Modellazione chemioterapia leucemia resistente * These authors contributed equally

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Slone, W. L., Moses, B. S., Evans, R., Piktel, D., Martin, K. H., Petros, W., Craig, M., Gibson, L. F. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (108), e53645, doi:10.3791/53645 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Preparazione avanzata

  1. Preparazione particelle G10 destrano.
    1. Preparare G10 impasto con l'aggiunta di 50 ml di PBS 1X a 10 particelle g G10. Mescolare per inversione e consentire G10 a stabilirsi fuori tampone fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
    2. Il giorno del G10 di separazione colonna, aspirare PBS dalle particelle del G10 stanziali e aggiungere 50 ml di PBS fresco. Mescolare per inversione. Ripetere due volte, aggiungendo 50 ml PBS fresco di particelle G10 stabiliti e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
  2. Coltura BMSC e OB.
    1. Mantenere sia BMSC o OB a 37 ° C in 6% CO 2 e coltivati ​​su 10 cm piastre di coltura tissutale fino al raggiungimento del 90% di confluenza.
    2. Trypsinize BMSC o cellule OB e dividere 1: 2 su nuove piastre di 10 cm. Le cellule sono coltivate a tali norme fino al momento leucemica co-coltura.

2. Stabilire e mantenere Co-cultura

  1. Aggiungere 5-20 x 10 6 cellule leucemiche in 10 ml di specifici terreni di coltura del tumore Onto un 80% -90% confluenti BMSC o la piastra OB.
    NOTA: Il nostro laboratorio mantiene co-colture a 37 ° C in 5% O 2 ricapitolare meglio microambiente midollare che ha dimostrato variare da 1% al 7% 16-18. Tuttavia, il mantenimento co-colture in questa tensione di ossigeno non è critico per l'istituzione dei tre sottopopolazioni leucemiche ed è a discrezione del laboratorio.
  2. Ogni 4 ° giorno rimuovere tutti ma 1 ml di media (tra cui le cellule leucemiche in sospensione) e sostituirlo con 9 ml di terreni di coltura leucemica fresco. Durante la rimozione 9 ml di media dal piatto, fare attenzione a non disturbare il lardo aderente BMSC o OB.
    1. Rimuovere supporti inclinando piastra al supporto laterale e aspirato in un angolo della piastra. Inoltre, quando si aggiunge mezzi freschi, assicurarsi di aggiungere goccia a goccia in un angolo del piatto contro la parete laterale per garantire il minimo disturbo dello strato aderente BMSC o OB.
  3. Dopo il 12 ° giorno di co-coltura, lavare le cellule leucemiche da BMSC o strato OB pipettando terreni di coltura dal piatto su e giù delicatamente sopra il piatto di circa 5 a 10 volte e poi raccogliere in tubo da 15 ml. Reseed sul nuovo 80% -90% BMSC confluenti o piastra OB come descritto al punto 2.1.
    NOTA: Il dolce risciacquo della co-coltura come descritto al punto 2.3 verrà rimosso S e PB cellule leucemiche senza interrompere il monostrato BMSC o OB. Questo permette alle cellule tumorali solo per essere trasferite nel successivo piastra di co-coltura. Questo ciclo di 12 giorni può essere ripetuto tante volte quante sono necessarie in base alle esigenze degli utenti.

3. Preparazione Colonne G10 Bead

NOTA: Se è richiesta l'analisi a valle sterile o coltura dopo la separazione colonna G10 le seguenti operazioni devono essere eseguite con tecnica sterile e le colonne del G10 dovrebbe essere messa a punto in una cappa biologica sterile.

  1. Pre-warm coltura cellulare supporti a 37 ° C in bagno d'acqua (~ 30 ml per colonna). Usando una siringa monouso ml 10, rimuovere ed eliminare stantuffo. Aggiungere lana di vetro a siringa.
  2. Usando le pinzette, separare lana di vetro in trefoli sottili. Aggiungere più strati di lana di vetro leggermente imballato alla siringa fino a quando 2/3 della siringa è pieno di lana di vetro.
    NOTA: La lana di vetro è di fondamentale importanza per evitare che particelle G10 libere di contaminare la raccolta delle cellule leucemiche. Assicurarsi lana di vetro è imballato abbastanza per sostenere le particelle G10, ma non troppo densamente imballato per bloccare il flusso multimediale attraverso la colonna.
  3. Attaccare 1-way rubinetto alla punta della siringa nella posizione chiusa.
  4. Morsetto colonna siringa per anello di stare abbastanza alto in modo da un tubo conico da 50 ml (tubo di raccolta) può essere posizionato sotto il rubinetto. Mettere tubo di raccolta nella colonna siringa.
  5. Usando una pipetta 10 ml aggiungere, goccia a goccia, le particelle G10 risospesi in PBS alla colonna in cimala lana di vetro. Continuare aggiungendo particelle G10 fino a ml pellet ~ 2 (come misurato dal graduazioni sulla siringa) di G10 particelle forme sopra della lana di vetro.
  6. Equilibrare la colonna G10 con i media pre-riscaldato.
    1. Aggiungere 2 ml di media pre-riscaldato a colonna. Aprire la valvola rubinetto lentamente in modo che il supporto fuoriesce colonna goccia a goccia.
    2. Ripetere il punto 3.6.1 fino ad un totale di 10 ml di media pre-riscaldato è stato eseguito attraverso la colonna.
      NOTA: Se le particelle G10 si vedono nel flusso attraverso il tubo di raccolta, o 1) aggiungere più particelle del G10 di mantenere ~ 2 ml pellet assicurandosi che nessuna particella aggiuntivi G10 fuga dalla colonna o 2) sostituzione della colonna con uno inutilizzato e ripetere passi 3.4-3.6.1.
    3. Dopo gli scarichi dei media pre-riscaldato dalla colonna, chiudere il rubinetto e scartare tubo di raccolta con flusso attraverso. Aggiungere un nuovo tubo di raccolta sotto la colonna. Colonna è pronto per essere caricato con supporti + miscela di cellule.
      NOTA: Colonnedeve essere usato immediatamente e non ha permesso di asciugare.

4. Separare 3 sottopopolazioni all'interno di Co-cultura

  1. Raccolta di sottopopolazione di sospensione (S) del tumore.
    1. supporti Aspirare dalla piastra di co-coltura con pipetta e delicatamente riapplicare lo stesso supporto per sciacquare la piastra e raccogliere supporti contenenti cellule leucemiche in un tubo da 15 ml. Le cellule leucemiche raccolti sono la sottopopolazione S.
  2. Raccolta di Fase Bright (PB) sottopopolazione tumorale.
    1. Aggiungere 10 ml di mezzi freschi di nuovo sul piatto co-coltura. Risciacquare vigorosamente pipettando mezzi aggiunti su e giù per circa 5 volte per rimuovere le cellule leucemiche aderenti ma non abbastanza difficile da staccare aderente / OB componente BMSC.
    2. Aspirare con pipetta e raccogliere i media in un tubo da 15 ml. Le cellule raccolte sono la sottopopolazione PB.
  3. Raccolta di Fase Dim (PD) sottopopolazione tumorale.
    1. Piastra Risciacquare con 1 ml di PBS a remsupporti rimanenti ove. Trypsinize piastra di co-coltura con 3 ml di tripsina e posto in 37 ° C incubatore per 5 min.
    2. Rimuovere la piastra di incubatore e picchiettare delicatamente lati della piastra per rimuovere aderente BMSC / OB.
    3. Aggiungere 1 ml di siero fetale bovino (FBS) e pipetta su e giù 3-5 volte di spezzare grandi aggregati di cellule.
    4. Raccogliere media con cellule in una provetta da 15 ml. Queste cellule sono sottopopolazione PD non purificata con BMSC / OB pure.
  4. Centrifuga 3 isolato sottopopolazioni a 400 xg per 7 minuti. Aspirare e scartare il surnatante quindi risospendere individualmente pellet in 1 ml di media pre-riscaldato. Le cellule sono pronte per essere caricata su una colonna G10.

5. Caricamento co-coltura cellule su G10 Colonna

NOTA: Assicurarsi che il rubinetto sia completamente chiuso prima di aggiungere le cellule supporti contenenti la colonna G10. Inoltre, ogni sottopopolazione deve essere eseguito su una colonna G10 separato in modo da non introducuna e ogni pregiudizio tra le popolazioni in analisi a valle.

  1. Usando una pipetta 1000 ml, aggiungere 1 ml di ciascuna sottopopolazione di cellule nei media pre-riscaldato a una colonna G10 separata goccia a goccia. Assicurarsi che il supporto contenente le cellule rimane sopra o all'interno G10 pellet. Consentono alle cellule di incubare il G10 a pellet per 20 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Stopcock rimane chiuso per durata dell'incubazione.

6. Raccolta cellule leucemiche da G10 Colonna

  1. Aggiungere 1-3 ml supporti pre-riscaldato a ogni colonna G10. Valvola rubinetto aperto e consentire mezzi per uscire lentamente la colonna goccia a goccia.
    NOTA: E 'fondamentale per mantenere una portata lenta dalla colonna o il pellet contenente G10 BMSC / OB può lavare fuori della colonna e contaminare le isolate cellule leucemiche.
  2. Continuare ad aggiungere supporti pre-riscaldato con piccoli incrementi (1-2 ml) a colonna G10 fino a un totale di 15 a 20 ml ha attraversato colonna e sono state raccolte. Chiudere il rubinetto vatubo di raccolta lve e cappuccio.
    NOTA: se una pallina G10 particella è visto nella parte inferiore della provetta di raccolta, rimuovere delicatamente il supporto dal tubo lasciando G10 grano di particella indisturbati e trasferimento al nuovo tubo.
  3. Centrifuga raccolte supporto a 400 xg per 7 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in tampone appropriato per l'applicazione a valle.
  4. Le cellule sono ora una popolazione pura di cellule leucemiche gratuitamente BMSC o contaminazione OB e sono pronti per essere applicato ad applicazioni a valle a discrezione dell'utente.
    NOTA: vitalità cellulare leucemica dovrebbe rimanere invariato quando si passa celle attraverso le colonne del G10.

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Representative Results

L'installazione di successo e la cultura di questo modello di co-coltura comporterà la creazione di 3 sottopopolazioni di cellule leucemiche relativi alla aderenti BMSC o OB monostrato. Figura 1 mostra come tutte le cellule seminate in un monostrato BMSC appaiono inizialmente come una sola popolazione di sospensione cellule leucemiche. Nel corso di 4 giorni cellule leucemiche interagiscono con il BMSC per formare 3 sottopopolazioni spaziali di cellule leucemiche (sospeso (S), fase luminosa (PB), e dim di fase (PD)). Mentre i 3 sottopopolazioni di cellule tumorali possono comunemente essere osservati dopo 24 ore di co-coltura con BMSC o OB abbiamo co-coltura delle cellule per 4 giorni per consentire le dinamiche pieni e le interazioni tra le cellule leucemiche e BMSC / OB cellule che si terrà prima di qualsiasi manipolazione o di sperimentazione ha luogo (Figura 1). Inoltre, notare che mantenere i co-culture a una tensione di ossigeno del 5% ricapitolare la fisiologia del midollo osseo, che ha apen segnalato per variare da 1% -7% 16-18.

La stragrande maggioranza delle analisi valle richiede la separazione delle cellule leucemiche dal BMSC o OB. Per raggiungere questo obiettivo utilizziamo le colonne del G10 per raccogliere una popolazione pura di cellule leucemiche (Figura 2A). Dopo tripsinizzazione delle cellule BMSC e PD REH una popolazione mista è visto da due distinte popolazioni avanti / laterali mediante citometria di flusso (figura 2b, pannello superiore). A seguito di separazione G10 una popolazione pura di soli REH tutte le cellule viene recuperato, che è stata confermata dal avanti / side scatter citometria a flusso (Figura 2B, pannello inferiore).

L'uso di questo modello di co-coltura e la capacità di isolare le cellule leucemiche da 3 sottopopolazioni quando in co-coltura con BMSC o OB permette di interrogazione del fenotipo cellulare leucemica in relazione alla sua posizione spaziale rispetto al aderenti BMSC o OBmonostrato. Di particolare interesse, è che tutte le cellule recuperate dalla popolazione PD di un BMSC o di OB co-coltura hanno poco o nessun morte cellulare in seguito all'esposizione alla chemioterapia citotossica (Figura 3A, B).

Figura 1
Figura 1. Tutte le cellule in co-coltura con BMSC o OB forma tre popolazioni spaziali. Il nostro laboratorio utilizza un sistema di co-coltura in vitro per modellare le interazioni delle cellule leucemiche con le cellule stromali del midollo osseo derivate microambiente (BMSC o OB). Per stabilire co-coltura, le cellule leucemiche (rosso) sono seminate su un 80% -90% confluenti monostrato di BMSC o OB (blu), che viene indicato come 'tempo 0'. Co-colture sono mantenute a 37 ° C al 5% di ossigeno per approssimare le condizioni del microambiente midollare. cellule leucemiche inizieranno a formare 3 sottopopolazioni fin da 24 ore, ma per permettere interazioni completi di Form permettiamo co-culture 4 giorni per stabilire prima di utilizzare cellule leucemiche per gli esperimenti. Di giorno 4 (pannelli di destra), tre sottopopolazioni di cellule leucemiche formeranno rispetto al monostrato aderente. Lo schema (in alto a destra) e la microscopia a contrasto di fase (in basso a destra) visualizza il sospeso (S) cellule leucemiche liberamente fluttuanti nei media; fase luminosa (PB) cellule leucemiche che si rispetti, per la superficie del monostrato BMSC o OB; e le dim fase (PD), le cellule leucemiche che hanno migrato sotto il monostrato BMSC o OB. Barra di scala rappresenta 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. L'utilizzo di colonne G10 permette la separazione di tutte le cellule da BMSC / OB. (A) Dimostrazione del processo di utilizzo di un col G10umn per separare tutte le cellule da BMSC / OB co-coltura per ottenere una popolazione pura di cellule tumorali per l'analisi a valle. Da sinistra a destra, una miscela di tutte le cellule e / ob cellule BMSC viene aggiunto alla parte superiore della colonna G10; (Centro) miscela di cellule si depositerà nel liquame G10 e deve essere incubato a temperatura ambiente per 20 minuti (Nota: Rubinetto di chiusura è in posizione di chiusura in tutta primi due passi); (a destra) cellule leucemiche vengono recuperati aprendo il rubinetto e risciacquo colonna con mezzi di pre-riscaldato. (B) Pannello superiore mostra prima della separazione G10 che vi è una popolazione mista di cellule contenenti BMSC (porta blu) e REH Tutte le celle (cancello rosso ) valutando in avanti (FSC) e side scatter (SSC) analisi. Pannello inferiore, a seguito di separazione G10 solo la popolazione pura di REH tutte le cellule (cancello rosso) rimangono con la contaminazione meno dell'1% delle cellule stromali (porta blu). Clicca qui per vedere una versione più grande di Thi s figura.

Figura 3
Figura 3. PD cellule leucemiche hanno una maggiore resistenza all'esposizione chemioterapia. SD-1 le cellule leucemiche recuperati dalla popolazione PD di una co-coltura BMSC (A) non visualizzare ridotta vitalità in seguito ad una esposizione di 4 giorni a Ara-C [1 micron] , MTX [50 micron], o un videoregistratore [25 micron], simile a controlli non trattati (notare che una seconda dose di Ara-C ha aggiunto a 48 ore per tenere conto di eventuali perdite di droga a causa di stabilità). Cellule leucemiche da solo i mezzi di comunicazione, le popolazioni S, e PB hanno ridotto notevolmente la vitalità, come determinato dal Trypan Blue exclusion.SD-1 cellule leucemiche co-coltura con cellule OB visualizzare un andamento simile a viabilità (B). I risultati sono espressi come media ± SEM. (*) Indica p <0.05, spaiato t-test rispetto ai controlli non trattati.5fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

malattia residua minima (MRD) che contribuisce alla ricaduta della malattia continua ad essere una sfida clinica nel trattamento aggressivo refrattario ALL, nonché una serie di altre neoplasie ematologiche. Il microambiente del midollo osseo è il sito più comune di recidiva in ALL 3,8. In quanto tale, i modelli che modellano il microambiente del midollo osseo sono strumenti essenziali per testare ipotesi legate alla sopravvivenza delle cellule tumorali leucemiche e manutenzione di MRD durante l'esposizione a chemioterapia. Mentre i modelli del mouse definiscono il gold standard per domande di prova relativi alla efficacia dei farmaci, 2D co-coltura continua ad essere una metodologia efficace costo per la verifica delle ipotesi e strategie di droga legati alla indomani osso sostegno microambiente di sopravvivenza delle cellule leucemiche. Molti gruppi hanno dimostrato che la co-coltura di cellule leucemiche con BMSC o OB fornisce un vantaggio di sopravvivenza quando provocati con agenti chemioterapici 9,10,12-14,19-21. modellazione lavoro normale CD34 + immaturo Hemacellule topoietic in co-coltura con cellule staminali mesenchimali (MSC) ha rivelato che le cellule ematopoietiche interagiranno con il monostrato aderente MSC per formare tre popolazioni spaziali distinti di cellule ematopoietiche 22,23. Proliferazione e differenziazione delle cellule CD34 + è stata effettuata rispetto alla loro posizione all'interno della co-coltura 22. Abbiamo ampliato su questa osservazione per testare le domande relative al midollo osseo supporto di cellule stromali microambiente di una popolazione di cellule tumorali resistenti all'interno di un 2D co-cultura e il suo isolamento per l'analisi a valle.

A differenza dei modelli 2D co-coltura standard che tipicamente campionare cellule leucemiche di rimozione del tumore in sospensione, il nostro modello mostra che co-coltura rappresenta un'interazione più dinamica in cui le cellule leucemiche in co-coltura con BMSC o forma OB tre sottopopolazioni rispetto al BMSC o OB monostrato (Figura 1). Le sottopopolazioni tumorali che si formano sono sospesi (S) del tumore, WHIch è liberamente fluttuante nei media; Fase luminosa (PB) che viene fatto aderire alla superficie del BMSC o OB; e le dim fase (PD), che hanno sepolto sotto la BMSC o OB monostrato (Figura 1). In questo modello, abbiamo scoperto che un'alimentazione rigorosa e il calendario risemina è importante per ottenere risultati consistenti in un modello di co-coltura e quindi ci alimentare i co-colture ad intervalli di 4 giorni e il trasferimento del tumore a nuovi monostrati BMSC o OB ogni 12 giorni. Questo può richiedere la modifica di tipi di tumore alternative a seconda delle necessità. Il numero di cellule tumorali che migreranno sotto della BMSC o OB per formare la popolazione PD può variare tra diverse cellule leucemiche. Questo può essere una limitazione del modello, quando il numero di cellule tumorali PD sono bassi rendendo difficile raccogliere cellule sufficiente per l'analisi a valle. In alcuni casi questo problema può essere superato stabilendo replicare co-colture per consentire unione delle tre singole sottopopolazioni.

Dato che questo modello di risi trova su interazioni cellula tumorale con il BMSC o OB è importante disporre di un metodo efficace per eliminare la contaminazione delle cellule stromali di affrontare biologia specifica delle cellule leucemiche. Per realizzare questa separazione delle cellule tumorali da stroma che usiamo colonne G10. l'installazione corretta e l'uso di queste colonne è fondamentale per l'isolamento delle popolazioni tumorali puri per l'analisi a valle. Come evidenziato in Figura 2B, la corretta esecuzione dei G10 risultati separazione colonna nel recupero di cellule tumorali a più di 99% di purezza. Questo consente per l'analisi a valle delle cellule leucemiche senza complicazioni di interpretazione dei risultati che deriverebbero dalla contaminazione delle cellule stromali. È importante notare che tutti i tipi di cellule leucemiche sia linee cellulari o campioni elementari pazienti variano leggermente nella loro capacità di passare attraverso le colonne G10. Prima dell'uso in esperimenti su vasta scala utenti devono determinare il numero di cellule leucemiche devono input per recuperare la quantità necessaria desiderata fo le loro specifiche esigenze a valle. Inoltre, la quantità di materiale di lavaggio corse colonna montante incubazione G10 può essere aumentata per cercare di aumentare il numero di cellule recuperate. Si deve prestare attenzione per assicurare che i lavaggi aggiuntivi non provocano contaminazione delle cellule stromali che può essere determinato dopo lavaggio con conta di cellule o di citometria a flusso di analisi di flusso attraverso.

Nello stabilire questo modello, abbiamo osservato che le cellule leucemiche recuperati dalla popolazione PD sono aumentati vitalità rispetto alle cellule leucemiche coltivate in mezzi sola, così come a quelli recuperato dalle popolazioni S o PB nello stesso co-coltura quando esposti alla chemioterapia citotossica (Figura 3 AB). Ciò è significativo perché rappresenta una popolazione di cellule leucemiche in vitro che derivano protezione pronunciata dalla chemioterapia. Questo fornisce uno strumento utile per testare strategie terapeutiche volte a colpire la popolazione tumore più resistente, che è supportato damicroambiente midollare. Inoltre, poiché queste cellule leucemiche sono così ben protetti dal BMSC o OB co-coltura è suscettibile di in vitro strategie di trattamento di combinazione, che nei media solo o modelli di co-coltura standard sembrerebbero o sarebbero completamente uccidere il tumore che non è sempre rappresentativo di effetti osservati in resistenti microambiente sostenuto popolazioni leucemiche.

Infine, riteniamo che l'uso di questo modello può fornire informazioni preziose sulle interazioni tra BMSC / OB, e le cellule leucemiche che sono responsabili di resistenza al trattamento chemioterapico, portare alla MRD, e successivamente ricaduta. Questo modello fornisce una piattaforma in vitro per progettare esperimenti che meglio informare modelli pre-clinici valle. Anche se si mostra l'uso di questo modello per testare le interazioni tra cellule stromali del midollo osseo e tutte le cellule leucemiche derivate, siamo fiduciosi che le future direzioni e le applicazioni di questo modello sarà di noieful in una varietà di tumori maligni in cui il microambiente midollare fornisce un sito di santuario per tumori durante l'intervento chemioterapico.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
G10 sephadex beads Sigma G10120 Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe BD 309604
Glass wool Pyrex 3950
1-way stopcocks World Precision Instruments, Inc. 14054-10
50 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021039 Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021037 Used for cell collection
Fetal Bovine Serum Sigma F6178
0.05% Trypsin  Mediatech, Inc. 25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 664160
Culture media
Osteoblast culture media  PromoCell C-27001 For human osteoblast media 
RPMI 1640 media Mediatech, Inc. 15-040 For tumor media prepation 
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts PromoCell C-12720 Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. 
Human Bone Morrow Stromal Cells WVU Biospecimen Core De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH ATCC ATCC-CRL-8286 REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
SD-1 DSMZ ACC 366 SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.

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