Modelagem quimioterapia leucemia resistente * These authors contributed equally

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Slone, W. L., Moses, B. S., Evans, R., Piktel, D., Martin, K. H., Petros, W., Craig, M., Gibson, L. F. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (108), e53645, doi:10.3791/53645 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Preparação avançada

  1. A preparação de partículas do G10 dextrano.
    1. Prepare G10 pasta por adição de 50 ml de PBS 1X aos 10 partículas g G10. Misturar por inversão e permitir G10 para resolver fora de salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
    2. No dia da separação coluna G10, aspirado PBS a partir de partículas do G10 assentados e adicionar 50 ml de PBS fresco. Misturar por inversão. Repita duas vezes, adicionando 50 ml PBS fresco às partículas do G10 assentadas e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
  2. A cultura de BMSC e OB.
    1. Manter tanto a BMSC OB ou a 37 ° C em 6% de CO 2 e cultivadas em placas de cultura de tecidos de 10 cm até 90% de confluência é atingido.
    2. Trypsinize BMSC ou células de OB e dividir 1: 2 para novos cm placas de 10. As células são cultivadas com estas normas até ser necessário para a co-cultura leucémicas.

2. Estabelecer e manter Co-cultura

  1. Adicionar 5-20 x 10 6 células leucémicas in 10 ml de tumor meios de cultura específicos para um 80% -90% confluentes BMSC ou placa OB.
    NOTA: O nosso laboratório mantém co-culturas a 37 ° C em 5% de O 2 para melhor recapitular o microambiente da medula óssea, o que tem sido demonstrado que variam de 1% a 7% 16-18. No entanto, a manutenção de co-culturas neste tensão de oxigênio não é crítica para o estabelecimento das três subpopulações leucêmicas e fica a critério do laboratório.
  2. Cada dia remover todos, mas 1 ml de mídia (incluindo células leucêmicas em suspensão) e substituir com 9 ml meio de cultura leucêmica fresco. Ao remover 9 ml de mídia da placa, tome cuidado para não perturbar a camada aderente BMSC ou OB.
    1. Remova a mídia pela inclinação placa para o lado e aspirado de mídia no canto da placa. Além disso, quando a adição de meio fresco, não se esqueça de adicionar gota a gota, no canto da placa contra a parede lateral para garantir o mínimo de interrupção da camada aderente BMSC ou OB.
  3. Após o 12º dia da co-cultura, lavar as células leucêmicas BMSC ou camada OB pipetando meios de cultura de prato cima e para baixo suavemente sobre o prato de aproximadamente 5 a 10 vezes e, em seguida, recolher no tubo de 15 ml. Propagar novamente para nova 80% -90% confluentes BMSC ou placa de OB como descrito na etapa 2.1.
    NOTA: O enxaguamento suave da co-cultura, tal como descrito na etapa 2.3 irá remover as células leucémicas S e PB, sem perturbar a monocamada de BMSC ou OB. Isto permite que apenas as células de tumor a ser transferido para a próxima placa de co-cultura. Este ciclo de 12 dias pode ser repetido tantas vezes quanto necessário, com base nas necessidades do usuário.

3. Preparar Colunas G10 Bead

NOTA: Se a análise a jusante estéril ou cultura é necessária após a separação coluna G10 os seguintes passos devem ser realizados utilizando uma técnica estéril e colunas G10 deve ser configurado em uma capa biológica estéril.

  1. Pré-warm meio de cultura celular a 37 ° C em banho de água (~ 30 mL por coluna). Usando uma seringa descartável ml 10, remover e descartar o êmbolo. Adicionar a lã de vidro para seringa.
  2. Com uma pinça, puxe a lã de vidro em fios soltos finas. Adicionar várias camadas de lã de vidro ligeiramente embalado para a seringa até 2/3 da seringa é preenchido com lã de vidro.
    NOTA: A lã de vidro é crucial para evitar que partículas soltas do G10 de contaminar a recolha de células leucêmicas. Certifique-se de lã de vidro é embalado o suficiente para suportar as partículas do G10, mas não muito densamente para bloquear o fluxo de mídia através da coluna.
  3. Anexar uma torneira de sentido para a ponta de seringa na posição fechada.
  4. Braçadeira coluna seringa para anel ficar alto o suficiente para um tubo de 50 ml (tubo de coleta) pode ser colocado debaixo torneira. Coloque tubo de coleta na coluna seringa.
  5. Usando a 10 ml pipeta adicionar, gota a gota, partículas do G10 novamente suspensas em PBS para a coluna na parte superior doa lã de vidro. Continue a adição de partículas até um G10 ml sedimento ~ 2 (tal como medido por graduações na seringa) de G10 formas partículas na parte superior da lã de vidro.
  6. Equilibrar a coluna G10 com mídia pré-aquecido.
    1. Adicionar 2 ml de meio de pré-aquecida até à coluna. Abra a válvula de torneira lentamente, de modo que a mídia flui para fora da coluna de gota a gota.
    2. Repetir o passo 3.6.1, até um total de 10 ml de meio pré-aquecido ter sido atravessou a coluna.
      NOTA: Se as partículas G10 são vistos no fluxo de passagem no tubo de recolha, ou 1) adicionar mais partículas G10 para manter ~ 2 ml de sedimento para garantir que não há partículas adicionais G10 escapar a partir da coluna ou 2) substituir coluna com um um não utilizada e de repetição passos 3.4-3.6.1.
    3. Depois que os drenos de mídia pré-aquecido a partir da coluna, feche a torneira e descartar tubo de coleta com fluxo através. Adicionar um novo tubo de recolha na coluna. Coluna está pronta para ser carregada com meios + mistura de células.
      NOTA: Colunasdeve ser utilizado imediatamente e não deixa-se secar.

4. Separar 3 subpopulações dentro Co-cultura

  1. Coleção de subpopulação de suspensão (S) tumor.
    1. media aspirado de placa co-cultura com pipeta e suavemente voltar a aplicar os mesmos meios para lavar o prato e recolher a mídia contendo células leucêmicas em um tubo de 15 ml. As células leucémicas são recolhidos a subpopulação S.
  2. Coleção de subpopulação tumor Fase Bright (PB).
    1. Adicionar 10 ml de mídia fresco de volta para placa co-cultura. Lavar vigorosamente pipetando mídia adicionados cima e para baixo cerca de 5 vezes para remover as células leucêmicas aderentes, mas não forte o suficiente para desalojar aderente BMSC / OB componente.
    2. Aspirar com pipeta e recolher meios de comunicação em um tubo de 15 ml. As células são recolhidas a subpopulação PB.
  3. Coleção de subpopulação tumor Fase Dim (PD).
    1. placa de lavagem com 1 ml PBS para remmídia restante ove. Tripsinizar placa de co-cultura com 3 ml de tripsina e o local em 37 ° C incubadora durante 5 min.
    2. Retire a placa para fora da incubadora e bata suavemente os lados da placa para desalojar aderente BMSC / OB.
    3. Adicionar 1 ml de soro fetal de bovino (FBS) e pipeta cima e para baixo 3-5 vezes para quebrar grandes agregados celulares.
    4. Recolhe meios de comunicação com as células num tubo cónico de 15 ml. Estas células são o subpopulação PD não purificado com BMSC / OB bem.
  4. Centrifugar 3 isolado subpopulações a 400 xg durante 7 minutos. Aspirar e elimine o sobrenadante em seguida, ressuspender individualmente pelotas em 1 ml de mídia pré-aquecido. As células estão prontas para serem carregadas numa coluna G10.

5. Carregando Co-cultura de células nas G10 Coluna

NOTA: Certifique-se de torneira está completamente fechada antes de adicionar as células de mídia contendo a coluna G10. Além disso, cada subpopulação deve ser executado através de uma coluna G10 separada de modo a não Introducum e qualquer preconceito entre as populações na análise a jusante.

  1. Com uma pipeta de 1000 mL, adicione 1 ml de cada uma das subpopulações de células em meios de pré-aquecido a uma coluna G10 separada gota a gota. Certifique-se de que a mídia contendo as células permanece em cima ou dentro de pellet G10. Permitir que as células a incubar em pelete G10 durante 20 min à TA.
    NOTA: Torneira permanece fechado para a duração da incubação.

6. Coleta de células leucêmicas de G10 Coluna

  1. Adicionar 1-3 media ml pré-aquecido a cada coluna G10. Abra a válvula de torneira e deixar a mídia para sair lentamente gota a gota a coluna.
    NOTA: É crucial para manter uma taxa de fluxo lento a partir da coluna ou o pellet contendo G10 BMSC / OB pode lavar para fora da coluna e contaminam as células leucémicas isoladas.
  2. Continuar a adicionar meios pré-aquecido em pequenos incrementos (1-2 ml) a coluna G10 até um total de 15 a 20 ml foi executado através da coluna e foi recolhido. Fechar a torneira vatubo de recolha de lve e boné.
    NOTA: Se um pellet G10 partícula é visto na parte inferior do tubo de coleta, remover suavemente a mídia do tubo deixando G10 grânulo de partícula imperturbado e transferência para o novo tubo.
  3. Centrifugar meios recolhidos a 400 xg durante 7 minutos à TA. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento de células em tampão apropriado para aplicação a jusante.
  4. As células são agora uma população pura de células leucêmicas livres de BMSC ou contaminação OB e está pronto para ser aplicado a aplicações a jusante, a critério do usuário.
    NOTA: viabilidade celular de leucemia devem permanecer inalterados ao passar células através de colunas do G10.

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Representative Results

Configuração bem-sucedida e cultura deste modelo de co-cultura irá resultar no estabelecimento de 3 subpopulações de células leucémicas em relação ao aderente BMSC ou OB monocamada. A Figura 1 mostra como todos as células semeadas em uma monocamada BMSC inicialmente aparece como uma única população de suspenso células leucêmicas. Ao longo de 4 dias as células leucémicas interagem com a BMSC para formar 3 subpopulações de células leucémicas espaciais (suspensa (s), de fase clara (PB), e fraca de fase (PD)). Embora os 3 subpopulações de células tumorais pode geralmente ser visto após 24 horas de co-cultura com BMSC ou OB que co-cultura das células durante 4 dias para permitir que a dinâmica total e das interacções entre as células leucémicas e BMSC / ob células para ter lugar antes de qualquer manipulação ou experimentação ocorre (Figura 1). Além disso, observe que mantemos os co-culturas a uma tensão de oxigênio de 5% de recapitular a fisiologia da medula óssea, que tem a abelhaN relatada na faixa de 1% a 7% 16-18.

Uma grande maioria das análises a jusante requer a separação das células leucémicas do BMSC ou OB. Para conseguir isso, utiliza colunas G10 para colher uma população pura de células leucémicas (Figura 2A). Seguindo tripsinização de células BMSC e PD REH uma população mista é visto por duas populações frente / laterais distintas, por citometria de fluxo (Figura 2B, painel superior). Após a separação G10 uma população pura de células apenas REH TODAS é recuperada, o que foi confirmado pela frente / dispersão lateral citometria de fluxo (Figura 2B, painel inferior).

A utilização deste modelo de co-cultura e a capacidade para isolar células leucémicas de 3 subpopulações quando em co-cultura com BMSC ou OB permite à interrogação do fenótipo de células leucémicas com relação à sua localização espacial relativa ao BMSC aderente ou OBmonocamada. De particular interesse, é que todas as células recuperadas a partir da população de PD de uma co-cultura BMSC ou OB tem pouca ou nenhuma morte de células após exposição a quimioterapia citotóxica (Figura 3A, B).

figura 1
Figura 1. Todas as células em co-cultura com BMSC ou OB forma três populações espaciais. Nosso laboratório utiliza um sistema de co-cultura in vitro para modelar interações entre células leucêmicas com microambiente da medula óssea células estromais derivadas (BMSC ou OB). Para estabelecer a co-cultura, as células leucémicas (vermelhas) são semeadas em um 80% -90% monocamada confluente de BMSC ou OB (azul), que é designado como "Tempo 0". Co-culturas são mantidas a 37 ° C em 5% de oxigénio para aproximar as condições do microambiente da medula óssea. As células leucêmicas vai começar a formar 3 subpopulações tão cedo quanto 24 horas, mas para permitir interações completas para form que permitem co-culturas 4 dias para estabelecer antes de utilizar células leucêmicas para experimentos. Ao dia 4 (painéis da direita), três subpopulações de células leucémicas vai formar em relação à monocamada aderente. O esquema (canto superior direito) e a microscopia de contraste de fase (inferior direito) mostram a suspensão (S) células leucêmicas que flutuam livremente nos meios de comunicação; fase brilhante (PB) células leucémicas que estão aderidos à superfície da monocamada ou OB BMSC; e as dim de fase (PD) células leucémicas que migraram por baixo da monocamada BMSC ou OB. Barra de escala representa 10 microns. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. A utilização das colunas G10 permite a separação de todas as células de BMSC / OB. (A) Demonstração do processo de utilização de uma coluna G10UMN para separar todas as células desde BMSC / OB de co-cultura para atingir uma população pura de células tumorais para análise a jusante. Da esquerda para a direita, uma mistura de todas as células e BMSC / células de OB é adicionado ao topo da coluna G10; (Centro) mistura de células irá assentar na lama G10 e deve ser incubada a temperatura ambiente durante 20 min (Nota: A torneira estiver na posição fechada ao longo de dois primeiros passos); (direita) células leucémicas são recuperados através da abertura da torneira e a lavagem da coluna com meio de pré-aquecido. (B) O painel superior mostra antes da separação G10 que existe uma população mista de células contendo BMSC (portão azul) e REH TODAS células (portão vermelho ), avaliando a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) análise. Painel inferior, após a separação G10 só a população pura de REH TODAS células (portão vermelho) permanecem com a contaminação de células do estroma menos de 1% (porta azul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior do thi s figura.

Figura 3
Figura 3. células leucémicas PD aumentaram a resistência à exposição a quimioterapia. SD-1 células leucémicas recuperados a partir da população de PD de uma co-cultura BMSC (A) não exibem uma diminuição da viabilidade após uma exposição de 4 dias a Ara-C [^ M 1] , MTX [50 mM], ou VCR [25 mM], similar aos controles não tratados (note que uma segunda dose de Ara-C adicionado a 48 horas para dar conta qualquer perda de droga, devido à estabilidade). Células leucêmicas só os meios de comunicação, as populações de S e PB reduziram significativamente a viabilidade, como determinado por exclusion.SD-1 azul de tripano de células leucémicas de co-cultivadas com células de OB mostrar tendências semelhantes em viabilidade (B). Os resultados são expressos como média ± SEM. (*) Indica p <0,05, teste t não emparelhado em relação aos controlos não tratados.5fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

doença residual mínima (MRD), que contribui para a recidiva da doença continua a ser um grande desafio para o tratamento clínico de refractário agressivo ALL, bem como, uma série de outras doenças malignas hematológicas. O microambiente da medula óssea é o local mais comum de recidiva em ALL 3,8. Como tal, os modelos que modelam o microambiente da medula óssea são ferramentas vitais para testar hipóteses relacionadas com a sobrevivência das células tumorais leucêmicas e manutenção de MRD durante a exposição quimioterapia. Enquanto modelos de ratos definir o padrão ouro para questões de teste relacionados com a eficácia da droga, co-cultura 2D continua a ser uma metodologia de custo eficaz para testar hipóteses e estratégias de droga relacionados com o apoio microambiente amanhã osso da sobrevivência das células leucêmicas. Muitos grupos têm demonstrado que a co-cultura de células leucêmicas com BMSC ou OB fornece uma vantagem de sobrevivência quando desafiados com agentes quimioterápicos 9,10,12-14,19-21. modelagem de trabalho CD34 imatura normais + hematopoietic células em co-cultura com células estaminais mesenquimais (MSC) revelou que as células hematopoiéticas irá interagir com a monocamada aderente de MSCs para formar três populações espaciais distintas de células hematopoiéticas 22,23. Proliferação e diferenciação das células CD34 + foi efectuada em relação à sua localização dentro da co-cultura de 22. Nós expandimos nesta observação para testar questões relacionadas com suporte de células microambiente estromal de medula óssea de uma população resistente de células tumorais dentro de uma co-cultura 2D e seu isolamento para análise a jusante.

Ao contrário dos modelos de co-cultura 2D convencionais que tipicamente retirarem amostras de células leucémicas por remoção do tumor suspenso, o nosso modelo mostra que a co-cultura representa uma interacção mais dinâmica em que as células leucémicas em co-cultura com BMSC ou forma de OB três subpopulações em relação ao BMSC ou OB monocamada (Figura 1). As subpopulações de tumores que se formam são suspensas (S) do tumor, which está flutuando livremente nos meios de comunicação; fase brilhante (PB) que é feita aderir à superfície do BMSC ou OB; e os dim fase (PD), que enterraram debaixo da BMSC ou OB monocamada (Figura 1). Neste modelo, verificou-se que uma alimentação rigorosa e programação reseeding é importante para alcançar resultados consistentes em um modelo de co-cultura e, portanto, que alimentam as co-culturas em intervalos de 4 dias e transferir tumor para novas monocamadas BMSC ou OB a cada 12 dias. Isto pode requerer modificação para tipos tumorais alternativos, conforme necessário. O número de células tumorais que vai migrar abaixo da BMSC ou OB para formar a população DP podem variar entre diferentes células leucémicas. Esta pode ser uma limitação do modelo, quando o número de células tumorais PD são baixos o que torna difícil para coletar células suficientes para análise a jusante. Em alguns casos, este problema pode ser superado através da criação de replicar co-culturas para permitir a conjugação de três subpopulações individuais.

Como este modelo de reencontra-se na interacção de células de tumor com a BMSC ou OB é importante dispor de um método eficaz para remover a contaminação de células do estroma para tratar biologia específica das células leucémicas. Para realizar essa separação de células tumorais de estroma que usamos colunas G10. configuração e uso adequado dessas colunas é crucial para o isolamento de populações tumorais puras para análise a jusante. Como destacado na figura 2B, a execução adequada dos G10 separação coluna de resultados na recuperação de células tumorais em mais de 99% de pureza. Isto permite a análise a jusante das células leucémicas sem complicação de interpretação dos resultados que resultariam de contaminação de células do estroma. É importante observar que todos os tipos de células leucémicas se linhas celulares ou amostras de doentes primárias irá variar um pouco em sua capacidade de passar através das colunas G10. Antes do uso em experimentos de grande escala os usuários devem determinar o número de células leucêmicas eles devem de entrada para recuperar o montante necessário desejado fou as suas necessidades específicas a jusante. Além disso, a quantidade de meio de lavagem correu através da coluna G10 pós incubação pode ser aumentado para tentar aumentar o número de células recuperadas. Deve ser tomado cuidado para assegurar que as lavagens adicionais não causam contaminação de células do estroma, que pode ser determinada por lavagem pós contagem de células por citometria de fluxo ou análise de fluxo através.

Ao estabelecer este modelo, observou-se que as células leucémicas recuperados a partir da população PD aumentaram viabilidade em relação às células leucémicas cultivadas em apenas meio, bem como para aqueles recuperados a partir das populações de S ou PB do mesmo co-cultura, quando expostos à quimioterapia citotóxica (Figura 3 B). Isto é importante porque ela representa uma população de células leucémicas in vitro que derivam protecção acentuada da quimioterapia. Isso fornece uma ferramenta útil para testar estratégias de tratamento destinadas a segmentação da população tumor mais resistentes, que é apoiado poro microambiente da medula óssea. Além disso, porque estas células leucémicas são tão bem protegido pela BMSC ou co-cultura de OB é passível de in vitro estratégias de tratamento combinado, que em meio sozinho ou modelos de co-cultura padrão pareceria ou mataria completamente o tumor que não é sempre são representativos dos efeitos observados em microambiente suportado populações leucêmicas resistentes.

Finalmente, acreditamos que a utilização deste modelo pode fornecer informações valiosas sobre as interacções entre BMSC / OB, e células leucémicas, que são responsáveis ​​pela resistência a um tratamento de quimioterapia, levar a MRD, e subsequentemente recaída. Este modelo fornece uma plataforma in vitro para projetar experimentos que irão informar melhor os modelos pré-clínicos a jusante. Embora nós mostramos uso deste modelo para testar interações entre células estromais da medula óssea e todas as células leucêmicas derivados, estamos esperançosos de que as direções futuras e aplicações deste modelo será noseful em uma variedade de doenças malignas em que o microambiente da medula óssea proporciona um local de Santuário de tumores durante a intervenção quimioterapêutica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
G10 sephadex beads Sigma G10120 Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe BD 309604
Glass wool Pyrex 3950
1-way stopcocks World Precision Instruments, Inc. 14054-10
50 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021039 Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021037 Used for cell collection
Fetal Bovine Serum Sigma F6178
0.05% Trypsin  Mediatech, Inc. 25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 664160
Culture media
Osteoblast culture media  PromoCell C-27001 For human osteoblast media 
RPMI 1640 media Mediatech, Inc. 15-040 For tumor media prepation 
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts PromoCell C-12720 Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. 
Human Bone Morrow Stromal Cells WVU Biospecimen Core De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH ATCC ATCC-CRL-8286 REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
SD-1 DSMZ ACC 366 SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.

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