Modélisation chimiothérapie leucémie résistant * These authors contributed equally

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Slone, W. L., Moses, B. S., Evans, R., Piktel, D., Martin, K. H., Petros, W., Craig, M., Gibson, L. F. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (108), e53645, doi:10.3791/53645 (2016).

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Abstract

Protocol

1. Préparation avancée

  1. Préparation de particules G10 dextran.
    1. Préparer G10 suspension en ajoutant 50 ml de PBS 1x à 10 g de particules G10. Mélanger par inversion et permet G10 se déposer de tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° CO / N.
    2. Le jour du G10 colonne de séparation, aspirer PBS à partir de particules G10 installés et ajouter 50 ml PBS frais. Mélanger par inversion. Répéter deux fois, en ajoutant 50 ml PBS frais à particules G10 sédentaires et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de servir.
  2. Cultivant BMSC et OB.
    1. Maintenir à la fois BMSC ou OB à 37 ° C dans 6% de CO 2 et 10 cm cultivées sur des plaques de culture tissulaire jusqu'à 90% de confluence est atteinte.
    2. Trypsiniser BMSC ou cellules OB et divisés 1: 2 sur de nouvelles plaques cm 10. Les cellules sont cultivées à ces normes jusqu'à son utilisation pour la co-culture leucémique.

2. Établir et maintenir des Co-culture

  1. Ajouter 5-20 x 10 6 cellules leucémiques in 10 ml de milieu de culture spécifique de la tumeur sur un 80% -90% de confluence BMSC ou plaque d'OB.
    NOTE: Notre laboratoire maintient co-cultures à 37 ° C dans 5% de O 2 pour mieux récapituler le microenvironnement de la moelle osseuse qui a été montré à la gamme de 1% à 7% de 16 à 18. Toutefois, le maintien des co-cultures à cette tension d'oxygène est pas critique pour la mise en place des trois sous-populations leucémiques et est à la discrétion du laboratoire.
  2. Chaque 4 e jour supprimer tout sauf 1 ml de médias (y compris les cellules leucémiques en suspension) et le remplacer par 9 ml frais milieux de culture leucémique. Lors du retrait de 9 ml de milieu de la plaque, veiller à ne pas perturber la couche adhérente BMSC ou OB.
    1. Retirez le support en inclinant la plaque sur le support latéral et aspirer dans le coin de la plaque. En outre, lors de l'ajout du milieu frais, veillez à ajouter goutte à goutte dans le coin de la plaque contre la paroi latérale pour assurer une perturbation minimale de la couche adhérente BMSC ou OB.
  3. Après le 12 e jour de co-culture, rincer les cellules leucémiques de BMSC ou couche de OB par pipetage des milieux de culture de plat et doucement sur ​​le plat d'environ 5 à 10 fois, puis recueillir dans 15 ml tube conique. Réensemencer sur un nouveau 80% -90% de confluence BMSC ou plaque OB comme décrit dans l'étape 2.1.
    NOTE: Le rinçage doux de la co-culture tel que décrit dans l'étape 2.3 va éliminer les cellules leucémiques S et PB sans perturber la monocouche BMSC ou OB. Ceci permet que des cellules tumorales devant être transférées à la plaque de co-culture suivante. Ce cycle de 12 jours peut être répétée autant de fois que nécessaire en fonction des besoins des utilisateurs.

3. Préparer les colonnes perles G10

NOTE: Si l'analyse ou la culture aval stérile est nécessaire après la séparation de la colonne G10 les étapes suivantes doivent être effectuées en utilisant une technique stérile et colonnes du G10 devraient être mis en place dans une hotte biologique stérile.

  1. Pré-warm milieux de culture de cellules à 37 ° C dans un bain d'eau (~ 30 ml par colonne). En utilisant une seringue de 10 ml à usage unique, enlever et jeter plongeur. Ajouter la laine de verre de la seringue.
  2. En utilisant une pince à épiler, séparer la laine de verre en fines mèches en vrac. Ajouter plusieurs couches de laine de verre légèrement tassée à la seringue jusqu'à 2/3 de la seringue est rempli de laine de verre.
    NOTE: La laine de verre est crucial pour empêcher les particules G10 lâches de contaminer la collecte de cellules leucémiques. Assurez-vous que la laine de verre est emballé assez pour soutenir les particules G10, mais pas trop dense pour bloquer l'écoulement de médias à travers la colonne.
  3. Fixez 1 voie robinet à la pointe de la seringue dans la position fermée.
  4. colonne de seringue de serrage à bague reposer suffisamment élevée pour un tube conique de 50 ml (tube de collecte) peut être placé sous le robinet. Placez le tube de collecte dans la colonne de la seringue.
  5. En utilisant une pipette de 10 ml ajouter, goutte à goutte, des particules G10 remises en suspension dans PBS à la colonne au-dessus dela laine de verre. Continuez à ajouter des particules G10 jusqu'à ce qu'un ml culot ~ 2 (tel que mesuré par des graduations sur la seringue) du G10 particules formes au-dessus de la laine de verre.
  6. Équilibrer la colonne G10 avec les médias préchauffées.
    1. Ajouter 2 ml de milieu préchauffée à la colonne. robinet d'arrêt ouvert lentement, de sorte que le support sort de la colonne, goutte à goutte.
    2. Répétez l'étape 3.6.1 jusqu'à un total de 10 ml de milieu préchauffé ont été couru à travers la colonne.
      NOTE: Si des particules du G10 sont vus dans l'écoulement à travers dans le tube de collecte, soit 1) ajouter plus de particules du G10 à maintenir ~ 2 ml culot faire en sorte qu'aucune particule G10 supplémentaires échapper à la colonne ou 2) remplacer la colonne avec un un utilisé et répétez étapes 3.4-3.6.1.
    3. Après les drains des médias préchauffées de la colonne, fermer le robinet d'arrêt et jeter le tube collecteur d'écoulement à travers. Ajouter un nouveau tube de prélèvement dans la colonne. La colonne est prêt à être chargé avec un mélange de médias + cellulaire.
      NOTE: Les Colonnesdoit être utilisé immédiatement et ne laisse sécher.

4. Séparation des 3 sous-populations au sein de co-culture

  1. Collection sous-population de la suspension (S) de la tumeur.
    1. Aspirer le milieu de la plaque de co-culture avec la pipette et doucement appliquer de nouveau les mêmes médias pour rincer la plaque et de recueillir les médias contenant des cellules leucémiques dans un tube de 15 ml conique. Les cellules leucémiques recueillies sont la sous-population S.
  2. Collection de la phase Bright (PB) sous-population de la tumeur.
    1. Ajouter 10 ml du milieu frais de retour sur la plaque de co-culture. Rincer vigoureusement par pipetage médias ajoutée de haut en bas environ 5 fois pour éliminer les cellules leucémiques adhérentes, mais pas assez fort pour déloger adhérente BMSC / OB composant.
    2. Aspirer à la pipette et recueillir les médias dans un tube conique de 15 ml. Les cellules recueillies sont la sous-population PB.
  3. Collection de la phase Dim (PD) sous-population de la tumeur.
    1. plaque rinçage avec 1 ml de PBS à remmédias restants ove. Trypsiniser plaque co-culture avec 3 ml de trypsine et le lieu dans 37 ° C incubateur pendant 5 min.
    2. Retirer la plaque de l'incubateur et tapotez doucement côtés de la plaque pour déloger adhérente BMSC / OB.
    3. Ajouter 1 ml de sérum de veau fœtal (FBS) et la pipette de haut en bas 3-5 fois pour briser les grands agrégats de cellules.
    4. Collecter des supports avec les cellules dans un tube conique de 15 ml. Ces cellules sont la sous-population de PD non purifié avec BMSC / OB ainsi.
  4. sous-populations centrifugeuse 3 isolé à 400 g pendant 7 min. Aspirer et éliminer le surnageant puis remettre en suspension individuellement pastilles dans 1 ml de médias préchauffées. Les cellules sont prêtes à être chargées sur une colonne G10.

5. Chargement de co-culture des cellules sur la colonne G10

NOTE: Assurez-vous que le robinet est complètement fermé avant d'ajouter les cellules des milieux contenant la colonne G10. En outre, chaque sous-population doit être exécuté sur une colonne G10 séparée afin de ne pas Introduce toute polarisation entre les populations dans l'analyse en aval.

  1. En utilisant une pipette de 1000 pi, ajouter 1 ml de chaque sous-population de cellules dans des milieux préchauffées à une colonne séparée G10 goutte à goutte. Assurez-vous que le support contenant les cellules reste au-dessus ou au sein du G10 culot. Laisser les cellules incuber le G10 culot pendant 20 min à température ambiante.
    NOTE: Robinet reste fermé pendant la durée de l'incubation.

6. Recueillir les cellules leucémiques du G10 Colonne

  1. Ajouter 1-3 ml de milieu préchauffé à chaque colonne G10. Ouvrir robinet d'arrêt et de permettre aux médias de sortir lentement la colonne goutte à goutte.
    NOTE: Il est essentiel de maintenir un débit lent de la colonne ou le culot G10 contenant BMSC / OB peut laver de la colonne et de contaminer les cellules leucémiques isolées.
  2. Continuer à ajouter des médias préchauffées par petits incréments (1-2 ml) à la colonne de G10 jusqu'à un total de 15 à 20 ml a traversé la colonne et a été recueilli. Fermer le robinet vatube de collecte LVE et le bouchon.
    NOTE: Si un culot G10 de particules est observée à la base du tube de collecte, retirez délicatement les médias du tube laissant culot de particules G10 intact et le transfert dans un nouveau tube.
  3. Centrifugeuse recueilli médias à 400 g pendant 7 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans un tampon approprié pour application en aval.
  4. Les cellules sont maintenant une population pure de cellules leucémiques libres de BMSC ou contamination OB et sont prêtes à être appliquées à des applications en aval, à la discrétion de l'utilisateur.
    NOTE: la viabilité cellulaire leucémique devrait rester inchangée lors du passage des cellules à travers des colonnes du G10.

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Representative Results

Installation réussie et la culture de ce modèle de co-culture se traduira par la création de 3 sous-populations de cellules leucémiques par rapport à la BMSC ou OB monocouche adhérente. La figure 1 montre comment toutes cellules ensemencées dans une monocouche BMSC apparaissent d'abord comme une seule population de suspension les cellules leucémiques. Au cours des 4 jours cellules leucémiques interagissent avec le BMSC pour former 3 sous-populations de cellules leucémiques spatiales (suspendu (S), lumineux de phase (PB), et dim de phase (PD)). Alors que les 3 sous-populations de cellules tumorales peuvent généralement être observés après 24 heures de co-culture avec des BMSC ou OB nous avons co-culture les cellules pendant 4 jours pour permettre à toute la dynamique et les interactions entre les cellules leucémiques et BMSC cellules / OB aient lieu avant toute manipulation ou d'expérimentation a lieu (Figure 1). En outre, notons que nous maintenir les co-cultures à une tension d'oxygène de 5% de récapituler la physiologie de la moelle osseuse, ce qui a l'abeillen signalé à aller de 1% à 7% 16-18.

Une grande majorité de l'analyse en aval nécessite la séparation des cellules leucémiques de la BMSC ou OB. Pour cela, nous utilisons colonnes du G10 de récolter une population pure de cellules leucémiques (figure 2A). Suite à la trypsine des cellules BMSC et PD REH une population mixte est considérée par deux populations avant / latérales distinctes par cytométrie en flux (Figure 2B, panneau supérieur). Après la séparation G10 une population pure de seulement REH TOUS cellules est récupéré, ce qui a été confirmé par l'avant / diffusion latérale cytométrie en flux (Figure 2B, panneau inférieur).

L'utilisation de ce modèle de co-culture et de la capacité d'isoler les cellules leucémiques de 3 sous-populations en cas de co-culture avec des BMSC ou OB permet à l'interrogation du phénotype de cellules leucémiques par rapport à sa localisation spatiale par rapport à la BMSC adhérentes ou OBmonocouche. D'un intérêt particulier, est que toutes les cellules récupérées à partir de la population de PD d'un BMSC ou OB co-culture ont peu ou pas de mort cellulaire après une exposition à la chimiothérapie cytotoxique (figure 3A, B).

Figure 1
Figure 1. toutes les cellules de co-culture avec des BMSC ou OB forment trois populations spatiales. Notre laboratoire utilise un système de co-culture in vitro pour modéliser les interactions des cellules leucémiques avec des cellules de micro-environnement de la moelle osseuse provenant stromales (BMSC ou OB). Pour établir la co-culture, les cellules leucémiques (Rouge) sont ensemencées sur un 80% -90% de confluence monocouche de BMSC ou OB (Bleu), qui est désigné comme «Temps 0 '. Les co-cultures sont maintenues à 37 ° C sous 5% d'oxygène pour approcher les conditions du microenvironnement de la moelle osseuse. les cellules leucémiques vont commencer à former 3 sous-populations dès 24 heures, mais de permettre des interactions complètes à FOrm nous permettons à des co-cultures de 4 jours pour établir avant d'utiliser les cellules leucémiques pour les expériences. Par jour 4 (panneaux de droite), trois sous-populations de cellules leucémiques se forment par rapport à la monocouche adhérente. Le schéma (en haut à droite) et la microscopie à contraste de phase (en bas à droite) montrent la suspension (S) cellules leucémiques flottant librement dans les médias; lumineux de phase (PB) des cellules leucémiques qui sont collées à la surface de la monocouche BMSC ou OB; et les dim de phase (PD) de cellules leucémiques qui ont migré sous la monocouche BMSC ou OB. La barre d'échelle représente 10 microns. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Utilisation de colonnes G10 permet pour la séparation de toutes les cellules de BMSC / OB. (A) Démonstration du processus de l'aide d'un col de G10lonne de séparer toutes les cellules de BMSC / OB co-culture pour obtenir une population pure de cellules tumorales pour l'analyse en aval. De gauche à droite, un mélange de toutes les cellules et BMSC / ob cellules est ajouté à la tête de la colonne G10; (Center) mélange de cellules se régler dans la suspension de G10 et doit être incubé à la température ambiante pendant 20 min (Note: Le robinet d'arrêt est dans la position fermée tout au long de deux premières étapes); (à droite) des cellules leucémiques sont récupérés en ouvrant le robinet et rincer la colonne avec les médias préchauffées. (B) Le panneau supérieur montre avant la séparation de G10 qu'il ya une population mixte de cellules contenant BMSC (porte bleue) et REH TOUS cellules (porte rouge ) en évaluant l'avant (FSC) et de la diffusion latérale (SSC) analyse. Panneau de fond, après la séparation G10, seule la population pure de REH TOUS cellules (porte rouge) restent à la contamination à moins de 1% de cellules stromales (portail bleu). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de thi s figure.

Figure 3
Figure cellules leucémiques 3. PD ont SD-1 cellules leucémiques récupérés de la population de PD d'une co-culture BMSC (A) ne pas afficher la viabilité réduite après une exposition de 4 jours à l'Ara-C une résistance accrue à l'exposition de la chimiothérapie. [1 uM] , MTX [50 uM], ou d'un magnétoscope [25 uM], semblable à des témoins non traités (à noter qu'une deuxième dose d'Ara-C a ajouté à 48 h afin de tenir compte de toute perte de médicament en raison de la stabilité). Les cellules leucémiques des seuls médias, populations S et PB ont considérablement réduit la viabilité tel que déterminé par bleus exclusion.SD-1 cellules leucémiques trypan co-cultivées avec des cellules OB afficher des tendances similaires de la viabilité (B). Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± SEM. (*) Indique p <0,05, test t non apparié par rapport aux témoins non traités.5fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

maladie résiduelle minimale (MRD), qui contribue à la rechute de la maladie continue à être un défi clinique majeure dans le traitement de réfractaires agressive ALL, ainsi que, une foule d'autres hémopathies malignes. Le microenvironnement de la moelle osseuse est le site le plus fréquent de rechute chez ALL 3,8. En tant que tel, les modèles qui modélisent le microenvironnement de la moelle osseuse sont des outils indispensables pour tester des hypothèses relatives à la survie des cellules tumorales leucémiques et le maintien de MRD lors de l'exposition de la chimiothérapie. Alors que les modèles de souris définissent l'étalon-or pour les questions de tests liés à l'efficacité des médicaments, co-culture 2D continue d'être une méthode rentable pour tester des hypothèses et des stratégies de drogue liés à demain osseuse soutien microenvironnement de la survie des cellules leucémiques. De nombreux groupes ont montré que la co-culture de cellules leucémiques avec BMSC ou OB fournit un avantage de survie en cas de contestation avec des agents de chimiothérapie 9,10,12-14,19-21. la modélisation de travail CD34 immature normale + hematopoietic cellules de co-culture avec des cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont révélé que les cellules hématopoïétiques interagiront avec la monocouche adhérente de cellules souches mésenchymateuses pour former trois populations distinctes de cellules spatiales hématopoïétiques 22,23. La prolifération et la différenciation des cellules CD34 + a été effectuée par rapport à leur emplacement dans la co-culture 22. Nous avons étendu cette observation pour tester les questions liées à l'appui de la moelle osseuse de cellules micro-environnement stromal d'une population résistante de cellules tumorales dans une co-culture 2D et son isolement à l'analyse en aval.

Contrairement aux modèles 2D co-culture standard quel échantillon typiquement des cellules leucémiques par ablation de la tumeur en suspension, notre modèle montre que la co-culture représente une interaction plus dynamique dans lequel les cellules leucémiques en co-culture avec des BMSC ou sous forme de OB trois sous-populations par rapport à la BMSC ou OB monocouche (figure 1). Les sous-populations tumorales qui se forment sont suspendus (S) tumeur, WHIch flotte librement dans les médias; la phase lumineux (PB) qui est collée à la surface du BMSC ou OB; et les dim de phase (PD) qui ont enterré sous le BMSC ou OB monocouche (figure 1). Dans ce modèle, nous avons constaté que l'alimentation stricte et le calendrier de réensemencement est important d'obtenir des résultats cohérents dans un modèle de co-culture et donc nous nourrir les co-cultures à intervalles de 4 jours et transférer tumeur nouvelles monocouches BMSC ou OB tous les 12 jours. Cela peut nécessiter la modification des types de tumeurs de rechange si nécessaire. Le nombre de cellules tumorales qui vont migrer au-dessous du BMSC ou OB pour former la population PD peut varier entre différentes cellules leucémiques. Cela peut être une limitation du modèle, lorsque le nombre de cellules tumorales PD sont faibles ce qui rend difficile de recueillir suffisamment de cellules pour l'analyse en aval. Dans certains cas, ce problème peut être résolu en mettant en place reproduire les co-cultures pour permettre la mise en commun des trois sous-populations individuelles.

Comme ce modèle rerepose sur l'interaction de la cellule tumorale avec le BMSC ou OB, il est important de disposer d'une méthode efficace pour éliminer la contamination de cellules stromales de traiter la biologie spécifique des cellules leucémiques. Pour réaliser cette séparation des cellules tumorales du stroma nous utilisons colonnes du G10. configuration et la bonne utilisation de ces colonnes est crucial pour l'isolement des populations tumorales purs pour l'analyse en aval. Comme le montre la figure 2B, la bonne exécution des résultats de séparation de la colonne G10 dans la récupération des cellules tumorales à plus de 99% de pureté. Cela permet une analyse en aval des cellules leucémiques sans complication de l'interprétation des résultats qui pourraient résulter de la contamination de cellules stromales. Il est important de noter que tous les types de cellules leucémiques si les lignes cellulaires ou d'échantillons primaires de patients varient légèrement dans leur capacité à passer à travers les colonnes du G10. Avant utilisation dans des expériences à grande échelle les utilisateurs devraient déterminer le nombre de cellules leucémiques ils doivent intrants pour récupérer le montant nécessaire f souhaitéeou leurs besoins spécifiques en aval. En outre, la quantité de milieu de lavage a couru sur le G10 colonne après incubation peut être augmentée pour essayer d'augmenter le nombre de cellules récupérées. Des précautions doivent être prises pour assurer que les lavages supplémentaires ne causent pas de contamination de cellules stromales qui peut être déterminé après lavage par le nombre de cellules ou la cytométrie en flux analyse des flux à travers.

Lors de l'établissement de ce modèle, nous avons observé que les cellules leucémiques récupérés à partir de la population de PD ont augmenté la viabilité par rapport à des cellules leucémiques cultivées dans un milieu seul, ainsi que ceux récupérés à partir des populations S ou PB dans le même co-culture lorsqu'elles sont exposées à la chimiothérapie cytotoxique (Figure 3 AB). Ceci est important car il représente une population de cellules leucémiques in vitro qui dérivent protection prononcée de la chimiothérapie. Ceci permet d'obtenir un outil utile pour tester des stratégies thérapeutiques visant à cibler des tumeurs population la plus résistante, qui est supportée parle microenvironnement de la moelle osseuse. En outre, parce que ces cellules leucémiques sont si bien protégés par la BMSC ou OB co-culture, il se prête à vitro stratégies de traitement de combinaison, que dans les médias, seul ou modèles de co-culture standard semblent ou pourraient tuer complètement la tumeur qui est pas représentant toujours des effets observés chez microenvironnement soutenu populations leucémiques résistantes.

Enfin, nous pensons que l'utilisation de ce modèle peut fournir de précieuses informations sur les interactions entre BMSC / OB, et les cellules leucémiques qui sont responsables de la résistance à la chimiothérapie, conduire à MRD, puis rechute. Ce modèle fournit une plate-forme in vitro pour concevoir des expériences qui permettra de mieux informer les modèles pré-cliniques en aval. Bien que nous montrons l'utilisation de ce modèle pour tester les interactions entre les cellules stromales de la moelle osseuse et toutes les cellules leucémiques dérivées, nous espérons que les orientations et les applications futures de ce modèle sera nouseful dans une variété de tumeurs malignes dans laquelle le microenvironnement de la moelle osseuse fournit un site de réserve pour les tumeurs lors d'une intervention chimiothérapeutique.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
G10 sephadex beads Sigma G10120 Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles
10 ml sterile syringe BD 309604
Glass wool Pyrex 3950
1-way stopcocks World Precision Instruments, Inc. 14054-10
50 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021039 Used as collection tubes
15 ml conical centrifuge tubes World Wide Medical Products 41021037 Used for cell collection
Fetal Bovine Serum Sigma F6178
0.05% Trypsin  Mediatech, Inc. 25-053-CI
100 x 20 mm Cell Culture Dishes Greiner Bio-One 664160
Culture media
Osteoblast culture media  PromoCell C-27001 For human osteoblast media 
RPMI 1640 media Mediatech, Inc. 15-040 For tumor media prepation 
Cell lines
Adherent Cells:
Human Osteoblasts PromoCell C-12720 Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. 
Human Bone Morrow Stromal Cells WVU Biospecimen Core De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*)
Leukemic Cells:
REH ATCC ATCC-CRL-8286 REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
SD-1 DSMZ ACC 366 SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. 
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32.

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