अलगाव और zebrafish भ्रूण से एकल कक्ष की विशेषता

1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill
Published 3/12/2016
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Developmental Biology

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Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53877, doi:10.3791/53877 (2016).

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Abstract

Introduction

सेल और आणविक जीव विज्ञान के अध्ययन के सबसे वर्तमान जनसंख्या का औसत पर आधारित हैं। हालांकि, महत्वपूर्ण जैविक घटनाओं इन पारंपरिक जनसंख्या के आधार पर विश्लेषण द्वारा नकाबपोश जा सकता है के बाद से नाबालिग आबादी जैविक प्रक्रियाओं और रोग परिणाम में प्रमुख भूमिका निभा सकते हैं। एकल कोशिका के स्तर पर विषम आबादी में जीन की अभिव्यक्ति को समझना (और है) प्रासंगिक जैविक और नैदानिक ​​अंतर्दृष्टि 1,2 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए चिंता का विषय है, कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी में, पूर्वज कोशिकाओं अक्सर underrepresented कर रहे हैं, यह चुनौतीपूर्ण जीन अभिव्यक्ति में सूक्ष्म परिवर्तन है कि अंततः सेल भाग्य का निर्णय 3 आरंभ पता लगाने के लिए कर रही है। इसी तरह, एक एकल कोशिका प्रकार microenvironment 4 के जवाब में अलग अभिव्यक्ति प्रोफाइल हो सकता है। उदाहरण के लिए, (जैसे।, महाधमनी या गुर्दे) एक ही अंग में या विभिन्न अंगों में निवासी endothelial कोशिकाओं आम morp साझा करने के बावजूद महत्वपूर्ण विविधता का प्रदर्शनhological और कार्यात्मक सुविधाओं 5। इसके अलावा, एक ही कैंसर ट्यूमर कोशिकाओं को भी populating एकल कोशिका के स्तर 6 पर आणविक प्रोफाइल या म्यूटेशन अलग-अलग हो सकता है।

मॉडल प्रणाली में, एकल कक्षों में transcriptomics सफलतापूर्वक नए सेल आबादी की पहचान की है, मध्यवर्ती कहा गया है कि सेल भेदभाव के दौरान होने की विशेषता है, और 7,8,9 उत्तेजनाओं को अंतर सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पता चला। इस तरह की अंतर्दृष्टि पारंपरिक जनसंख्या आधारित अध्ययन में नकाबपोश गया होता। Zebrafish भ्रूण स्टेम, पूर्वज का एक काफी कम उपयोग स्रोत हैं, और विकास के दौरान एकल कक्ष विविधता और सेलुलर पहचान की आणविक विनियमन के सवालों की खोज के लिए कोशिकाओं का फर्क। उनके अत्यधिक टकसाली, पूर्व vivo विकास और आनुवंशिक हेरफेर की आसानी उन्हें इस दृष्टिकोण 10,11 के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली बनाते हैं। विशेष रूप से, एकल कोशिका जनरल की व्याख्या करने के लिए एक प्रमुख सीमाई अभिव्यक्ति डेटा है कि विकास के दौरान उपन्यास मध्यवर्ती सेल राज्यों के विश्वसनीय पहचान ऊतक संग्रह 9 की बहुत सावधान समय की आवश्यकता है। यह सुनिश्चित करना है कि कब्जा कर लिया कोशिकाओं के बीच विविधता उम्र पर निर्भर सेल भेदभाव द्वारा प्रस्तुत जीन अभिव्यक्ति में एक भी समय बिंदु पर बजाय विविधता एक ऊतक के भीतर विविधता का प्रतिनिधित्व आवश्यक है। चूहों की तुलना में, zebrafish भ्रूण विकास के ठीक 12 भ्रूण की एक बड़ी संख्या में सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, बड़े क्लच आकार के साथ, zebrafish भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज का एक प्रचुर स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण से कोशिकाओं को अलग और QRT- पीसीआर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एकीकृत microfluidics सर्किट (आईएफसी) चिप और autoprep प्रणाली का उपयोग करते हुए एकल कक्षों पर कब्जा करने के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल तेजी से पूरे सहित किसी भी उच्च throughput बहुसंकेतन assays के लिए संक्रमणीय हो सकता हैtranscriptome अनुक्रमण कि सेलुलर विविधता 13 के अधिक व्यापक विश्लेषण की अनुमति देता है। यह भी पारंपरिक जीन अभिव्यक्ति assays के लिए कई लाभ प्रदान करता है। एकल कक्ष अलगाव प्रोटोकॉल FACS के बाद उच्च व्यवहार्यता, जो समझौता कोशिकाओं है कि बहाव के अनुप्रयोगों में शामिल हैं के अनुपात में कम हो जाती है अर्जित करता है। एक आईएफसी का उपयोग करके, पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं को सीधे कब्जा दरों का मूल्यांकन करने और आकृति विज्ञान सेल स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए मनाया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल केवल एक लेबल ट्रांसजेनिक मछली लाइन और microfluidic सेल प्रौद्योगिकियों पर कब्जा करने के लिए उपयोग की आवश्यकता होती है, मोटे तौर पर zebrafish अनुसंधान समुदाय के लिए लागू है।

सिद्धांत के सबूत के रूप में, हृदय progenitors से निकाली गई एकल कक्षों अलग थे और एक आईएफसी चिप पर कब्जा कर लिया है, और फिर हृदय भेदभाव मार्करों के रिश्तेदार बहुतायत QRT- पीसीआर द्वारा मापा गया था। एकल कोशिका के स्तर पर जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण दर्शाता है कि हृदय progenitors उनकी विभिन्न साथ साथ रहntiating संतान। अंतर्दृष्टि हृदय progenitors के एकल कोशिका की रूपरेखा से प्राप्त कशेरुकी विकास के दौरान हृदय पूर्वज कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में विविधता है, जो पारंपरिक जनसंख्या के आधार पर विश्लेषण में नकाबपोश गया हो सकता है पर प्रकाश डाला सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को लाइव, वयस्क zebrafish का उपयोग भ्रूण का उत्पादन करने की आवश्यकता है। भ्रूण ऊतक संग्रह के लिए काटा जाता है। यह इस प्रयोग का संचालन करने के लिए उचित नैतिकता समीक्षा बोर्ड से अनुमोदन प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

1. मंचन भ्रूण प्राप्त

  1. दिन के प्रयोग से पहले, प्रजनन के लिए स्वस्थ, वयस्क zebrafish तैयार करते हैं। एक पुरुष और एक प्रजनन टैंक में एक स्पष्ट विभक्त के विपरीत दिशा में एक महिला रखें।
  2. बहाव के आवेदन के लिए पर्याप्त भ्रूण उत्पादन के लिए आवश्यक के रूप में के रूप में कई प्रजनन टैंक के लिए 1.1 दोहराएँ। दोनों जंगली प्रकार मछली और मछली ट्रांसजेनिक से भ्रूण है कि ब्याज की कोशिका प्रकार में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त प्राप्त करते हैं।
    नोट: कदम 2-8 में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक भ्रूण की संख्या हित के समय बिंदु पर ब्याज की कोशिकाओं के रिश्तेदार बहुतायत पर निर्भर करता है। हालांकि इस प्रकार की कोशिका से भिन्न हो सकते हैं, 200 भ्रूण 2,000-5,000 हल कोशिकाओं का उत्पादन जब गब्याज की एल 24 HPF (घंटे बाद निषेचन) में कुल कोशिकाओं के 1.0% का प्रतिनिधित्व करते <।
  3. अगली सुबह, एक ताजा प्रजनन टैंक के लिए मछली के हस्तांतरण से breading टैंक में पानी बदलने के लिए और विभक्त हटा दें। एक कोण पर टैंक झुकाव प्रजनन प्रोत्साहित करने के लिए।
  4. मंचन भ्रूण लीजिए।
    1. हर 15 मिनट, एक ताजा प्रजनन टैंक के लिए वयस्कों के हस्तांतरण और अंडे जो एक चाय का झरनी के माध्यम से पीछे छोड़ दिया जाता गुजर द्वारा भ्रूण इकट्ठा।
      नोट: जब तुलनीय घनत्व और तापमान पर बनाए रखा zebrafish भ्रूण तुल्यकालिक का विकास।
    2. (1 एल दोहरा आसुत जल में 0.21 छ / एल त्वरित महासागर लवण) अंडे पानी के साथ अंडे कुल्ला और एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण। हवा परिसंचरण के साथ 28.5 डिग्री सेल्सियस पर एक नम इनक्यूबेटर पेट्री डिश स्थानांतरण।
  5. दो घंटे पिछले संग्रह के बाद, प्रकार 10 सेमी पेट्री डिश में निषेचित, बहुकोशिकीय भ्रूण और पकवान प्रति 50 भ्रूण को घनत्व को कम। एक एकल, 15 से भ्रूण का चयनबहाव के आवेदन के लिए संग्रह के मिनट का समय खिड़की। 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते हैं।
    नोट: उदाहरण के लिए, पर 8:30, 08:45, 9:00, 09:15, 9:30, 09:45, 10:00 और 10:15 भ्रूण इकट्ठा। समय अंक के पार तुलना, यदि निषेचित भ्रूण की संख्या सबसे अधिक 9:00 पर एकत्र चंगुल से कर रहे हैं, तो केवल बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इन भ्रूणों का उपयोग करें।

2. एकल सेल हदबंदी के लिए स्थापित

  1. ब्याज (18 HPF) के समय बिंदु से पहले लगभग 30 मिनट ठीक संदंश के साथ स्वयं अपने जरायु से भ्रूण को हटा दें।
  2. लीजिए और हर हालत के लिए निम्नलिखित लेबल: दो 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, एक 40 माइक्रोन सेल झरनी, एक 35 मिमी सेल संस्कृति पकवान, और दो FACS ट्यूबों एक 35 माइक्रोन सेल झरनी के साथ अव्वल रहा।
  3. चिल बर्फ पर निम्नलिखित अभिकर्मकों: अंडे पानी 1L में 0.21g / एल त्वरित महासागर लवण युक्त दोहरा आसुत जल; डी-yolking बफर युक्त 55 मिमी NaCl, 1.8 मिमी KCl, और 1.25 मिमी 3 NaHCO; और FACS बफर लेबोविट्ज़ एल 15 मीडिया 5% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक हैं।
  4. आरटी सेल हदबंदी अभिकर्मक 1 का नमूना प्रति 1 मिलीलीटर लाओ। पिघलना 1 मिलीलीटर सेल हदबंदी अभिकर्मक 2 नमूना प्रति बर्फ पर। उपयोग करने से पहले तुरंत आरटी के लिए ले आओ।

3. एकल सेल हदबंदी

  1. एक विस्तृत बोर गिलास पिपेट का उपयोग करना, अंडे पानी की एक न्यूनतम मात्रा में 2 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब 100-300 भ्रूण हस्तांतरण।
  2. 20 मिनट के लिए बर्फ में 1 मिलीलीटर ठंडा अंडे पानी के साथ पानी की जगह और ट्यूब जलमग्न द्वारा भ्रूण euthanize।
    चेतावनी! यह इस इच्छामृत्यु विधि (माध्यमिक इच्छामृत्यु के रूप में सेल हदबंदी के द्वारा पीछा बर्फ पर द्रुतशीतन) के लिए उचित संस्थागत पशु की देखभाल निगरानी समिति से अनुमोदन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। स्टैंडर्ड इच्छामृत्यु की आवश्यकता है कि आम तौर पर भ्रूण 3 दिन <बाद निषेचन प्रक्षालित कर रहे हैं के बाद वे जो व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं है ठंडा कर रहे हैं।
  3. भ्रूण 1 मिलीलीटर ठंडा अंडे पानी के साथ दो बार धोएं। धोने के लिए, अंडे पानी और अंडे पानी जोड़ने के लिए एक P1000 दूर करने के लिए एक विस्तृत बोर गिलास पिपेट का उपयोग करें।
  4. एक P1000 टिप के साथ 1 मिलीलीटर Deyolking बफर के साथ भ्रूण पानी की जगह और 8-12 बार triturating द्वारा जर्दी निकालें, या जब तक की जर्दी को भंग कर दिया है और केवल भ्रूण के शव दिखाई दे रहे हैं।
  5. 1 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा ऊतक लीजिए। एक पिपेट का उपयोग धीरे ऊतक गोली बाधा पहुँचा के बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 1 मिलीलीटर अंडे पानी में फिर से निलंबित।
  6. तीन washes के एक कुल के लिए दोहराएँ कदम 3.5, लेकिन अंतिम धोने पर, 1 मिलीलीटर आर टी सेल हदबंदी अभिकर्मक 1 में फिर से निलंबित।
  7. क्षैतिज रखा ट्यूबों के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए सेल हदबंदी अभिकर्मक 1 में सेते हैं। हर 2-3 मिनट, धीरे से एक P1000 पिपेट clumping को रोकने के साथ triturate।
    ध्यान दें: विचूर्णन चरणों के दौरान धीरे नमूने संभाल लेना। कुछ समय के लिए एक एकल, बड़े पेड़ों का झुरमुट भ्रूण निकायों के एक उलझन से ट्यूब में बनेगी। यह करेगाकोमल विचूर्णन द्वारा सहायता प्राप्त अतिरिक्त पाचन के साथ फैलाने के। भंवर नहीं है।
  8. 3 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा ऊतक लीजिए। 1 मिलीलीटर सेल हदबंदी अभिकर्मक 2 में सतह पर तैरनेवाला और resuspend निकालें।
  9. आरटी पर 5-15 मिनट के लिए सेते हैं। नलियों क्षैतिज रखें। हर 2-3 मिनट, धीरे clumping को रोकने के लिए triturate। हर 5 मिनट, पाचन प्रगति का आकलन करें।
    1. पाचन प्रगति का आकलन करने के लिए, एक सेल संस्कृति पकवान पर एक छोटी बूंद के रूप में 18 μl FACS बफर और पिपेट में 2 μl सतह पर तैरनेवाला पतला।
    2. नमूना भर में एक coverslip जगह और 10X और 20X आवर्धन पर एक टिशू कल्चर माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करते हैं।
      ध्यान दें: तैयारी एकल कक्षों, छोटे समूहों, बड़े समूहों, और कभी कभी ज्यादातर बरकरार भ्रूण के शरीर का एक मिश्रण के रूप में प्रकट करना चाहिए।
    3. नेत्रहीन तैयारी एकल कक्षों और छोटे समूहों है कि का अनुपात का आकलन करें।
      ध्यान दें: अधिक पाचन व्यवहार्यता कम हो जाएगा; अंडर पाचन एकल कक्ष उपज कम हो जाएगा। </ Li>
  10. 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा सेल तैयार लीजिए। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित ठंड FACS बफर।
  11. FACS बफर के साथ एक 40 माइक्रोन सेल झरनी गीला। एक 35 मिमी सेल संस्कृति पकवान पर 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन गुजरती हैं। 1 मिलीलीटर बफर छँटाई FACS के साथ सेल झरनी एक बार धो लें।
  12. एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब प्रवाह के माध्यम से स्थानांतरण। 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा और 100 μl FACS बफर में फिर से निलंबित।
  13. सेल उपज एक hemocytometer का उपयोग गिनती। इसके अलावा मिलीलीटर, या इष्टतम एकाग्रता प्रति 5x10 6 कोशिकाओं पसंद के FACS मशीन के लिए सिफारिश करने के लिए नमूने पतला। वैकल्पिक-जब hemocytometer पर सेल उपज गिनती, trypan नीले रंग के साथ counterstain मृत कोशिकाओं सेल तैयार FACS छँटाई करने के लिए पूर्व व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए।
    नोट: तैयारी है कि बहुत पतला कर रहे हैं सुलझाने के लिए समय की अतिरिक्त राशि ले जाएगा। तैयारी है कि बहुत सी हैंoncentrated multimers में पेड़ों का झुरमुट के लिए करते हैं और एक शुद्ध आबादी छँटाई के लिए सबऑप्टिमल हैं।
  14. रिजर्व प्रत्येक नमूने की 10-20% के रूप में बेदाग नियंत्रण का उपयोग करने के लिए। शेष नमूने, जोड़कर दाग मृत कोशिकाओं के लिए एक फ्लोरोसेंट लाइव / मृत (एल / डी) भेदभाव प्रत्येक नमूना में डाई। धो नहीं।
    नोट: किसी भी फ्लोरोसेंट रंजक है कि समझौता कोशिका झिल्ली और दाग न्यूक्लिक एसिड एल / डी डाई के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ कोशिकाओं प्रवेश, बशर्ते कि प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा हित के चुनाव और fluorophore लेबलिंग कोशिकाओं के FACS मशीन के साथ संगत है।
    1. डाई जोड़ने कुछ कोशिकाओं FACS शुद्धि के लिए पारगमन में मर जाएगा और हल आबादी से बाहर रखा जाना चाहिए के रूप में के बाद तैयारी धो मत करो।
  15. 35 माइक्रोन सेल झरनी के 20 μl FACS बफर के साथ छाया हुआ FACS ट्यूब गीला। झरनी के लिए कोशिकाओं जोड़ें और गंभीरता से लेने के लिए। बर्फ पर दुकान।

4. FACS संवर्धन

  1. एकल के लिए संतुष्ट करने के लिए FACS का प्रयोग करें, जी फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त कोशिकाओं।
    1. आगे तितर बितर (एफएससी-ए) आयाम बनाम ओर तितर बितर आयाम (एसएससी-ए) के एक तितर बितर साजिश पर मलबे से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक गेट सेट, दोनों रैखिक स्केलिंग के साथ।
      सावधानी! Zebrafish कोशिकाओं को आमतौर पर माउस या मानव कोशिकाओं की तुलना में छोटे होते हैं। यह कोशिकाओं और मलबे के बीच एक कम बेसल जुदाई में दिखाई देता है।
    2. गेट 4.1.1 में सेट से, एकल कक्षों के लिए समृद्ध और आगे तितर बितर ऊंचाई (एफएससी-एच) और कम पक्ष तितर बितर ऊंचाई (एसएससी-एच) की एक तितर बितर साजिश का उपयोग कर multimers, रैखिक स्केलिंग के साथ दोनों को बाहर करने का एक गेट निर्धारित किया है।
      नोट: अधिकतर उच्च एफएससी-एच और कम एसएससी-एच के साथ कोशिकाओं की संभावना multimers हैं और छँटाई से बाहर रखा गया है।
    3. 4.1.2 में गेट सेट, एकल रंग नियंत्रण का उपयोग कर से, केवल लाइव रेखीय स्केलिंग और चैनल के आयाम के साथ एफएसए-ए का एक तितर बितर साजिश का उपयोग कोशिकाओं को शामिल करने के लिए एक गेट सेट लॉग स्केलिंग के साथ एल / डी दाग ​​पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया। एल / डी नकारात्मक कोशिकाओं को शामिल करें।
    4. सेगेट 4.1.3 में सेट, एकल रंग नियंत्रण का उपयोग कर, रैखिक स्केलिंग और लॉग स्केलिंग के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेल मार्कर का पता लगाने के लिए किया जाता चैनल के आयाम के साथ एफएसए-ए का एक तितर बितर साजिश का उपयोग कर एक गेट सकारात्मक प्रतिदीप्ति के साथ ही जीवित कोशिकाओं में शामिल करने के लिए सेट । सकारात्मक कोशिकाओं को शामिल करें।
    5. एल / डी दाग ​​और फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्पेक्ट्रा के बीच हस्तक्षेप के लिए खाते में, किसी भी मुआवजा नियंत्रण सेट यदि आवश्यक है।
  2. कोशिकाओं है कि फाटक 4.1 चरण में सेट के सभी में गिर करने के लिए सेट क्रमबद्ध तर्क।
    1. डबल लेबल की कोशिकाओं का प्रयोग, सेल छँटाई के लिए gating सत्यापित करें।
      नोट: छँटाई मलबे एकल कक्षों के बजाय multimers बजाय कोशिकाओं, एल / डी नकारात्मक और सकारात्मक प्रतिदीप्ति कोशिकाओं हो जाएगा के लिए कोशिकाओं।
  3. क्रमबद्ध 2,000-4,000 बर्फ पर एक microcentrifuge ट्यूब में ठंड FACS बफर के 5 μl में ब्याज की आबादी से कोशिकाओं। छंटाई के दौरान कोशिकाओं पर बाल काटना और तनाव कम करने के लिए, सेल के लिए संभव सबसे दबावों का उपयोग संभवसॉर्टर।
    नोट: FACS बफर के 5 μl छोटी बूंद FACS मशीन बाहर निकलने की कोशिकाओं के लिए एक तकिया के रूप में कार्य करता है। सीधे FACS बफर में 2,000-4,000 कोशिकाओं को इकट्ठा आईएफसी चिप्स पर लोड करने से पहले centrifugation के लिए की आवश्यकता समाप्त। यदि कोशिकाओं को गोली में एक दूसरे का पालन क्योंकि centrifugation multimers के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं इस रणनीति की सिफारिश की है।
  4. पोस्ट-तरह की व्यवहार्यता विश्लेषण का आकलन करें।
    1. एल / डी दाग ​​के 1,000 कमजोर पड़ने: स्थानांतरण 1 μl 100 μl FACS बफर और 1 छँटाई के साथ एक ताजा FACS ट्यूब कोशिकाओं को हल। 4.1 चरण में gating रणनीति के साथ FACS सॉर्टर के माध्यम से कोशिकाओं गुजरती हैं। / डी सकारात्मक को नकारात्मक हल कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एल के अनुपात में प्रयोग करें।

5. Microfluidics चिप पर लोड प्रकोष्ठों

  1. एक hemocytometer का उपयोग, दोनों एकाग्रता और हल कोशिकाओं के आकार को मापने।
    1. कम से कम 10 μl को हल कोशिकाओं पतला। 5 μ के एक विभाज्य पतला5 μl trypan नीले रंग के साथ एल कोशिकाओं। hemocytometer पर लोड और coverslip लागू होते हैं।
    2. hemocytometer के 4 x 4 ग्रिड में सभी कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को ले लीजिए। जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना और जीवित कोशिकाओं / एमएल की गणना। जीवित कोशिकाओं trypan नीले रंग नहीं लेते।
      नोट: सभी जीवित कोशिकाओं के व्यास को मापने के लिए किसी भी मानक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। सेल आकार के औसत और मानक विचलन की गणना, और ब्याज की सेल आकार श्रृंखला के लिए उपयुक्त एक आईएफसी प्लेट का चयन करें। सेल आकार सीमा एक आईएफसी प्लेट सेल आकार सीमा straddles, तो ब्याज की कोशिकाओं की पूरी श्रृंखला पर कब्जा करने के लिए कई प्लेटों का उपयोग करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आईएफसी थाली करने पर लोड कोशिकाओं (सामग्री देखें)।
    1. 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं पतला और निर्माता के निर्देशों के अनुसार उछाल अनुकूलन प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: उछाल अनुकूलन सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं को न तो नीचे सिंक और न ही लोड हो रहा है wel के ऊपर फ्लोटआईएफसी चिप पर इष्टतम लोड करने के लिए एल। कोशिकाओं के लिए बफर के अनुपात सेल प्रकार से भिन्न हो सकते हैं, लेकिन आम तौर पर पर्वतमाला 6: 4-7: कोशिकाओं के 3: बफर।
    2. primed-आईएफसी थाली करने के लिए कोशिकाओं जोड़ें। संगत fluidics मशीन में लोड थाली, और microfluidics सर्किट के माध्यम से और कब्जा गलियों में कोशिकाओं पुश करने के लिए एक सेल लोड हो रहा है स्क्रिप्ट चलाएँ।
  3. पुष्टि करें कि कोशिकाओं आईएफसी प्लेट पर कब्जा साइटों में बंद हैं।
    1. fluidics मशीन से आईएफसी थाली निकालें। एक थाली एडाप्टर से लैस एक माइक्रोस्कोप पर आईएफसी प्लेट माउंट।
    2. 10X बढ़ाई पर कब्जा प्रत्येक साइट के लिए उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति की फोटो ले लीजिए।
      नोट: Brightfield कब्जा बार दीपक तीव्रता पर निर्भर करता है, 10-50 एमएस से लेकर कर सकते। प्रतिदीप्ति कब्जा बार fluorophore चमक के आधार पर, 250-750 एमएस से लेकर कर सकते। कोशिकाओं overexposing photodamage को रोकने के लिए करने से बचें।

6. सीडीएनए संश्लेषण

  1. मैं के अनुसार सीटू सेल प्रदर्शन करनाएफसी प्लेट निर्माता के निर्देशों।
    1. आईएफसी प्लेट पर कुओं के लिए सेल बफ़र्स जोड़ें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार संगत fluidics मशीन और रन सेल स्क्रिप्ट पर लोड थाली।
  2. आईएफसी प्लेट निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करना।
    1. आईएफसी थाली करने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन अभिकर्मकों जोड़ें। संगत fluidics मशीन पर लोड थाली। रिवर्स प्रतिलेखन स्क्रिप्ट चलाएँ। नमूना साइकिल चालन की स्थिति: 1 से 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर चक्र, 1 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर 1 चक्र, तो 1 चक्र।
  3. आईएफसी प्लेट निर्माता के निर्देशों के अनुसार जीन विशिष्ट जांच के साथ पूर्व प्रवर्धन प्रदर्शन करना।
    नोट: कम प्रतिलिपि संख्या के साथ उनके अधिक से अधिक विशिष्टता के कारण, जांच के बजाय fluorogenic लेबल जांच intercalator रंगों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित का उपयोग करें।
    1. पूल प्राइमरों और अंतिम 180 एनएम से प्रत्येक के लिए पतला। आईएफसी थाली करने के लिए जमा प्राइमरों जोड़ें। संगत fluidi पर लोड प्लेटसीएस की मशीन। भागो preamplification स्क्रिप्ट।
  4. 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के लिए 4 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर annealing और विस्तार तो denaturing के साथ 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 चक्र, तो 18 चक्र: पूर्व प्रवर्धन चक्र निम्नलिखित शर्तों के साथ प्रदर्शन करते हैं। स्टोर कटाई तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए। निर्माता के निर्देशों और उपयोग करें जब तक -20 पर दुकान के अनुसार microfluidic थाली से हार्वेस्ट सीडीएनए।

7. ही लक्ष्य qRT पीसीआर के लिए एकल कक्षों से सीडीएनए का चयन

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 25 μl कमजोर पड़ने अभिकर्मक में सीडीएनए पतला।
    नोट: लगभग अंतिम उपज सेल प्रति पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए के 28 μl है। QRT- पीसीआर में एक नहीं, टेम्पलेट नियंत्रण के रूप में उपयोग के लिए मंदक के एक विभाज्य सुरक्षित रखते हैं।
    1. उज्ज्वल क्षेत्र और कदम 5.3.2 में दर्ज फ्लोरोसेंट छवियों का जिक्र करते हुए प्रत्येक पर कब्जा साइट से स्कोर। मैन्युअल गिनती और कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड है। आकलन और रिकॉर्ड है कि क्या प्रत्येक कोशिका फ्लू हैorescent।
      नोट: प्रत्येक व्यक्ति साइट हो सकती है 0, 1, या> 1 सेल, जहां> 1 सेल पर कब्जा साइटों है कि कई कोशिकाओं और / या unidentifiable मलबे शामिल भी शामिल है। छवियों पर्याप्त गुणवत्ता वाले होते हैं, तो एक पिक्सेल मूल्य भी प्रतिदीप्ति संकेत की तीव्रता यों को सौंपा जा सकता है।
  2. QRT- पीसीआर विश्लेषण के लिए नमूने का चयन करें।
    1. कदम 7.2 में पहचान कब्जा साइटों है कि सकारात्मक प्रतिदीप्ति के साथ सटीक 1 सेल होते से सीडीएनए नमूने का चयन करें। प्रत्येक नमूने से सीडीएनए के पूल 1 μl aliquots।
      नोट: यह "पूल" सकारात्मक निर्धारित करने के लिए कि क्या ब्याज की जीन चयनित कक्षों में से किसी में व्यक्त कर रहे हैं इस्तेमाल किया नियंत्रण है।
    2. कम से कम एक पर कब्जा साइट पर एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बिल्कुल 0 कोशिकाओं जिसमें से सीडीएनए का चयन करें। एक नहीं, टेम्पलेट नियंत्रण के रूप में कदम 7.1.2 से मंदक का प्रयोग करें।
  3. भागो QRT- पीसीआर परख।
    1. केवल कदम 6.4.1 में पूर्व प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जांच का प्रयोग करें। triplicat में सभी नमूनों लोडई। 1 चक्र 50 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट, 1 चक्र 10 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड में तो 1 के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर annealing और विस्तार denaturing के साथ 40 चक्र के लिए 95 डिग्री सेल्सियस: एक 384 अच्छी तरह से थाली पर एक 10 μl प्रतिक्रिया के लिए साइकिल चालन की स्थिति मि।

8. डेटा विश्लेषण

  1. मान्य मानक जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा QRT- पीसीआर उत्पादों। उत्पाद की पुष्टि की उम्मीद आणविक वजन में एक ही बैंड है (हर जांच के लिए भिन्न होता है)।
    नोट: इस मामले की जांच एक अनुचित आकार में कई बैंड या एक ही बैंड पैदा करता है, तो विशिष्टता संदिग्ध है, और इस विश्लेषण से जीन शामिल नहीं है।
  2. सभी प्रवर्धन घटता है और किसी भी असामान्यताएं 14 के लिए खाते की जांच करते हैं। प्रत्येक नमूना / जीन संयोजन 15 के लिए औसत सीटी मूल्य की गणना।
    नोट: सकारात्मक नियंत्रण के लिए सीटी मूल्यों आम तौर पर 10-30 लेकर। नकारात्मक नियंत्रण के लिए सीटी मूल्यों आम तौर पर 35-40 (कोई प्रवर्धन) को लेकर। सीटी मूल्यों 30-35 बहुत कम अभिव्यक्ति माना जाता हैऔर सावधानी के साथ 14 व्याख्या की जानी चाहिए।
  3. रिपोर्ट डेटा
    1. नमूने सीटी = 10-30 में गिर जाते हैं, आंकड़े यह भी एक नियंत्रण नमूना करने के लिए प्रतिलेख बहुतायत रिश्तेदार गुना परिवर्तन के रूप में सूचना दी जा सकती है।
      नोट: (- ΔΔCT) परिवर्तन गुना 2 ^ के बराबर होती है जहां ΔCT गृह व्यवस्था जीन से नमूना की औसत सीटी घटा कर एक गृह व्यवस्था जीन के सापेक्ष है और ΔΔCT नमूना और एक सकारात्मक नियंत्रण 15 के बीच ΔCT में मतभेद है।

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Representative Results

सिद्धांत के सबूत के रूप में, जीन अभिव्यक्ति हृदय विकास के दौरान भेदभाव गतिशीलता का पता लगाने के लिए मूल्यांकन किया गया था। Zebrafish में, हृदय कोशिकाओं है कि पूर्वज पूर्वकाल पार्श्व प्लेट mesoderm जहां वे रैखिक दिल ट्यूब के लिए फार्म का फ्यूज की ओर पलायन की एक mesodermal आबादी से उत्पन्न होती हैं। फ्यूजन करने से पहले, हृदय progenitors प्रतिलेखन कारक nkx2.5 (NK2 homeobox 5) है, जो हृदय progenitors 16,17 की जल्द से जल्द विशिष्ट मार्कर माना जाता है व्यक्त करने के लिए शुरू करते हैं। इधर, एक पहले से वर्णित बीएसी ट्रांसजेनिक मछली टीजी (nkx2.5: ZsYellow) 18, संक्षिप्त nkx2.5: ZsY 18 विखंड चरण, 18 घंटा बाद निषेचन (HPF) 12 में एकल कक्षों में हृदय भेदभाव मार्करों जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह जल्द से जल्द समय बिंदु है जिस पर ZsYellow संकेत नेत्रहीन detectable था। पहले इस ट्रांसजेनिक लाइन के लिए वर्णित है, ZsYellow हृदय progenitors लेबल, के रूप में हमकुछ अतिरिक्त हृदय कोशिकाओं है कि 28 HPF 19 पर ग्रसनी मेहराब endothelial कोशिकाओं को जन्म देने के रूप में करूँगा (चित्रा 1 ए-बी, डेटा नहीं दिखाया गया है)। 18 HPF पर, nkx2.5: ZsY भ्रूण एक एकल कक्ष निलंबन तो मृत कोशिकाओं को बाहर Sytox ब्लू के साथ दाग में अलग किया गया। लाइव, ZsYellow सकारात्मक, नकारात्मक Sytox ब्लू कोशिकाओं थे FACS 100 माइक्रोन नोक (चित्रा 1 सी एफ) के साथ सुसज्जित या तो एक MoFloXDP या सोनी SH800Z सॉर्टर का उपयोग कर हल। हल किया जनसंख्या और पोस्ट-तरह की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए पवित्रता, हल कोशिकाओं के एक विभाज्य Sytox ब्लू के साथ दाग और कहा कि मूल छँटाई गेट (चित्रा 1G-जे) के भीतर गिर गए घटनाओं का प्रतिशत मूल्यांकन किया गया।

छंटाई के बाद, कोशिकाओं के लिए एक एकीकृत microfluidic सर्किट (आईएफसी) चिप काम प्रवाह (2A चित्रा) में प्रवेश कर रहे थे निर्माता के निर्देशों के अनुसार। एक hemocytometer, trypan नीले रंग के साथ संयुक्त exclusion सेल व्यास, एकाग्रता, और व्यवहार्यता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 2 बी, और नहीं दिखाया डेटा)। सेल उछाल अनुकूलित किया गया था (6.5: 3.5 कोशिकाओं: बफर) निर्माता अनुदेश के अनुसार, और कोशिकाओं 5-10 माइक्रोन व्यास कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए एक आईएफसी पर लोड कर रहे थे। कब्जा दक्षता, प्रतिदीप्ति और / या उज्ज्वल क्षेत्र संकेतों सभी पर कब्जा स्थलों पर imaged थे आकलन करने के लिए, फिजी में एक खपरैल का छत समारोह microfluidics प्लेट की एक भी तस्वीर सिलाई के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रत्येक कब्जा साइट 0, 1, या> 1 व्यक्ति की कोशिकाओं (चित्रा -2 सी एफ) निहित। FACS संवर्धन से उम्मीद थी, पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं ZsYellow (चित्रा 2 जी) व्यक्त किया। कब्जा दक्षता 5 व्यक्ति nkx2.5 का उपयोग करते हुए प्रयोगों में 90% से अधिक: ZsY हल कोशिकाओं, और कब्जा साइटों के कम से कम 70% एक एकल कोशिका द्वारा कब्जा कर रहे थे (डेटा) नहीं दिखाया। कोशिकाओं lysed रहे थे, शाही सेना से अलग-थलग, सीडीएनए संश्लेषित और विशिष्ट लक्ष्य जीन प्रवर्धित थे, सभी निर्माता के निर्देशों के अनुसार।

सेल पर कब्जा साइटों की एक सबसेट ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप QRT- पीसीआर विश्लेषण के लिए चयन किया गया था। विशेष रूप से, बढ़ाव कारक 1 ए (efl1a) 20 और glyceraldehyde -3 फॉस्फेट (GAPDH) 21 हाउसकीपिंग उम्मीद हर कोशिका में व्यक्त किया जा करने के लिए जीन के रूप में यत्न कर रहे थे; GATA बाध्यकारी प्रोटीन 4 (gata4) 22 और NK2 homeobox 5 (nkx2.5) के रूप में जल्दी हृदय पूर्वज मार्कर; आइएसएल लिम homeobox 1 बॉक्स 1 (isl1) एक दूसरे दिल क्षेत्र मार्कर 23,24 के रूप में; और मायोसिन प्रकाश श्रृंखला (myl7) और वेंट्रिकुलर मायोसिन भारी श्रृंखला (vmhc) 25 वेंट्रिकुलर cardiomyocytes चिह्नित करने के लिए। जीन विशिष्ट जांच 48 HPF भ्रूण (चित्रा 3) से सीडीएनए का उपयोग कर मान्य किया गया। QRT- पीसीआर एक जमा आबादी सकारात्मक नियंत्रण containi 18 HPF भ्रूण, एक नहीं, टेम्पलेट नकारात्मक नियंत्रण से 45 एकल कक्षों में इन जीनों के रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, औरएनजी सीडीएनए सभी 96 कब्जा साइटों से। 40 प्रतिनिधि कोशिकाओं और नियंत्रण के लिए कच्चे सीटी मूल्यों तालिका 1. विशेष रूप में दिखाया जाता है, की जांच 46 कोशिकाओं के पूल से, 6 कोशिकाओं के विश्लेषण से बाहर रखा गया है क्योंकि सभी जीन अभिव्यक्ति सीटी मूल्यों सीटी = 35.0 के पार हो गई है, और यह अज्ञात है कि क्या इन उच्च सीटी मानों यह सच है कि बहुत कम अभिव्यक्ति के स्तर या नमूना गिरावट के कारण कर रहे हैं। गृह व्यवस्था जीन, ef1a के लिए सीटी मूल्यों की सीमा के बाद से, भी नमूने के बीच जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए व्यापक था, और कई सीटी मूल्यों को पार कर 30, सीटी मूल्यों को एक गर्मी के नक्शे (चित्रा 3) के रूप में कल्पना थे। नमूने भर में तुलना, जीन अभिव्यक्ति में पर्याप्त विविधता मनाया गया, और कोशिकाओं प्रकार 1-5 अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर (चित्रा 3) के रूप में कोशिकाओं में वर्गीकृत किया गया।

आकृति 1
चित्रा zebrafish की 1. एकल कोशिका अलगाव 18 HPF पर ZsY सकारात्मक कोशिकाओं प्रतिनिधि टीजी (nkx2.5: ZsYellow) के पूरे माउंट छवियों। (ए) ZsYellow अकेले या प्रतिदीप्ति (बी) के साथ 18 HPF पर भ्रूण उज्ज्वल क्षेत्र छवि के साथ विलय कर दिया। (सीएफ) प्रतिनिधि FACS gating रणनीति ZsYellow सकारात्मक कोशिकाओं और समृद्ध करने के लिए (जी जे) (सी, जी) एफएससी / एसएससी आकार gating, (डी, एच) नक़ल भेदभाव, (ई, मैं) लाइव / मृत gating के साथ पोस्ट-प्रकार का विश्लेषण और (एफ, जे) के अनुसार क्रमबद्ध आबादी। स्केल बार 100 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. zebrafish nkx2.5 के एकल कक्ष पर कब्जा: ZsY ओंग> सकारात्मक कोशिकाओं। (क) काम प्रवाह। 18 HPF पर पृथक भ्रूण: (बी) सेल आकार टीजी (ZsYellow nkx2.5) से हल कोशिकाओं के लिए वितरण। (सीएफ) आईएफसी प्लेट पर कब्जा प्रतिनिधि सेल घटनाओं जहां (सी) एक खाली अच्छी तरह से है, (डी) के दो कोशिकाओं, (ई) एक एकल कोशिका एक "चैनल पर कब्जा", और (एफ) के रूप में fluidics चैनल में दर्ज कराई है शामिल एक भी कब्जा कर लिया सेल। बैंगनी बक्से पर कब्जा साइटों का बढ़ाया देखने के लिए इनसेट चिह्न। (G) brightfield, ZsYellow के साथ एकल कोशिका को पकड़ने और छवियों विलय कर दिया। (सीएफ) सफेद पैमाने बार 50 माइक्रोन है; पीले पैमाने बार 10 माइक्रोन है। (G) स्केल बार 10 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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कब्जा एकल zebrafish nkx2.5 की चित्रा 3. जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण:। ZsY सकारात्मक कोशिकाओं सकारात्मक नियंत्रण में QRT- पीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति (2 दिनों-बाद निषेचन में भ्रूण, एकल कक्षों से सीडीएनए जमा), नकारात्मक नियंत्रण (कोई टेम्पलेट ) और 40 एकल कोशिकाओं (सेल 01-40)। कच्चे सीटी मूल्यों रंग कोडित आधारित कुंजी के रूप में वर्णित किया गया। Ef1a = बढ़ाव कारक 1 ए, gata4 = GATA बाध्यकारी प्रोटीन 4, nkx2.5 = NK2 homeobox 5, myl7 = मायोसिन प्रकाश श्रृंखला 7, vmhc = वेंट्रिकुलर मायोसिन भारी श्रृंखला, GAPDH = glyceraldehyde -3 फॉस्फेट, और isl1 = आइएसएल लिम homeobox 1। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

साइकिल थ्रेसहोल्ड (सीटी)
ef1a gata4 nkx25 myl7 vmhc GAPDH isl1
भ्रूण 20.69 20.92 28.59 32.87 26.30 27.00 33.57
पूल 26.4 22.4 27.7 27.4 24.5 29.2 40.0
एनटीसी 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
श्रेणी 1 सेल-01 25.1 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-02 25.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-03 26.3 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-04 27.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-05 28.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-06 28.2 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-07 29.3 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-08 30.7 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-09 34.3 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
टाइप 2 सेल-10 23.5 28.0 40.0 40.0 40.0 26.3 40.0
सेल-11 23.5 27.2 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-12 23.7 17.9 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-13 24.1 32.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-14 24.9 27.5 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-15 25.9 28.6 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-16 26.0 28.1 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-17 27.0 27.7 40.0 40.0 40.0 38.5 40.0
सेल-18 27.0 27.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-19 27.0 30.2 40.0 40.0 40.0 38.2 40.0
सेल-20 27.0 28.2 40.0 40.0 40.0 39.2 40.0
सेल-21 27.7 30.3 40.0 40.0 40.0 38.6 40.0
सेल-22 30.4 26.2 40.0 40.0 40.0 38.3 40.0
सेल-23 31.3 22.4 40.0 40.0 40.0 39.7 40.0
सेल-24 31.5 28.8 40.0 40.0 40.0 39.5 40.0
सेल-25 33.8 27.4 40.0 40.0 40.0 37.3 40.0
सेल-26 40.0 27.4 40.0 40.0 40.0 36.6 40.0
टाइप 3 सेल-27 24.7 19.9 28.8 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-28 24.8 28.4 26.3 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-29 25.1 23.5 27.6 40.0 40.0 32.5 40.0
सेल-30 26.3 21.4 27.5 40.0 40.0 39.9 40.0
सेल-31 26.9 24.8 28.2 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-32 27.0 22.5 23.8 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-33 27.8 27.6 27।7 40.0 40.0 40.0 40.0
सेल-34 28.1 21.9 26.6 40.0 40.0 37.7 40.0
सेल-35 29.3 26.5 28.1 40.0 40.0 38.3 40.0
प्रकार 4 सेल-36 24.8 20.3 26.0 27.4 26.6 40.0 40.0
सेल-37 28.7 22.3 25.9 28.9 22.9 38.5 40.0
प्रकार 5 सेल-38 25.5 20.0 29.3 23.0 19.9 25.9 40.0
सेल-39 25.9 21.8 28.6 25.1 21.7 25.7 40.0
सेल-40 28.9 22.0 27.0 23.0 21.3 27.6 40.0

तालिका 1. कच्चे सीटी मूल्यों।

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Discussion

विधि वर्णित एक सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण के तहत एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति का उपयोग करता microfluidic सहायता एकल कक्ष पर कब्जा प्रणाली में इस्तेमाल के लिए zebrafish भ्रूण से हृदय पूर्वज कोशिकाओं की आबादी को समृद्ध करने के लिए एकल में हृदय जीन की एक सबसेट की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए कोशिकाओं। बशर्ते कि FACS लेजर उत्तेजना और उत्सर्जन क्षमताओं पसंद का fluorophore (एस) के साथ संगत कर रहे हैं, इस विधि किसी भी फ्लोरोसेंट संवाददाता लाइन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कई zebrafish संवाददाता लाइनों अस्तित्व में पहले से ही कर रहे हैं, और ट्रांसजेनिक उपन्यास संवाददाताओं को ले जाने मछली के रूप में छोटे रूप में 3 महीने में उत्पन्न किया जा सकता है। साथ ही, इस काम के प्रवाह एकल कोशिका-आरएनए अनुक्रमण के लिए पूरे transcriptome से सीडीएनए उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, 5-7 आरएनए अनुक्रमण के लिए उपयुक्त पुस्तकालयों पैदा करने के लिए सीडीएनए तैयारी के लिए अनुकूलित chemistries साथ प्रयोग के लिए थोड़ा संशोधित करने की आवश्यकता होगी कदम। हालांकि, यह जनसंख्या विविधता को मान्य करने की सलाह दी जाती हैविधि उच्च throughput अनुक्रमण अनुप्रयोगों pursing से पहले यहाँ वर्णित का उपयोग करके।

यह ध्यान रखें वर्णित विधि के लिए कुछ सीमाएं देखते हैं कि महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, एकीकृत microfluidic सर्किट (आईएफसी) प्लेटों का उपयोग विशेष, महंगे उपकरण की आवश्यकता है। हालांकि, microfluidic चिप्स पारंपरिक 96 और एकल कक्षों परख करने की क्रिया के लिए 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूपों पर पर्याप्त लाभ प्रदान करते हैं। माइक्रोमीटर पैमाने गलियों के माध्यम से कोशिकाओं और अभिकर्मकों बह द्वारा, एकल कक्षों एकल कब्जा साइटों जहाँ वे सीधे इस बात की पुष्टि की है कि वे अच्छे स्वास्थ्य में एकल कक्षों हैं मनाया जा सकता है में तैनात हैं। शाही सेना निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण प्रत्येक कक्ष के लिए बहुत कम मात्रा का उपयोग करते हुए आईएफसी चिप पर बगल में पाए जाते हैं। एकीकृत fluidic चिप्स, इस लेखन के समय में, केवल एक ही स्रोत के माध्यम से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हालांकि गैर-वाणिज्यिक निर्माण कई समूहों द्वारा प्रदर्शन किया गया है, यह सबसे अधिक प्रयोगशालाओं की क्षमता के बाहर है। 05-07 मई कदमfabrications अन्य कंपनियों द्वारा या घर में उत्पादित प्लेटफार्मों के लिए संशोधित किया जा करने के लिए की जरूरत है। दूसरा, हालांकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईएफसी प्लेटों 96 जीनों को समायोजित कर सकते हैं, चयनित जीन fluorogenic लेबल जीन zebrafish में उपयोग के लिए मान्य जांच की उपलब्धता द्वारा सीमित हैं। तीसरा, zebrafish कोशिकाओं को आमतौर पर स्तनधारी कोशिकाओं की तुलना में छोटे होते हैं, और यह छोटे आकार नमूना प्रसंस्करण के लिए चुनौतियों प्रस्तुत करता है। सेल व्यास में एक छोटा सा परिवर्तन सेल की मात्रा में एक बड़ा परिवर्तन में तब्दील हो, उपलब्ध सामग्री को कम करने और कम का पता लगाने के जीन व्यक्त की संभावना को कम करता है।

इस प्रोटोकॉल के लिए कई अतिरिक्त विचार कर रहे हैं। चरण 1 में, यह केवल एक कम समय के उपयोग खिड़की के भीतर निषेचित भ्रूण के लिए महत्वपूर्ण है। तापमान लगातार और ऑक्सीजन की स्थिति को सीमित किए बिना रखते हुए, zebrafish भ्रूण तुल्यकालिक का विकास। इस प्रोटोकॉल का अंतिम readout (एकल कक्षों से रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति) heteroge के स्रोत भेदभाव नहीं कर सकतेव्यक्ति की कोशिकाओं के बीच neity। इस कारण से, कहनेवाला विविधता की व्याख्या ध्यान से भ्रूण का मंचन किया और तुल्यकालिक विकास पर निर्भर करता है। कदम 2-3, वहाँ हदबंदी और व्यवहार्यता के बीच एक tradeoff है। हालांकि चरण 4 व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए चयन करता है, और चरण 3 कई छानने कदम है कि मदद multimers को बाहर होता है, अधिक पाचन FACS के लिए व्यवहार्य सामग्री उपलब्ध कम हो जाएगा और संभावित हल सेल उपज कम। कदम निवारण करने के लिए कम व्यवहार्यता, पाचन समय को कम करने विचूर्णन तीव्रता को कम करने, और सामग्री शुरू में भ्रूण की संख्या के अनुकूलन शामिल हैं। ब्याज (चरण 4) के सेल की आबादी का FACS संवर्धन यकीनन इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। कड़े छँटाई मानदंड युक्त एक एकल कोशिका तैयारी उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैं केवल ब्याज की फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं रहते हैं। अन्य आबादी से कोशिकाओं को दूषित कहनेवाला विविधता के झूठे प्रतिनिधित्व करने के लिए ले जा सकता है। विशेष रूप से,ब्याज की आबादी के FACS संवर्धन इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए दो रंग की रणनीति के लिए ही सीमित नहीं है। अधिक जटिल रणनीतियों और अधिक परिष्कृत सेल आबादी का उत्पादन और कार्यप्रणाली के सिद्धांत के अध्ययन के सबूत में सूचना देने के लिए एक तेजी से रास्ता हो सकता है। चरण 5 में, कोशिकाओं को सीधे कब्जा कर लिया कोशिकाओं, सेल स्वास्थ्य, और प्रतिदीप्ति प्रोटीन की अभिव्यक्ति की संख्या की पुष्टि करने के लिए मनाया जा सकता है। लेकिन, सेल आकार और चमक के आधार पर ब्याज की fluorophore नहीं नेत्रहीन पता लगाने योग्य हो सकता है और एक विश्वसनीय readout नहीं हो सकता है। कदम 6-8 के सफल समापन के निर्माता के प्रोटोकॉल के लिए सावधान पालन की आवश्यकता है।

सिद्धांत के सबूत के रूप में जाना कार्डियक मार्कर का एक सबसेट की अभिव्यक्ति के स्तर एकल एक पहले से वर्णित बीएसी ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन से निकाली गई nkx2.5 में मूल्यांकन गया: ZsY व्यक्ति nkx2.5 में हृदय भेदभाव मार्करों जांच करने के लिए: 18 घंटा के बाद ZsY पर सकारात्मक कोशिकाओं निषेचन (HPF)। heterogenei पता लगाने के लिएभेदभाव मार्करों पर कब्जा कर लिया nkx2.5 में व्यक्त की TY: ZsY व्यक्त कोशिकाओं, जीन का एक सूट गृह व्यवस्था जीन (ef1a, GAPDH), प्रतिलेखन जल्दी हृदय विशिष्टता (gata4, nkx2.5) में चालू हो जाना जाता कारकों सहित यत्न कर रहे थे, एक दूसरे दिल क्षेत्र पूर्वज मार्कर (isl1), और बाद में ज्ञात जीन हृदय भेदभाव (myl7, vmhc) के दौरान चालू किया जाना है। प्रत्येक जीन के रिश्तेदार बहुतायत चक्र सीमा (सीटी) की गणना के द्वारा QRT- पीसीआर द्वारा मापा गया था। सबसे कम मूल्य की गणना सीटी 17.9 था और उच्चतम 40 था, कोई प्रवर्धन (तालिका 1) का प्रतिनिधित्व। > 35.0 की सीटी मूल्यों का पता लगाने के नीचे माना जाता था।

डेटा सेट में 46 कोशिकाओं के, 6 किसी भी जीन की असफल प्रवर्धन के कारण बाहर रखा गया। शेष कोशिकाओं 5 gata4, nkx2.5, myl7, और vmhc, और wer की अभिव्यक्ति पर आधारित प्रकार में उप-वर्गीकृत किया गया कोशिकाओंई समूहों के भीतर ef1a मूल्य के अनुसार क्रमबद्ध। हालांकि GAPDH मूल रूप से एक संभव गृह व्यवस्था जीन के रूप में शामिल किया गया था, अभिव्यक्ति की कोशिकाओं भर में अत्यधिक चर रहा था, यह एक गृह व्यवस्था जीन के रूप में अनुपयुक्त बना रही है। GAPDH अभिव्यक्ति की संभावना बेहतर है इस प्रकार की कोशिका में हृदय भेदभाव के साथ जुड़े ऊर्जा चयापचय में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है। दिलचस्प है, वहाँ एक सेल में जो ef1a संयुक्त राष्ट्र के detectable था था, लेकिन एक और जीन detectable था (gata1 कोशिकाओं में 26)। यह पता चलता है कि जब ef1a आम तौर पर सफल और असफल एकल कक्ष रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं के बीच अंतर करने के लिए पर्याप्त मात्रा में गृह व्यवस्था जीन है, यह सभी अनुप्रयोगों के लिए आदर्श नहीं हो सकता। सेल 26 में ef1a अभिव्यक्ति की कमी एकल कक्ष ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता के कारण हो सकता है। हाल ही में एकल कोशिकाओं के अध्ययन दिखाना है कि जीन प्रतिलेखन मौलिक स्टोकेस्टिक है, तेजी से और नगण्य ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि 26 के चरणों के बीच बारी। टीउसकी ट्रांसक्रिप्शनल फोड़ मॉडल पता चलता है कि एकल कक्षों के बीच मात्रात्मक तुलना के लिए एक गृह व्यवस्था जीन का उपयोग पूरी तरह से अनुचित हो सकता है।

टाइप 1 समूह में, ef1a केवल जीन का पता लगता है। हित के अन्य जीनों की अभिव्यक्ति के साथ बहुत कम नकारात्मक कोशिकाओं या कोशिकाओं ZsY: ये सेल या तो nkx2.5 शामिल हो सकता है। 2 कोशिकाओं प्रकार सेल-26 के अपवाद के साथ, दोनों ef1a और इन जीनों के रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर में कोई संबंध के साथ gata4 व्यक्त किया। विशेष रूप से, टाइप 1 और टाइप 2 कोशिकाओं में nkx2.5 अभिव्यक्ति उप इष्टतम FACS तंगी, ट्रांसक्रिप्शनल फोड़, ट्रांस्जीन leakiness, या उप दहलीज अभिव्यक्ति के स्तर के कारण हो सकता है। टाइप 3 कोशिकाओं ef1a, gata4, और nkx-2.5 के detectable स्तर व्यक्त की है। इन कोशिकाओं को हृदय की संभावना पूर्वज कोशिकाओं रहे हैं और आलिंद cardiomyocytes फर्क शामिल हो सकते हैं। प्रकार 4 कोशिकाओं ef1a, gata4, nkx2.5, myl7 <के detectable स्तर व्यक्त/ em> और vmhc और संभावना वेंट्रिकुलर cardiomyocytes में फर्क कोशिकाओं रहे हैं। 5 प्रकार की कोशिकाओं ef1a, gata4, nkx2.5, myl7, vmhc, और GAPDH व्यक्त किया। GAPDH के detectable स्तर के अलावा पता चलता है कि इन कोशिकाओं को बढ़ाया glycolytic चयापचय विभेदित cardiomyocytes में पाया के लिए क्षमता है। यह टीजी से ZsYellow सकारात्मक कोशिकाओं के लिए छँटाई के बावजूद कि पेचीदा था। (Nkx2.5: ZsYellow), भ्रूण, 21/40 कोशिकाओं हमारे QRT- पीसीआर विश्लेषण में nkx2.5 के उप दहलीज स्तर इस ट्रांसक्रिप्शनल फोड़ के कारण हो सकता था या अंतर्जात nkx2.5 और ZsYellow के बीच प्रतिलिपि प्रसंस्करण में मतभेद प्रतिबिंबित सकता है। महत्वपूर्ण बात है, दूसरी दिल क्षेत्र मार्कर isl1 किसी भी कोशिकाओं में undetectable था या सीडीएनए हमारे कब्जा साइटों के सभी से जमा। संक्षेप में, नमूने भर में तुलना, पर्याप्त विविधता स्पष्ट एकल कोशिका के स्तर पर था, सुझाव है कि 18 HPF पर, nkx2.5: ZsY + सेलरास भेदभाव के विभिन्न चरणों में हृदय progenitors के साथ ही संतान शामिल।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11254-20 For removing the chorion from embryos
Microcentrifuge tube 2 ml GeneMate C-3261-1
40 um cell strainer Biobasic SP104151
35 mm culture dish Falcon 351008
FACS tubes topped with 35 um cell strainer Falcon 352235
P1000 and tips Rainin 17005089
P20 and tips Rainin 17005091
IFC chip manufacturer's protocol Fluidigm 100-6117 Version 100-6117 E1 was used in representative experiment
Wide bore pastuer glass pippette VWR 14673-010 For transferring embryos
Adult wild type zebrafish N/A We used AB line
Adult transgenic zebrafish N/A We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for cell dissociation
Double distilled water N/A
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
NaCl FisherScientific S271-3 make stock in water and use for de-yolking buffer
KCl Sigma Aldrich P5405 make stock in water and use for de-yolking buffer
NaHCO3 Sigma Aldrich S6014 make stock in water and use for de-yolking buffer
Leibovitz's L-15 Gibco 21083-027
FBS FisherScientific 03-600-511 Heat inactivate; any brand of FBS should be fine
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE Life Technologies 12605-010 Store at room temperature.
Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax Genlantis T200100 Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use
pronase (optional) Sigma P5147
L/D Dye - Sytox Blue Life Technologies S34857 Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work
Trypan Blue Gibco 15250-061
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probes Probes will vary by experiment
TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4 Life Technologies Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5 Life Technologies Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7 Life Technologies Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc Life Technologies Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1 Life Technologies Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol
C1 Reagent Kit Fluidigm 100-5319 Reagents for loading cells onto IFC plate
Ambion Single Cell-to-CTTM Life Technologies 4458237 Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps
Molecular Biology Quality Water Corning 46-000CM
C1 IFC for PreAmp (5-10 um) Fluidigm 100-5757 IFC plate for small cells
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C1 AutoPrep machine Fluidigm 100-5477 For IFC plate use
Hemocytometer  Sigma Aldrich Z359629 For counting cells and assessing cell size
Dissecting microscope For removing embryos from chorion
Tissue culture microscope For assessing single cell digestion
FACS machine For isolating cells of interest

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References

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