاعلام قبل تحسنت من العمود، إغلاق محبس وتجاهل أنبوب جمع مع التدفق من خلال. إضافة أنبوب مجموعة جديدة تحت العمود. العمود جاهز للتحميل مع وسائل الاعلام + خلية الخليط.
      ملاحظة: أعمدةيجب أن تستخدم فورا وعدم السماح لتجف.

4. فصل 3 مجموعات سكانية فرعية داخل المشارك الثقافة

  1. جمع حيوانية تعليق (S) الورم.
    1. وسائل الإعلام نضح من لوحة ثقافة مشتركة مع ماصة وبلطف إعادة تطبيق نفس وسائل الإعلام لشطف لوحة، وجمع وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا اللوكيميا في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. خلايا اللوكيميا التي تم جمعها هي حيوانية S.
  2. مجموعة من المرحلة الساطع (PB) حيوانية الورم.
    1. إضافة 10 مل وسائل الإعلام الجديدة مرة أخرى على لوحة ثقافة مشتركة. شطف بقوة من قبل pipetting وسائل الاعلام وأضاف صعودا وهبوطا ما يقرب من 5 مرات لإزالة خلايا اللوكيميا ملتصقة لكن ليس من الصعب بما فيه الكفاية لطرد ملتصقة BMSC / OB المكون.
    2. نضح مع ماصة، وجمع وسائل الاعلام في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. الخلايا التي تم جمعها هي حيوانية PB.
  3. مجموعة من المرحلة خافت (PD) حيوانية الورم.
    1. لوحة شطف مع 1 مل برنامج تلفزيوني لعينيوسائل الاعلام المتبقية اوفه. يعرض للتريبسين لوحة ثقافة مشتركة مع 3 مل التربسين ومكان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. إزالة لوحة من الحاضنة وبلطف استفادة الجانبين من لوحة لطرد ملتصقة BMSC / OB.
    3. إضافة 1 مل الجنين المصل البقري (FBS) وماصة صعودا وهبوطا 3-5 مرات لكسر المجاميع خلية كبيرة عن بعضها البعض.
    4. جمع وسائل الإعلام مع خلايا في أنبوب مخروطي 15 مل. هذه الخلايا هي حيوانية PD غير المكرر، مع BMSC / OB كذلك.
  4. الطرد المركزي 3 معزولة القطعان في 400 x ج لمدة 7 دقائق. نضح وتجاهل طاف resuspend ثم بشكل فردي الكريات في 1 مل وسائل الاعلام قبل تحسنت. الخلايا جاهزة للتحميل على عمود G10.

5. تحميل خلايا المشارك الثقافة على G10 العمود

ملاحظة: تأكد من محبس مغلق تماما قبل إضافة الخلايا سائل الإعلام التي تحتوي على عمود G10. أيضا، يجب أن يدير مجموعة حيوانية على عمود G10 منفصلة حتى لا introducالبريد أي تحيز بين السكان في تحليل المصب.

  1. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، إضافة 1 مل من كل حيوانية خلية في وسائل الاعلام قبل تحسنت إلى عمود G10 منفصل قطرة من الحكمة. تأكد من أن وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا يبقى على رأس أو داخل بيليه G10. تسمح للخلايا لاحتضان على بيليه G10 لمدة 20 دقيقة في RT.
    ملاحظة: لا يزال محبس مغلقة لمدة الحضانة.

6. جمع خلايا اللوكيميا السرطانية من G10 العمود

  1. إضافة 1-3 وسائل الإعلام مل قبل تحسنت إلى كل عمود G10. فتح صمام محبس والسماح لوسائل الإعلام للخروج ببطء العمود قطرة من الحكمة.
    ملاحظة: من المهم جدا للحفاظ على معدل تدفق بطيء من العمود أو بيليه G10 التي تحتوي على BMSC / OB يمكن أن تغسل العمود وتلوث خلايا اللوكيميا معزولة.
  2. الاستمرار في إضافة وسائل الاعلام قبل تحسنت بزيادات صغيرة (1-2 مل) إلى العمود G10 حتى ما مجموعه 15-20 مل وتعمل من خلال عمود وتم جمعها. انهيار فا محبسأنبوب LVE وغطاء جمع.
    ملاحظة: إذا كان ينظر إلى بيليه G10 الجسيمات في الجزء السفلي من أنبوب جمع، وإزالة بلطف وسائل الاعلام من أنبوب ترك G10 الجسيمات بيليه دون عائق، ونقل إلى أنبوب جديد.
  3. أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها وسائل الاعلام في 400 x ج لمدة 7 دقائق على RT. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في العازلة المناسبة لتطبيق المصب.
  4. الخلايا هي الآن السكان نقية من خلايا اللوكيميا خالية من BMSC أو تلوث OB ونحن على استعداد ليتم تطبيقها على التطبيقات المصب في تقدير المستخدم.
    ملاحظة: يجب أن تبقى بقاء الخلية اللوكيميا السرطانية دون تغيير عند تمرير الخلايا من خلال أعمدة G10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

سيقوم برنامج الإعداد الناجح وثقافة هذا النموذج ثقافة مشتركة تؤدي إلى إنشاء 3 مجموعات سكانية فرعية من الخلايا اللوكيميا النسبية إلى ملتصقة BMSC أو OB أحادي الطبقة. يوضح الشكل 1 كيف ALL الخلايا المزروعة في أحادي الطبقة BMSC تظهر في البداية على أنها فقط من السكان واحد من وقف التنفيذ خلايا اللوكيميا. وعلى مدار 4 أيام خلايا اللوكيميا تتفاعل مع BMSC لتشكيل 3 مجموعات سكانية فرعية المكانية للخلايا اللوكيميا (مع وقف التنفيذ (S)، مرحلة مشرقة (PB)، وقاتمة المرحلة (PD)). في حين أن 3 مجموعات سكانية فرعية من الخلايا السرطانية يمكن عادة أن ينظر بعد 24 ساعة من الثقافة المشتركة مع BMSC أو OB شاركنا في ثقافة الخلايا لمدة 4 أيام للسماح للديناميات والتفاعل الكامل بين خلايا اللوكيميا وBMSC / OB الخلايا لتأخذ مكان قبل أي تلاعب أو التجريب يحدث (الشكل 1). أيضا، لاحظ أن نحافظ على المشترك الثقافات في توتر الأوكسجين من 5٪ إلى ألخص نخاع العظم علم وظائف الأعضاء، والتي لديها النحلذكرت ن تتراوح بين 1٪ -7٪ 16-18.

والغالبية العظمى من تحليل المصب تتطلب فصل الخلايا اللوكيميا من BMSC أو OB. ولتحقيق ذلك علينا استخدام الأعمدة G10 لحصاد السكان نقية من خلايا اللوكيميا (الشكل 2A). وبعد trypsinization الخلايا BMSC وPD REH ينظر التي يقطنها خليط سكاني من قبل اثنين متميزة السكان إلى الأمام / جنبا إلى التدفق الخلوي (الشكل 2B، أعلى هيئة). بعد الانفصال G10 السكان نقية فقط REH جميع الخلايا واستردادها، وهو ما أكده الأمام / الجانب مبعثر تدفق الخلوي (الشكل 2B، اللوحة السفلية).

استخدام هذا النموذج المشترك الثقافة والقدرة على عزل خلايا اللوكيميا من 3 القطعان عند بالتعاون مع ثقافة BMSC أو OB يسمح للاستجواب من النمط الظاهري خلية ابيضاض الدم وعلاقتها موقعها المكانية بالنسبة إلى BMSC ملتصقة أو OBأحادي الطبقة. ذات أهمية خاصة، غير أن جميع الخلايا المستخرجة من السكان PD من BMSC أو OB ثقافة مشتركة فليس لديها ما لا موت الخلايا بعد التعرض لالسامة للخلايا العلاج الكيميائي (الشكل 3A، B).

الشكل 1
الشكل 1. جميع الخلايا في ثقافة مشتركة مع BMSC أو OB شكل ثلاثة السكان المكاني. مختبرنا يستخدم نظام التعاون ثقافة في المختبر لنموذج التفاعلات خلية اللوكيميا مع نخاع العظام المكروية خلايا انسجة المشتقة (BMSC أو OB). لتأسيس ثقافة مشتركة، هي المصنفة خلايا اللوكيميا (الأحمر) على 80٪ -90٪ متموجة أحادي الطبقة من BMSC أو OB (الأزرق)، والتي يرمز لها 'الوقت 0'. يتم الاحتفاظ المشترك الثقافات عند 37 درجة مئوية في 5٪ من الأكسجين لتقريب ظروف المكروية نخاع العظام. وسوف تبدأ خلايا اللوكيميا لتشكيل 3 مجموعات سكانية فرعية في أقرب وقت 24 ساعة، ولكن لتسمح للتفاعل كاملة لFOجمهورية مقدونيا نسمح المشترك الثقافات 4 أيام، أن تثبت أمام استخدام خلايا اللوكيميا لإجراء التجارب. يوم 4 (لوحات اليمين)، وثلاث مجموعات سكانية فرعية من الخلايا اللوكيميا تشكل فيما يتعلق أحادي الطبقة ملتصقة. التخطيطي (أعلى اليمين) والمجهر النقيض من المرحلة (أسفل اليمين) تظهر مع وقف التنفيذ (S) خلايا اللوكيميا عائمة بحرية في وسائل الإعلام. مرحلة مشرقة (PB) خلايا اللوكيميا التي انضمت إلى سطح BMSC أو OB أحادي الطبقة. وقاتمة المرحلة (PD) خلايا اللوكيميا التي هاجرت تحت BMSC أو OB أحادي الطبقة. يمثل مقياس شريط 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. استخدام الأعمدة G10 يسمح لفصل كل الخلايا من BMSC / OB. (A) مظاهرة من عملية باستخدام عمود G10UMN لفصل كل الخلايا من BMSC / OB ثقافة مشتركة لتحقيق السكان نقية من خلايا الورم للتحليل المصب. من اليسار إلى اليمين، يتم إضافة خليط من جميع الخلايا وBMSC / OB الخلايا إلى أعلى العمود G10. (مركز) خليط الخلية سوف يستقر في الطين G10، وينبغي المحتضنة في RT لمدة 20 دقيقة (ملاحظة: محبس هو في موقف مغلقة طوال الخطوات الأولى والثانية)؛ (الحق) يتم استرداد خلايا اللوكيميا عن طريق فتح محبس والشطف عمود مع وسائل الاعلام قبل تحسنت. (ب) تظهر لوحة أعلى قبل فصل G10 أن هناك يقطنها خليط سكاني من الخلايا التي تحتوي على BMSC (البوابة الزرقاء) وREH جميع الخلايا (البوابة الحمراء ) من خلال تقييم إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) التحليل. اللوحة السفلية، بعد الانفصال G10 فقط السكان نقية من REH تبقى جميع الخلايا (البوابة الحمراء) مع التلوث أقل من 1٪ خلية انسجة (البوابة الزرقاء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من ثي الصورة الرقم.

الشكل (3)
وقد زاد الرقم 3. PD خلايا اللوكيميا المقاومة إلى التعرض للعلاج الكيميائي. SD-1 خلايا اللوكيميا تعافى من السكان PD من BMSC شارك في ثقافة (A) لا تعرض انخفاض الجدوى بعد التعرض يوم 4 إلى آرا-C [1 ميكرومتر] ، MTX [50 ميكرومتر]، أو جهاز فيديو [25 ميكرومتر]، على غرار رقابة علاجية (لاحظ أن جرعة ثانية من آرا-C وأضافت في 48 ساعة للمساءلة عن أي خسارة المخدرات بسبب الاستقرار). خلايا اللوكيميا من وسائل الإعلام وحدها، والسكان S، وPB خفضت بشكل ملحوظ جدوى على النحو الذي يحدده الزرقاء exclusion.SD-1 خلايا اللوكيميا التريبان شارك في تربيتها مع الخلايا OB عرض اتجاهات مماثلة في جدوى (B). يتم التعبير عن النتائج على النحو يعني ± SEM. (*) تدل ف <0.05، المفردة اختبار t بالنسبة للعلاج الضوابط.5fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مرض المتبقية الحد الأدنى (MRD) الذي يساهم في انتكاس المرض لا يزال يشكل تحديا كبيرا السريرية في علاج صهر عدوانية ALL، وكذلك، ومجموعة من الأورام الخبيثة الدم الأخرى. المكروية نخاع العظام هي الموقع الاكثر شيوعا من انتكاسة في جميع 3،8. على هذا النحو، ونماذج أن نموذج المكروية نخاع العظم هي أدوات حيوية لاختبار الفرضيات المتعلقة اللوكيميا بقاء الخلايا السرطانية وصيانة MRD أثناء التعرض للعلاج الكيميائي. في حين أن النماذج الماوس تحدد المعيار الذهبي لأسئلة الاختبار المتعلقة نجاعة الأدوية، تواصل 2D ثقافة مشتركة لتكون منهجية فعالة من حيث التكلفة لاختبار الفروض والاستراتيجيات المخدرات المتعلقة الغد العظام دعم المكروية لبقاء الخلية اللوكيميا. وقد أظهرت العديد من المجموعات التي شاركت في ثقافة خلايا اللوكيميا مع BMSC أو يوفر OB ميزة البقاء على قيد الحياة عندما تحدى مع وكلاء العلاج الكيميائي 9،10،12-14،19-21. نماذج العمل CD34 غير ناضج العادي + هيماكشفت خلايا topoietic بالتعاون مع ثقافة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) أن الخلايا المكونة للدم سوف تتفاعل مع أحادي الطبقة ملتصقة من اللجان الدائمة لتشكيل ثلاث السكان المكاني متميزة من الخلايا المكونة للدم 22،23. قد نفذ انتشار الأسلحة النووية وتمايز الخلايا CD34 + نسبة إلى موقعها داخل الثقافة المشتركة 22. قمنا بتوسيع على هذه الملاحظة لاختبار الأسئلة المتعلقة نخاع العظام دعم خلية المكروية اللحمية للسكان مقاومة الخلايا السرطانية داخل 2D ثقافة مشتركة وعزلتها عن تحليل المصب.

على عكس النماذج 2D شارك في ثقافة القياسية التي عادة أخذ عينات خلايا اللوكيميا عن طريق إزالة الورم مع وقف التنفيذ، ويظهر لدينا نموذج يمثل هذا التعاون ثقافة تفاعل أكثر حيوية في الخلايا التي اللوكيميا بالتعاون مع ثقافة BMSC أو شكل OB ثلاث مجموعات سكانية فرعية نسبة إلى BMSC أو OB أحادي الطبقة (الشكل 1). وعلقت القطعان الورم التي تشكل (S) الورم، مبادرة الخوذ البيضاءالفصل يتحرك بحرية في وسائل الإعلام. مرحلة مشرقة (PB) التي انضمت إلى سطح BMSC أو OB. وقاتمة المرحلة (PD) التي دفنت تحت BMSC أو OB أحادي الطبقة (الشكل 1). في هذا النموذج، وجدنا أن التغذية صارمة والجدول الزمني البذر مهمة لتحقيق نتائج متسقة في نموذج التعاون ثقافة، وبالتالي فإننا تغذية المشترك الثقافات في فترات 4 أيام ونقل الورم إلى BMSC أو OB الطبقات الوحيدة جديدة كل 12 يوما. قد يتطلب هذا التعديل لأنواع الورم بديلة حسب الحاجة. عدد الخلايا السرطانية التي سوف يهاجر تحت BMSC أو OB لتشكيل قد تختلف السكان PD بين خلايا اللوكيميا المختلفة. هذا يمكن أن يكون وجود قيود على النموذج، عندما يكون عدد الخلايا السرطانية PD يبذلون منخفض صعوبة في جمع ما يكفي من الخلايا لتحليل المصب. في بعض الحالات يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق إنشاء تكرار المشترك الثقافات للسماح لتجميع القطعان الفردية الثلاثة.

وبما أن هذا نموذج إعادةتقع على الورم تفاعل الخلايا مع BMSC أو OB فمن المهم أن يكون وسيلة فعالة لإزالة تلوث الخلية انسجة لمعالجة الأحياء معين من خلايا اللوكيميا. لإنجاز هذا الفصل من الخلايا السرطانية من سدى نستخدم أعمدة G10. الإعداد السليم واستخدام هذه الأعمدة أمر بالغ الأهمية لعزل السكان ورم النقي لتحليل المصب. كما هو مبين في الشكل 2B، والتنفيذ السليم للG10 نتائج الفصل عمود في التعافي من الخلايا السرطانية في أكثر من 99٪ النقاء. وهذا يسمح لتحليل المصب من خلايا اللوكيميا دون تعقيد تفسير النتائج التي ستنجم عن تلوث الخلية اللحمية. من المهم أن نلاحظ أن جميع أنواع الخلايا اللوكيميا سواء خطوط الخلايا أو عينات المرضى الأولية سوف تختلف قليلا في قدرتها على تمرير من خلال الأعمدة G10. قبل استخدامها في تجارب واسعة النطاق يجب على المستخدمين تحديد عدد خلايا اللوكيميا يجب أن المدخلات لاسترداد المطلوب المبلغ المطلوب وأو احتياجات المصب الخاصة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كمية وسائل غسل ركض على G10 آخر عمود حضانة ويمكن زيادة في محاولة لزيادة عدد الخلايا استردادها. ينبغي توخي الحذر لضمان أن يغسل إضافية لا تسبب تلوث الخلية انسجة والذي يمكن تحديده بعد غسل من قبل عدد الخلايا أو التدفق الخلوي تحليل التدفق من خلال.

في وضع هذا النموذج، لاحظنا أن الخلايا اللوكيميا تعافى من السكان PD زادت قابلية مقارنة مع خلايا اللوكيميا نمت في وسائل الإعلام وحدها، فضلا عن تلك المستخرجة من السكان S أو PB في نفس المشارك الثقافة عندما تتعرض لالسامة للخلايا العلاج الكيميائي (الشكل 3 AB). وهذا أمر مهم لأنه يمثل مجموعة من الخلايا في المختبر اللوكيميا التي تستمد الحماية وضوحا من العلاج الكيميائي. وهذا يوفر أداة مفيدة لاختبار استراتيجيات علاجية تهدف إلى استهداف السكان الورم الأكثر مقاومة، الذي تدعمهالمكروية نخاع العظام. وعلاوة على ذلك، لأن هذه الخلايا اللوكيميا محمية بشكل جيد من قبل BMSC أو OB شارك في الثقافة هو قابل للفي المختبر استراتيجيات الجمع بين العلاج، وذلك في وسائل الإعلام وحدها أو نماذج التعاون ثقافة القياسية على ما يبدو أو أن تقتل تماما الورم الذي لا ممثل دائما من الآثار ينظر في المكروية بدعم السكان اللوكيميا المقاومة.

وأخيرا، فإننا نعتقد أن استخدام هذا النموذج يمكن أن توفر معلومات قيمة حول التفاعلات بين BMSC / OB، وخلايا اللوكيميا التي هي مسؤولة عن مقاومة العلاج الكيماوي، يؤدي إلى MRD، وبعد ذلك الانتكاس. كما يوفر هذا الطراز منصة في المختبر لتصميم التجارب التي ستبلغ أفضل نماذج المصب ما قبل السريرية. على الرغم من أننا تظهر استخدام هذا النموذج لاختبار التفاعلات بين الخلايا اللحمية نخاع العظام وجميع خلايا اللوكيميا المشتقة، فإننا نأمل أن الاتجاهات والتطبيقات المستقبلية لهذا النموذج سيكون لناeful في مجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة التي المكروية نخاع العظام يوفر موقع ملاذا للأورام خلال تدخل العلاج الكيميائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
G10 sephadex beads Sigma G10120 Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe BD 309604
Glass wool Pyrex 3950
1-way stopcocks World Precision Instruments, Inc. 14054-10
50 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021039 Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021037 Used for cell collection
Fetal Bovine Serum Sigma F6178
0.05% Trypsin  Mediatech, Inc. 25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 664160
Culture media
Osteoblast culture media  PromoCell C-27001 For human osteoblast media 
RPMI 1640 media Mediatech, Inc. 15-040 For tumor media prepation 
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts PromoCell C-12720 Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. 
Human Bone Morrow Stromal Cells WVU Biospecimen Core De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH ATCC ATCC-CRL-8286 REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
SD-1 DSMZ ACC 366 SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ayala, F., Dewar, R., Kieran, M., Kalluri, R. Contribution of bone microenvironment to leukemogenesis and leukemia progression. Leukemia. 23, (12), 2233-2241 (2009).
  2. Coustan-Smith, E., Sancho, J., et al. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 96, (8), 2691-2696 (2000).
  3. Gaynon, P. S., Qu, R. P., et al. Survival after relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer. 82, (7), 1387-1395 (1998).
  4. Kikuchi, M., Tanaka, J., et al. Clinical significance of minimal residual disease in adult acute lymphoblastic leukemia. Int. J. Hematol. 92, (3), 481-489 (2010).
  5. Krause, D. S., Scadden, D. T., Preffer, F. I. The hematopoietic stem cell niche-home for friend and foe? Cytometry B Clin. Cytom. 84, (1), 7-20 (2013).
  6. Meads, M. B., Hazlehurst, L. A., Dalton, W. S. The Bone Marrow Microenvironment as a Tumor Sanctuary and Contributor to Drug Resistance. Clin. Cancer Res. 14, (9), 2519-2526 (2008).
  7. Nguyen, K., Devidas, M., et al. Factors Influencing Survival After Relapse From Acute Lymphoblastic Leukemia: A Children's Oncology Group Study. Leuk. Off. J. Leuk. Soc. Am. Leuk. Res. Fund UK. 22, (12), 2142-2150 (2008).
  8. Szczepanek, J., Styczyński, J., Haus, O., Tretyn, A., Wysocki, M. Relapse of Acute Lymphoblastic Leukemia in Children in the Context of Microarray Analyses. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). 59, (1), 61-68 (2011).
  9. Boyerinas, B., Zafrir, M., Yesilkanal, A. E., Price, T. T., Hyjek, E. M., Sipkins, D. A. Adhesion to osteopontin in the bone marrow niche regulates lymphoblastic leukemia cell dormancy. Blood. 121, (24), 4821-4831 (2013).
  10. Bradstock, K., Bianchi, A., Makrynikola, V., Filshie, R., Gottlieb, D. Long-term survival and proliferation of precursor-B acute lymphoblastic leukemia cells on human bone marrow stroma. Leukemia. 10, (5), 813-820 (1996).
  11. Clutter, S. D., Fortney, J., Gibson, L. F. MMP-2 is required for bone marrow stromal cell support of pro-B-cell chemotaxis. Exp. Hematol. 33, (10), 1192-1200 (2005).
  12. Manabe, A., Murti, K. G., et al. Adhesion-dependent survival of normal and leukemic human B lymphoblasts on bone marrow stromal cells. Blood. 83, (3), 758-766 (1994).
  13. Mudry, R. E., Fortney, J. E., York, T., Hall, B. M., Gibson, L. F. Stromal cells regulate survival of B-lineage leukemic cells during chemotherapy. Blood. 96, (5), 1926-1932 (2000).
  14. Tesfai, Y., Ford, J., et al. Interactions between acute lymphoblastic leukemia and bone marrow stromal cells influence response to therapy. Leuk. Res. 36, (3), 299-306 (2012).
  15. Hathcock, K. S. Depletion of Accessory Cells by Adherence to Sephadex G-10. Curr. Protoc. (2001).
  16. Berniakovich, I., Giorgio, M. Low oxygen tension maintains multipotency, whereas normoxia increases differentiation of mouse bone marrow stromal cells. Int. J. Mol. Sci. 14, (1), 2119-2134 (2013).
  17. Chow, D. C., Wenning, L. A., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Modeling pO(2) distributions in the bone marrow hematopoietic compartment. II. Modified Kroghian models. Biophys. J. 81, (2), 685-696 (2001).
  18. Holzwarth, C., Vaegler, M., et al. Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells. BMC Cell Biol. 11, (2010).
  19. O'Leary, H., Akers, S. M., et al. VE-cadherin Regulates Philadelphia Chromosome Positive Acute Lymphoblastic Leukemia Sensitivity to Apoptosis. Cancer Microenviron. Off. J. Int. Cancer Microenviron. Soc. 3, (1), 67-81 (2010).
  20. Wang, L., Chen, L., Benincosa, J., Fortney, J., Gibson, L. F. VEGF-induced phosphorylation of Bcl-2 influences B lineage leukemic cell response to apoptotic stimuli. Leukemia. 19, (3), 344-353 (2005).
  21. Wang, L., Coad, J. E., Fortney, J. M., Gibson, L. F. VEGF-induced survival of chronic lymphocytic leukemia is independent of Bcl-2 phosphorylation. Leukemia. 19, (8), 1486-1487 (2005).
  22. Jing, D., Fonseca, A. V., et al. Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells--modeling the niche compartments in vitro. Haematologica. 95, (4), 542-550 (2010).
  23. Jing, D., Wobus, M., Poitz, D. M., Bornhäuser, M., Ehninger, G., Ordemann, R. Oxygen tension plays a critical role in the hematopoietic microenvironment in vitro. Haematologica. 97, (3), 331-339 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics