Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2McAllister Heart Institute, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill
Published 3/12/2016
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Developmental Biology

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Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53877, doi:10.3791/53877 (2016).

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Abstract

Introduction

La maggior parte degli studi in corso di biologia cellulare e molecolare si basano sulle medie della popolazione. Tuttavia, importanti eventi biologici possono essere mascherati da queste analisi tradizionali basati sulla popolazione dal momento che le popolazioni minori possono giocare un ruolo importante nei processi biologici e l'esito della malattia. Comprendere l'espressione genica in popolazioni eterogenee a livello di singola cellula può (e deve) portare a dati biologici e clinici rilevanti 1,2. Di interesse per gli studi di sviluppo embrionale, in un numero maggiore di cellule, le cellule progenitrici sono spesso sottorappresentati, il che rende difficile per rilevare sottili cambiamenti nell'espressione genica che in ultima analisi iniziativa per le decisioni sul destino delle cellule 3. Analogamente, un singolo tipo di cellula può avere diversi profili di espressione in risposta al microambiente 4. Ad esempio, le cellule endoteliali residenti nello stesso organo o in diversi organi (ad es., Dell'aorta o renali) mostrano una significativa eterogeneità, nonostante la condivisione di MORP comunehological e funzionale dispone di 5. Inoltre, le cellule tumorali che popolano lo stesso tumore può anche avere diversi profili molecolari o mutazioni a livello di singola cellula 6.

In sistemi modello, trascrittomica in singole cellule ha identificato con successo nuove popolazioni di cellule, caratterizzato stati intermedi che si verificano durante la differenziazione cellulare, e ha rivelato le risposte cellulari differenziali agli stimoli 7,8,9. Tali intuizioni sarebbero stati mascherati in studi basati sulla popolazione convenzionali. embrioni di zebrafish sono una fonte immensamente utilizzato sotto-dello stelo, progenitore, e differenziazione delle cellule per esplorare questioni di singola eterogeneità cellulare e regolazione molecolare delle identità cellulari durante lo sviluppo. Il loro altamente stereotipato, ex vivo lo sviluppo e la facilità di manipolazione genetica loro un sistema modello eccellente per questo approccio 10,11 fanno. In particolare, una limitazione importante per l'interpretazione della singola cellula gendati e espressione è che l'identificazione affidabile di nuovi stati di cella intermedi durante lo sviluppo richiede molto attenti tempi di raccolta dei tessuti 9. Ciò è necessario per garantire che eterogeneità tra cellule catturate rappresenta eterogeneità all'interno di un tessuto in un singolo punto tempo piuttosto che eterogeneità nell'espressione genica presentata dalla differenziazione cellulare dipendente dall'età. Rispetto ai topi, sviluppo embrionale zebrafish può essere sincronizzato con precisione su un ampio numero di embrioni 12. Inoltre, con le grandi dimensioni della covata, embrioni di zebrafish può essere utilizzato come una fonte abbondante di cellule staminali e progenitrici.

Questo protocollo descrive un metodo per isolare le cellule da embrioni zebrafish e catturare singole cellule utilizzando un chip e autoprep sistema disponibile commercialmente circuito microfluidica integrato (CFI) per qRT-PCR analisi di espressione genica. Questo protocollo può essere rapidamente trasferibili a qualsiasi test di throughput elevato di multiplazione tra cui interotrascrittoma sequenziamento che permette l'analisi più completa della eterogeneità cellulare 13. Inoltre, offre diversi vantaggi per analisi di espressione genica tradizionali. Il singolo protocollo di isolamento delle cellule produce alta la vitalità dopo FACS, che diminuisce la proporzione di cellule compromesse che sono inclusi in applicazioni a valle. Utilizzando un IFC, le cellule catturate possono essere osservati direttamente per valutare i tassi di cattura e di valutare la salute delle cellule morfologicamente. Inoltre, questo protocollo è ampiamente applicabile per la comunità di ricerca zebrafish, che richiede solo una linea di pesce transgenico etichettati e l'accesso alle tecnologie di cattura microfluidica cellulare.

Come prova di principio, singole cellule derivate da progenitori cardiaci sono stati isolati e catturato su un chip IFC, e quindi la relativa abbondanza di marcatori di differenziazione cardiaci stata misurata qRT-PCR. analisi di espressione genica a livello di singola cellula dimostra che i progenitori cardiaci convivono con la loro differeprogenie ntiating. La conoscenza acquisita da profilatura cella singola di progenitori cardiaci può far luce su l'eterogeneità nei modelli di espressione genica tra cellule progenitrici cardiache durante lo sviluppo dei vertebrati, che potrebbe essere stato mascherato nelle analisi tradizionali basati sulla popolazione.

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Protocol

Questo protocollo richiede l'utilizzo di vivo, zebrafish adulto per la produzione di embrioni. Gli embrioni vengono raccolti per la raccolta dei tessuti. E 'essenziale per ottenere l'approvazione da etici appropriati revisione schede per condurre questo esperimento.

1. Ottenere embrioni graduali

  1. Il giorno prima dell'esperimento, preparare sano, zebrafish adulti per la riproduzione. Inserire un maschio e una femmina su lati opposti di una netta barriera in un serbatoio di allevamento.
  2. Ripetere 1.1 a molti vasche di allevamento come necessari per la produzione di embrioni sufficiente per l'applicazione a valle. Ottenere embrioni da entrambi i pesci wild type e pesci transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti nel tipo cellulare di interesse.
    NOTA: Il numero di embrioni necessari per applicazioni a valle Fasi 2-8 dipende dalla abbondanza relativa delle cellule di interesse per il punto temporale di interesse. Anche se questo può variare a seconda del tipo di cellula, 200 embrioni producono 2,000-5,000 cellule ordinati quando la cbraccia di interesse rappresentano <1,0% delle cellule totali a 24 HPF (ore dopo la fecondazione).
  3. La mattina successiva, cambiare l'acqua nel serbatoio panatura trasferendo pesce a un serbatoio di allevamento fresco e rimuovere il divisore. Inclinare il serbatoio con un angolo per incoraggiare l'allevamento.
  4. Raccogliere gli embrioni in scena.
    1. Ogni 15 minuti, raccogliere gli embrioni trasferendo gli adulti ad un serbatoio di allevamento fresco e passando le uova, che sono lasciati alle spalle attraverso un colino da tè.
      NOTA: zebrafish embrioni si sviluppano in modo sincrono quando mantenuto a densità e temperature paragonabili.
    2. Lavare le uova con l'uovo d'acqua (0,21 g / L sali Ocean istantanei in acqua distillata doppia 1 L) e trasferimento in una capsula di Petri. Trasferire la capsula di Petri di un incubatore umida a 28,5 ° C con circolazione di aria.
  5. Due ore dopo l'ultima raccolta, ordinamento fecondato, embrioni multicellulari in 10 cm capsule di Petri e ridurre la densità a 50 embrioni per piatto. Selezionare gli embrioni provenienti da una singola, 15finestra temporale min di raccolta per l'applicazione a valle. Incubare gli embrioni a 28,5 ° C.
    NOTA: Per esempio, raccogliere gli embrioni alle 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 09:45, 10:00 e 10:15. Confrontando attraverso punti di tempo, se il maggior numero di embrioni fecondati sono dalle grinfie raccolti alle 9:00, quindi utilizzare solo questi embrioni per applicazioni a valle.

2. Impostare per singola cella Dissociazione

  1. Circa 30 minuti prima del punto di tempo di interesse (18 HPF) rimuovere gli embrioni dalla loro corion manualmente con una pinza sottile.
  2. Raccogliere ed etichettare la seguente per ogni condizione: due 2 ml microprovette, uno di 40 micron colino cella, una 35 millimetri piatto di coltura cellulare, e due tubi FACS sormontato da un colino cella di 35 micron.
  3. Raffreddare i seguenti reagenti su ghiaccio: Uovo acqua contenente 0.21g / L sali Ocean istantanea in 1L di acqua bidistillata; De-yolking Buffer contenente 55 mM NaCl, KCl 1,8 mm e 1,25 mm NaHCO 3; e FACS tampone contenente del Leibovitz L-15 multimediale integrato con siero fetale bovino al 5% inattivato al calore.
  4. Portare 1 ml per campione di cellule dissociazione reagente 1 a RT Scongelare 1 ml cellulare dissociazione reagente 2 per campione sul ghiaccio. Portare a Rt immediatamente prima dell'uso.

3. La dissociazione Single Cell

  1. Usando una pipetta di vetro un'ampia foro, trasferire 100-300 embrioni in una provetta da 2 ml microcentrifuga in un volume minimo di acqua Egg.
  2. Euthanize embrioni sostituendo l'acqua con 1 ml ghiacciata Egg Acqua e sommergendo tubo in ghiaccio per 20 min.
    ATTENZIONE! E 'fondamentale per ottenere l'approvazione da adeguata comitato di sorveglianza la cura degli animali istituzionale per questo metodo di eutanasia (agghiacciante sul ghiaccio seguito da dissociazione cellulare come l'eutanasia secondaria). l'eutanasia standard in genere richiede che gli embrioni <3 giorni dopo la fecondazione sono sbiancati dopo che sono stati refrigerati, che non è appropriato per l'ottenimento di cellule vitali.
  3. Lavare gli embrioni due volte con 1 ml ghiacciata Egg acqua. Per lavare, utilizzare una vasta pipetta di vetro foro per rimuovere Uovo acqua e un P1000 per aggiungere Egg acqua.
  4. Rimuovere il tuorlo sostituendo l'acqua embrione con 1 ml Deyolking tampone e triturazione 8-12 volte con una punta P1000, o fino a quando il tuorlo è sciolto e solo i corpi degli embrioni sono visibili.
  5. Raccogliere il tessuto mediante centrifugazione a 300 xg per 1 min. Usare una pipetta per rimuovere delicatamente il surnatante senza interrompere il precipitato di tessuto. Risospendere in 1 ml di acqua Egg.
  6. Ripetere il punto 3.5, per un totale di tre lavaggi, ma il lavaggio finale, risospendere in 1 ml di RT cellulare dissociazione reagente 1.
  7. Incubare in cella di dissociazione reagente 1 per 10 minuti a temperatura ambiente con tubi in posizione orizzontale. Ogni 2-3 minuti, triturare delicatamente con una pipetta P1000 per evitare grumi.
    NOTA: Maneggiare campioni delicatamente durante le fasi di triturazione. A volte un unico, grande gruppo si forma nel tubo da un groviglio di corpi embrionali. Questo saràdisperdere con la digestione ulteriore aiutato dalla leggera triturazione. NON FARE VORTEX.
  8. Raccogliere tessuti mediante centrifugazione a 300 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 ml di cellule dissociazione reagente 2.
  9. Incubare per 5-15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi in orizzontale. Ogni 2-3 minuti, triturare delicatamente per evitare grumi. Ogni 5 min, valutare i progressi compiuti digestione.
    1. Per valutare i progressi compiuti digestione, diluire 2 ml surnatante in 18 microlitri FACS tampone e pipetta come una goccia su un piatto di coltura cellulare.
    2. Mettere un vetrino sul campione ed osservare sotto una cultura al microscopio del tessuto a 10X e 20X ingrandimenti.
      NOTA: La preparazione dovrebbe apparire come un insieme di celle singole, piccoli gruppi, grandi gruppi, e occasionali corpo dell'embrione per lo più intatto.
    3. Visivamente valutare la proporzione della preparazione che è singole cellule e piccoli cluster.
      NOTA: Over-digestione sarà ridurre la vitalità; sotto-digestione ridurrà singolo rendimento delle cellule. </ Li>
  10. Raccogliere il preparato cellulare mediante centrifugazione a 300 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere in 1 ml freddo FACS tampone.
  11. Inumidire un colino cella di 40 micron con FACS tampone. Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro cella 40 micron su un piatto di coltura cellulare da 35 mm. Lavare il filtro delle cellule una volta con 1 ml FACS ordinamento buffer.
  12. Trasferire il flusso continuo in una provetta 2 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti e risospendere in 100 ml FACS tampone.
  13. Conte rendimento delle cellule utilizzando un emocitometro. Ulteriori diluire i campioni di 5x10 6 cellule per ml, o la concentrazione ottimale consigliati per FACS macchina di scelta. Opzionale-Quando il conteggio delle cellule rendimento sul emocitometro, le cellule morte di contrasto con trypan blu per confermare la vitalità della preparazione cellulare prima di FACS ordinamento.
    NOTA: I preparativi che sono troppo diluito avrà eccesso quantità di tempo per ordinare. I preparativi che sono troppo concentrated tendono a raggrupparsi in multimeri e sono ottimali per l'ordinamento di una popolazione pura.
  14. Riserva il 10-20% di ciascun campione da utilizzare come controlli non colorati. Per i campioni rimanenti, le cellule morte macchia aggiungendo un guasto (L / D) discriminazione / live colorante fluorescente in ciascun campione. Non lavare.
    NOTA: Qualsiasi colorante fluorescente che penetra cellule con membrane cellulari compromesse e macchie acidi nucleici possono essere utilizzati come colorante L / D, a condizione che gli spettri di fluorescenza è compatibile con la macchina FACS di cellule scelta ed etichettatura fluoroforo di interesse.
    1. Non lavare la preparazione dopo aver aggiunto il colorante come alcune cellule moriranno in transito alla purificazione FACS e dovrebbero essere esclusi dalla popolazione ordinata.
  15. Inumidire il filtro 35 micron cella ricoperto tubo FACS con 20 microlitri di buffer FACS. Aggiungere cellule per il filtro e raccogliere per gravità. Conservare su ghiaccio.

4. FACS arricchimento

  1. Utilizzare FACS per arricchire per singolo, Cellule vive che esprimono il marcatore fluorescente.
    1. Impostare una porta per distinguere le cellule dai detriti su un grafico a dispersione di forward scatter (FSC-A) di ampiezza vs ampiezza lato scatter (SSC-A), entrambi con scala lineare.
      Attenzione cellule Zebrafish sono in genere più piccolo del mouse o cellule umane. Ciò si riflette in una separazione basale minore tra cellule e detriti.
    2. Dal cancello impostato in 4.1.1, impostare una porta per arricchire per singole cellule ed escludere multimeri utilizzando un grafico a dispersione di altezza avanti scatter (FSC-H) e bassa altezza laterale scatter (SSC-H), entrambi con scala lineare.
      NOTA: Celle con sproporzionatamente alta FSC-H e basso SSC-H sono probabili multimeri e sono esclusi dalla selezione.
    3. Dal set porta al punto 4.1.2, utilizzando i controlli singolo colore, impostare una porta per includere solo le cellule vive usando un grafico a dispersione di FSA-A con scala lineare e l'ampiezza del canale utilizzato per rilevare L / D macchia con scala log. Includere cellule negative L / D.
    4. Da parte diil cancello situato in 4.1.3, utilizzando i controlli singolo colore, impostare una porta per includere solo le cellule vive con fluorescenza positiva utilizzando un grafico a dispersione di FSA-A con scala lineare e l'ampiezza del canale utilizzato per rilevare marker delle cellule proteina fluorescente con scala di registro . Includi cellule positive.
    5. Regolare tutti i controlli di compensazione, se necessario, per tenere conto di interferenza tra la L / D macchia e spettri proteina fluorescente.
  2. logica sorta Set per le cellule che rientrano in tutte le porte impostati nella fase 4.1.
    1. Utilizzando cellule doppio etichettati, verificare gating per l'ordinamento delle cellule.
      NOTA: Le cellule per l'ordinamento sarà cellule piuttosto che detriti, singole cellule piuttosto che multimeri, L / D cellule positive negative e fluorescenza.
  3. Ordina 2000-4000 cellule dalla popolazione di interesse in 5 ml di freddo FACS tampone in una provetta su ghiaccio. Per minimizzare tranciatura e deformazione su cellule di cernita, utilizzare le pressioni più basse possibili per la cellasorter.
    NOTA: La gocciolina 5 microlitri di tampone FACS funge da ammortizzatore per le cellule in uscita della macchina FACS. Raccolta 2000-4000 cellule direttamente nel FACS Buffer elimina la necessità di centrifugazione prima di caricare sui chip IFC. Questa strategia è raccomandato perché centrifugazione può portare alla formazione di multimeri se le cellule aderiscono l'uno all'altro nel pellet
  4. Valutare la fattibilità analisi post-specie.
    1. Trasferire 1 ml cellule ordinati ad un tubo FACS fresco con 100 ml FACS ordinamento tampone e 1: 1000 diluizione L / D macchia. Far passare le cellule attraverso il sorter FACS con la strategia di gating al punto 4.1. Utilizzare la proporzione di L / D negativo a positivo stimare vitalità delle cellule ordinati.

5. Le cellule caricare sul microfluidica Chip

  1. Utilizzando un emocitometro, misurare sia la concentrazione e la dimensione delle cellule ordinati.
    1. Diluire le cellule ordinati ad almeno 10 ml. Diluire un'aliquota del 5 μ; Celle l con 5 ml trypan blu. Caricare sul emocitometro e applicare vetrino.
    2. Raccogliere le immagini in campo chiaro di tutte le cellule in 4 x 4 griglie di emocitometro. Contare il numero di cellule vive e calcolare vivi cellule / ml. cellule vive non occupano trypan blu.
      NOTA: utilizzare qualsiasi software di analisi delle immagini standard per misurare il diametro di tutte le cellule vive. Calcolare la deviazione media e standard della dimensione della cella, e selezionare una piastra IFC adatto al calibro cella di interesse. Se gamma dimensione della cella si trova a cavallo di dimensione celle piatto IFC, utilizzare più piatti per catturare l'intera gamma di cellule di interesse.
  2. Le celle di carico su di IFC piatto secondo le istruzioni del produttore (vedi Materiali).
    1. Diluire le cellule a 1x10 6 cellule / ml e di eseguire l'ottimizzazione dell'assetto secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: ottimizzazione galleggiabilità assicura che le cellule non si depositano sul fondo né a galla della WEL caricol per il carico ottimale su chip di IFC. Il rapporto di tampone di cellule può variare secondo il tipo cellulare, ma varia tipicamente 6: 4-7: 3 di celle: buffer.
    2. Aggiungere cellule per piastra-IFC innescato. Piatto di carico in macchina fluidica compatibile, ed eseguire uno script di carico delle cellule di spingere le cellule attraverso il circuito microfluidica e in corsie di cattura.
  3. Verificare che le cellule sono alloggiati in siti di cattura sulla piastra IFC.
    1. Rimuovere IFC piatto dalla macchina fluidica. Montare la piastra di IFC su un microscopio dotato di una piastra di adattamento.
    2. Raccogliere istantanee di campo chiaro e fluorescenza per ogni sito di cattura a 10X di ingrandimento.
      NOTA: Campo chiaro volte di acquisizione possono variare da 10-50 ms, a seconda della intensità della lampada. i tempi di acquisizione fluorescenza possono variare da 250-750 ms, a seconda della luminosità fluoroforo. Evitare di sovraesposizione cellule per prevenire fotodanneggiamento.

6. cDNA Synthesis

  1. Eseguire lisi cellulare in situ in base al Ile istruzioni del produttore piatto FC.
    1. Aggiungere i buffer di lisi ai pozzetti sulla piastra IFC. Piatto di carico sulla fluidica compatibili macchina e lo script lisi cellulare corsa secondo le istruzioni del produttore.
  2. Eseguire la trascrizione inversa in base alle istruzioni del produttore piatto IFC.
    1. Aggiungere i reagenti trascrizione inversa alla piastra di IFC. Piatto di carico sulla macchina fluidica compatibili. Eseguire lo script trascrizione inversa. Esempi di condizioni di ciclo: 1 ciclo a 25 ° C per 10 min, 1 ciclo a 42 ° C per 1 ora, poi 1 ciclo a 85 ° C per 5 min.
  3. Eseguire pre-amplificazione con sonde gene-specifici in base alle istruzioni del produttore piatto IFC.
    NOTA: A causa della loro maggiore specificità con i numeri a basso copiare, utilizzare sonde fluorogeniche marcato piuttosto che le sonde ottimizzati per l'uso con coloranti intercalanti.
    1. primer Pool e diluire a finale 180 nm ciascuno. Aggiungere primer in pool al piatto IFC. Piatto di carico su fluidi compatibilimacchina cs. script di preamplificazione Esegui.
  4. Eseguire pre-amplificazione con le seguenti condizioni di ciclo: 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, quindi 18 cicli con denaturazione a 95 ° C per 15 sec poi ricottura ed estensione a 60 ° C per 4 min. Conservare pre-amplificato cDNA a 4 ° C fino alla raccolta. Harvest cDNA dalla piastra microfluidica in base alle istruzioni del produttore e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.

7. Selezionare cDNA da singole cellule per singolo obiettivo qRT-PCR

  1. Diluire cDNA in 25 reagente di diluizione ml in base alle istruzioni del produttore.
    NOTA: resa finale è di circa 28 ml di cDNA pre-amplificata per cella. Prenotare una aliquota di diluente per uso come controllo non-template in qRT-PCR.
    1. Riferendosi al campo chiaro e le immagini fluorescenti registrate nella fase 5.3.2, segnare ogni sito di cattura. contare manualmente e registrare il numero di cellule. Valutare e registrare se ogni cella è l'influenzaorescent.
      NOTA: Ogni singolo sito può contenere 0, 1, o> 1 cella, dove> 1 cella include siti di cattura che contengono più celle e / o detriti non identificabile. Se le immagini sono qualità sufficiente, un valore di pixel può anche essere assegnata per quantificare l'intensità del segnale di fluorescenza.
  2. Selezionare i campioni per l'analisi qRT-PCR.
    1. Selezionare campioni di cDNA da siti di cattura identificati nella fase 7.2 che contengono esattamente 1 cella con fluorescenza positiva. Pool 1 ml aliquote di cDNA da ciascun campione.
      NOTA: Questo è il controllo positivo "Pool" utilizzato per determinare se i geni di interesse sono espressi in una qualsiasi delle celle selezionate.
    2. Selezionare cDNA da almeno un sito di cattura che contiene esattamente 0 cellule come controllo negativo. Utilizzare diluente dal punto 7.1.2 come un controllo non-modello.
  3. Eseguire test di qRT-PCR.
    1. Utilizzare solo sonde utilizzate per la pre-amplificazione in fase 6.4.1. Caricare tutti i campioni in triplicate. condizioni bicicletta per una reazione di 10 microlitri su 384 pozzetti: 1 ciclo a 50 ° C 2 min, 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, 40 cicli con denaturazione a 95 ° C 15 sec poi ricottura ed estensione a 60 ° C per 1 min.

Analisi 8. Dati

  1. Convalida qRT-PCR prodotti mediante elettroforesi su gel standard. Confermare prodotto è una singola banda a peso molecolare atteso (varia per ogni sonda).
    NOTA: Se una sonda produce più bande o una singola banda in una dimensione inadeguato, allora la specificità è discutibile, e questo esclude il gene dall'analisi.
  2. Esaminare tutte le curve di amplificazione e tenere conto di eventuali anomalie 14. Calcolare il valore medio CT per ogni combinazione campione / gene 15.
    NOTA: valori CT per i controlli positivi in ​​genere varia 10-30. valori CT per i controlli negativi in ​​genere varia 35-40 (senza amplificazione). valori CT 30-35 sono considerati molto bassa espressionee dovrebbero essere interpretati con cautela 14.
  3. I dati del rapporto
    1. Se i campioni cadono nel CT = 10-30, i dati possono essere segnalati anche come cambiamento volte trascrizione abbondanza relativa ad un campione di controllo.
      NOTA: Fold cambiamento è uguale a 2 ^ (- ΔΔCT) dove ΔCT è relativa a un gene housekeeping sottraendo la media CT del campione del gene housekeeping e ΔΔCT è le differenze di ΔCT tra il campione e un controllo positivo 15.

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Representative Results

Come prova di principio, l'espressione del gene è stata valutata per esplorare le dinamiche di differenziazione durante lo sviluppo cardiaco. In zebrafish, i progenitori cardiaci derivano da una popolazione mesoderma di cellule che migrano verso il mesoderma piastra laterale anteriore dove si fondono per formare il tubo cuore lineare. Prima della fusione, i progenitori cardiaci iniziare ad esprimere il fattore di trascrizione Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), che è pensato per essere il primo marcatore specifico di progenitori cardiaci 16,17. Qui, un precedentemente descritto BAC pesci transgenici Tg (Nkx2.5: ZsYellow) 18, Nkx2.5 abbreviato: ZSY è stato utilizzato per esaminare marcatori di differenziazione cardiaci in singole cellule nella fase 18 somite, 18 ore dopo la fecondazione (HPF) 12. Questo è stato il punto di tempo prima in cui il segnale ZsYellow era percepibile a vista. Come precedentemente descritto per questa linea transgenica, ZsYellow etichette progenitori cardiaci, come abbiamoll come alcune cellule extra-cardiaca che danno origine alla faringe arco cellule endoteliali a 28 HPF 19 (Figura 1A-B, dati non mostrati). Al 18 HPF, Nkx2.5: gli embrioni sono stati ZSY dissociate in una sospensione singola cella poi colorati con Sytox blu di escludere le cellule morte. Dal vivo, ZsYellow positivo, Sytox blu cellule negative erano FACS allineati utilizzando un sorter MoFloXDP o Sony SH800Z dotata di 100 ugelli micron (Figura 1C-F). Per valutare la purezza della popolazione e post-sort redditività filtrate, una aliquota di cellule filtrate sono state colorate con Sytox blu e valutata la percentuale di eventi che rientra all'interno del cancello ordinamento originale (Figura 1G-J).

Dopo la cernita, le cellule sono state inserite in un circuito integrato microfluidica (IFC) del flusso di lavoro del circuito integrato (Figura 2A) secondo le istruzioni del produttore. Un emocitometro, combinato con trypan blu exclusion è stato utilizzato per misurare il diametro delle cellule, la concentrazione e la vitalità (Figura 2B, e dati non mostrati). Cellulare galleggiabilità è stata ottimizzata (6,5: 3,5: cellule buffer) secondo le istruzioni del fabbricante, e le cellule sono stati caricati su un IFC per catturare 5-10 micron di diametro cellule. Per valutare l'efficienza di cattura, fluorescenza e / o segnali luminosi sul campo sono stati ripresi in tutti i siti di cattura, una funzione di piastrelle in Fiji è stato usato per cucire una singola immagine del piatto microfluidica. Ogni sito di cattura contenuta 0, 1 o> 1 singole celle (Figura 2C-F). Come previsto da FACS arricchimento, le cellule catturate espressi ZsYellow (Figura 2G). Efficienza Capture superato il 90% in 5 singoli esperimenti usando Nkx2.5: ZSY ordinati cellule, e almeno il 70% dei siti di cattura erano occupati da una singola cella (dati non mostrati). Le cellule sono state lisate, RNA isolato, cDNA sintetizzato e geni bersaglio specifici sono stati amplificati, il tutto secondo le istruzioni del produttore.

Un sottoinsieme di siti di cattura cellulari sono stati selezionati per l'analisi qRT-PCR come descritto nel protocollo di cui sopra. In particolare, fattore di allungamento 1 bis (efl1a) 20 e gliceraldeide-3 fosfato (GAPDH) 21 sono stati dosati come geni housekeeping che dovrebbero essere espressi in ogni cellula; GATA binding protein 4 (GATA4) 22 e NK2 homeobox 5 (Nkx2.5) come marcatori precoci progenitrici cardiache; ISL LIM homeobox 1 scatola 1 (isl1) come campo marcatore secondo cuore 23,24; e la catena leggera della miosina (myl7) e miosina ventricolare catena pesante (vmhc) 25 per marcare cardiomiociti ventricolari. Sonde gene-specifici sono stati convalidati usando cDNA da 48 embrioni HPF (Figura 3). qRT-PCR è stato utilizzato per valutare l'espressione genica relativo di questi geni in 45 singole cellule da 18 HPF embrioni, un controllo negativo non-modello, e una popolazione in pool containi controllo positivong cDNA da tutti i 96 siti di cattura. valori grezzi CT per 40 celle rappresentativi ed i controlli sono riportati nella tabella 1. In particolare, dal pool di 46 cellule esaminate, 6 celle sono stati esclusi dall'analisi perché tutti i valori CT espressione genica superati CT = 35,0, e non si sa se questi alta CT I valori sono riconducibili a vere e proprie, i livelli di espressione molto bassi o la degradazione del campione. Dal momento che l'intervallo di valori CT per il gene housekeeping, EF1A, era troppo ampio per confrontare l'espressione genica tra i campioni, e molti valori CT superato i 30, valori CT sono stati visualizzati come una mappa di calore (Figura 3). Confrontando tra campioni, una sostanziale eterogeneità di espressione genica è stata osservata, e le cellule sono stati classificati come tipo cellule 1-5 sulla base di pattern di espressione (Figura 3).

Figura 1
Figura 1. isolamento delle cellule singolo di zebrafish cellule positive ZSY a 18 HPF immagini tutto il monte di rappresentante Tg (Nkx2.5: ZsYellow). embrione a 18 HPF con (A) ZsYellow solo a fluorescenza o (B) fusa immagine campo chiaro con. Strategia di gating (CF) Rappresentante FACS per arricchire di cellule positive ZsYellow e (GJ) analisi post-tipo con (C, G) FSC / SSC dimensione gating, (D, H) la discriminazione doppietto, (E, I) Live / gating Morto e (F, J) della popolazione ordinato. Barra della scala è di 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. cattura cella singola di Nkx2.5 zebrafish: ZSY ong> cellule positive. (A) Flusso di lavoro. (B) distribuzione delle dimensioni delle cellule di cellule ordinati dal Tg (Nkx2.5: ZsYellow) embrioni isolati a 18 HPF. (CF) rappresentativi eventi Capture cellule sulla piastra IFC dove (C) è un pozzo vuoto, (D) contiene due cellule, (E) ha una singola cella depositato nel canale fluidica come "cattura canale", e (F) è una singola cella catturato. scatole viola contrassegnare le all'inserto per la visualizzazione ingrandita di siti di cattura. (G) cattura cella singola con campo chiaro, ZsYellow e fusione di immagini. (CF) barra della scala bianco è di 50 micron; barra della scala gialla è di 10 micron. (G) Barra di scala è di 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Analisi dell'espressione genica di cattura singolo Nkx2.5 zebrafish:. ZSY cellule positive espressione genica da qRT-PCR nei controlli positivi (embrioni a 2 giorni post-fertilizzazione, pool cDNA da singole cellule), controllo negativo (no-template ) e 40 singole cellule (cellule 01-40). Valori grezzi CT sono stati codificati a colori basati, come descritto nella chiave. EF1A = fattore di allungamento 1 bis, GATA4 = GATA binding protein 4, Nkx2.5 = NK2 homeobox 5, catena myl7 = leggera della miosina 7, vmhc = miosina ventricolare catena pesante, GAPDH = gliceraldeide-3 fosfato e isl1 = ISL LIM homeobox 1. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Soglia ciclo (CT)
EF1A GATA4 nkx25 myl7 vmhc GAPDH isl1
Embrione 20.69 20.92 28.59 32.87 26.30 27.00 33.57
Piscina 26.4 22.4 27,7 27.4 24.5 29.2 40.0
NTC 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Tipo 1 Cell-01 25.1 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-02 25,4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-03 26.3 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-04 27.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-05 28.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-06 28.2 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-07 29,3 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-08 30.7 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-09 34.3 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
tipo 2 Cell-10 23.5 28.0 40.0 40.0 40.0 26.3 40.0
Cell-11 23.5 27.2 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-12 23.7 17,9 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-13 24.1 32.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-14 24.9 27.5 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-15 25.9 28.6 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-16 26.0 28.1 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-17 27,0 27,7 40.0 40.0 40.0 38.5 40.0
Cell-18 27,0 27.4 40.0 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-19 27,0 30.2 40.0 40.0 40.0 38.2 40.0
Cell-20 27,0 28.2 40.0 40.0 40.0 39.2 40.0
Cell-21 27,7 30.3 40.0 40.0 40.0 38,6 40.0
Cell-22 30.4 26.2 40.0 40.0 40.0 38.3 40.0
Cell-23 31.3 22.4 40.0 40.0 40.0 39,7 40.0
Cell-24 31.5 28.8 40.0 40.0 40.0 39.5 40.0
Cell-25 33.8 27.4 40.0 40.0 40.0 37.3 40.0
Cell-26 40.0 27.4 40.0 40.0 40.0 36.6 40.0
tipo 3 Cell-27 24.7 19.9 28.8 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-28 24.8 28.4 26.3 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-29 25.1 23.5 27.6 40.0 40.0 32.5 40.0
Cell-30 26.3 21.4 27.5 40.0 40.0 39.9 40.0
Cell-31 26.9 24.8 28.2 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-32 27,0 22.5 23.8 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-33 27.8 27.6 27.7 40.0 40.0 40.0 40.0
Cell-34 28.1 21.9 26.6 40.0 40.0 37.7 40.0
Cell-35 29,3 26,5 28.1 40.0 40.0 38.3 40.0
tipo 4 Cell-36 24.8 20.3 26.0 27.4 26.6 40.0 40.0
Cell-37 28.7 22.3 25.9 28.9 22.9 38.5 40.0
tipo 5 Cell-38 25.5 20,0 29,3 23.0 19.9 25.9 40.0
Cell-39 25.9 21.8 28.6 25.1 21.7 25.7 40.0
Cell-40 28.9 22.0 27,0 23.0 21.3 27.6 40.0

Tabella 1. Valori Raw CT.

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Discussion

Il metodo qui descritto utilizza espressione di una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore specifico tipo cellulare per arricchire una popolazione di cellule progenitrici cardiache da embrioni di zebrafish per l'uso nel sistema di assistita acquisizione singola cella microfluidica per valutare l'espressione di un sottogruppo di geni cardiaci nei singola cellule. A condizione che le capacità FACS eccitazione laser e di emissione sono compatibili con il fluoroforo (s) di scelta, questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi linea reporter fluorescente. Molte linee giornalista di zebrafish sono già esistenti, e pesci transgenici portando nuovi giornalisti possono essere generati in appena 3 mesi. Inoltre, questo flusso di lavoro può essere adattato per produrre cDNA da tutta trascrittoma per singola sequenza cella-RNA. Per fare ciò, i passaggi dovranno essere leggermente modificato per l'utilizzo con chimiche ottimizzati per la preparazione di cDNA per la generazione di librerie adatte a RNA sequenziamento 5-7. Tuttavia, è consigliabile convalidare eterogeneità della popolazioneutilizzando il metodo descritto qui prima di inseguire le applicazioni di sequenziamento ad elevato throughput.

È importante notare che ci sono alcune limitazioni al metodo descritto. In primo luogo, l'uso di piastre di circuito integrato microfluidica (IFC) richiede specializzata, attrezzature costose. Tuttavia, i chip microfluidica offrono notevoli vantaggi rispetto ai tradizionali 96 e ben 384 formati lastra e per il saggio singole cellule. Con scorre cellule e reagenti attraverso corsie scala micrometrica, singole cellule sono posizionate in siti di cattura singole dove possono essere osservati direttamente per confermare che sono singole cellule in buona salute. Estrazione di RNA e la sintesi del cDNA si verificano in situ sul chip CFI utilizzando volumi molto bassi per ogni cella. chip fluidici integrati, al momento in cui scriviamo, sono disponibili in commercio attraverso una sola fonte. Sebbene fabbricazione non commerciale è stata eseguita da diversi gruppi, è al di fuori della portata della maggior parte dei laboratori. I passaggi 5-7 maggiobisogno di essere modificato per piattaforme prodotte da altre aziende o in-house invenzioni. In secondo luogo, anche se disponibili in commercio piastre IFC possono ospitare fino a 96 geni, i geni selezionati sono limitati dalla disponibilità di sonde geniche fluorogeniche marcato convalidato per l'uso in zebrafish. In terzo luogo, le cellule zebrafish sono in genere più piccolo di cellule di mammifero, e questa piccola dimensione presenta sfide di trattamento del campione. Un piccolo cambiamento di diametro cellulare traduce in un grande cambiamento in volume cellulare, riducendo materiale disponibile e diminuendo la probabilità di rilevazione bassa espressione di geni.

Ci sono diverse considerazioni aggiuntive per questo protocollo. Nel passaggio 1, è importante solo embrioni fecondati uso all'interno di una finestra di tempo breve. Mantenendo la temperatura costante e senza limitare le condizioni di ossigeno, zebrafish embrioni si sviluppano in modo sincrono. La lettura finale di questo protocollo (relativa espressione genica da singole cellule) non può discriminare la fonte di heterogeneity tra le singole celle. Per questo motivo, l'interpretazione di eterogeneità intercellulare deduce embrioni attentamente gestita e sviluppo sincrono. Nei passaggi 2-3, vi è un compromesso tra la dissociazione e la vitalità. Anche se il punto 4 seleziona per cellule vitali, e il passaggio 3 contiene diversi passaggi filtranti che consentono di escludere multimeri, over-digestione ridurrà il materiale vitale disponibile per FACS e potenzialmente ridurre la resa delle cellule ordinato. I passaggi per risolvere i problemi bassa vitalità includono riducendo i tempi di digestione, ridurre l'intensità triturazione, e ottimizzando il numero di embrioni nel materiale di partenza. FACS arricchimento della popolazione di cellule (fase 4) è senza dubbio la fase più critica in questo protocollo. criteri di ordinamento stringenti sono essenziali per generare un singolo preparazione cellulare contiene solo vivono cellule che esprimono la proteina fluorescente di interesse. Contaminando le cellule provenienti da altre popolazioni potrebbe portare alla falsa rappresentazione di eterogeneità intercellulare. In particolare,FACS arricchimento di una popolazione di interesse non si limita alla strategia due colore indicato in questo protocollo. Più complesse strategie in grado di produrre più raffinate popolazioni di cellule e sono un modo rapido per estendere la metodologia riportata nella prova di principio studio. Nel passaggio 5, le cellule possono essere osservati direttamente per confermare il numero di cellule raccolte, la salute delle cellule e l'espressione della proteina fluorescente. Ma, a seconda delle dimensioni delle cellule e la luminosità, il fluoroforo di interesse può non essere percettibile e non è una lettura affidabile. Il completamento dei passaggi 6-8 richiede un'attenta aderenza ai protocolli del produttore.

Come prova di principio, i livelli di espressione di un sottoinsieme di noti marcatori cardiaci sono stati valutati nel singolo derivato da un precedentemente descritta BAC transgenici linea zebrafish Nkx2.5: ZSY esaminare marcatori di differenziazione cardiaci in Nkx2.5 individuale: cellule positive ZSY al palo 18 ore la fecondazione (HPF). Per esplorare il heterogeneity di marcatori di differenziazione espressi in Nkx2.5 catturato: cellule che esprimono ZSY, una serie di geni sono stati analizzati tra cui geni housekeeping (EF1A, GAPDH), fattori di trascrizione noti per essere acceso all'inizio del specifica cardiaca (GATA4, Nkx2.5), un secondo campo cuore marcatore progenitore (isl1), e geni noti per essere trasformato in un secondo momento durante il differenziamento cardiaco (myl7, vmhc). L'abbondanza relativa di ciascun gene è stata misurata mediante qRT-PCR calcolando ciclo soglia (CT). Il valore più basso CT è stato calcolato al 17,9 e il massimo era 40, che rappresenta nessuna amplificazione (Tabella 1). sono stati considerati valori CT di> 35,0 sotto rilevamento.

Delle 46 celle nel set di dati, 6 sono stati esclusi a causa dell'amplificazione fallito di eventuali geni. Le cellule rimanenti sono stati cellule sub-suddivise in 5 tipologie sulla base di espressione di GATA4, Nkx2.5, myl7, e vmhc, e were allineati secondo valore EF1A all'interno dei gruppi. Anche se GAPDH è stato originariamente incluso come un possibile gene housekeeping, espressione era altamente variabile attraverso le cellule, che lo rende inadatto come un gene housekeeping. Espressione GAPDH probabilmente meglio rappresenta modifiche al metabolismo energetico associati differenziazione cardiaca in questo tipo di cellule. È interessante notare che c'era una cella in cui EF1A era non-rilevabile, ma un altro gene era rilevabile (GATA1 nelle cellule 26). Questo suggerisce che, mentre EF1A è generalmente un gene housekeeping adeguata per distinguere tra le reazioni di successo e insuccesso singoli inversa cella di trascrizione, non può essere l'ideale per tutte le applicazioni. La mancanza di espressione EF1A nella cella 26 potrebbe essere dovuto a dinamiche trascrizionali singola cella. Single-cellule Recenti studi dimostrano che la trascrizione del gene è fondamentalmente stocastica, alternando fasi di rapida e trascurabile attività trascrizionale 26. Til suo modello scoppio trascrizionale suggerisce che l'uso di un gene housekeeping per i confronti quantitative tra singole cellule può essere del tutto inadeguato.

Nel gruppo di tipo 1, EF1A è l'unico gene rilevabile. Queste cellule possono comprendere sia Nkx2.5: ZSY cellule o cellule negative con molto bassa espressione degli altri geni di interesse. Tipo 2 cellule, con l'eccezione di Cell-26, espressi sia EF1A e GATA4 con nessuna correlazione nei relativi livelli di espressione di questi geni. In particolare, l'espressione Nkx2.5 in cellule di tipo 1 e di tipo 2 può essere dovuta a rigore sub-ottimale FACS, scoppio trascrizionale, transgene leakiness, o livelli di espressione di sotto della soglia. Tipo 3 celle esprimono livelli rilevabili di EF1A, GATA4, e NKX-2.5. Queste cellule sono probabili cellule progenitrici cardiache e possono includere differenziare cardiomiociti atriali. Tipo 4 cellule esprimono livelli rilevabili di EF1A, GATA4, Nkx2.5, myl7 </ em> e vmhc ed è probabile che le cellule di differenziazione in cardiomiociti ventricolari. Tipo 5 cellule espresso EF1A, GATA4, Nkx2.5, myl7, vmhc, e GAPDH. L'aggiunta di livelli rilevabili di GAPDH suggerisce che queste cellule hanno la capacità per il metabolismo glicolitico rafforzata trovato in cardiomiociti differenziati. E 'stato interessante che, nonostante l'ordinamento per le cellule positive ZsYellow da Tg. (Nkx2.5: ZsYellow), embrioni, 21/40 cellule avevano livelli sotto-soglia di Nkx2.5 nella nostra analisi qRT-PCR questo potrebbe essere dovuto alla rottura trascrizionale o potrebbe riflettere le differenze di trattamento tra trascrizione Nkx2.5 endogeno e ZsYellow. È importante sottolineare che il secondo campo cuore marcatore isl1 era rilevabile in tutte le cellule o cDNA pool da tutti i nostri siti di cattura. In sintesi, il confronto tra i campioni, una sostanziale eterogeneità era evidente a livello di singola cellula, suggerendo che a 18 HPF, Nkx2.5: ZSY + cells comprendono progenitori cardiaci e progenie a diversi stadi di differenziazione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11254-20 For removing the chorion from embryos
Microcentrifuge tube 2 ml GeneMate C-3261-1
40 um cell strainer Biobasic SP104151
35 mm culture dish Falcon 351008
FACS tubes topped with 35 um cell strainer Falcon 352235
P1000 and tips Rainin 17005089
P20 and tips Rainin 17005091
IFC chip manufacturer's protocol Fluidigm 100-6117 Version 100-6117 E1 was used in representative experiment
Wide bore pastuer glass pippette VWR 14673-010 For transferring embryos
Adult wild type zebrafish N/A We used AB line
Adult transgenic zebrafish N/A We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for cell dissociation
Double distilled water N/A
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
NaCl FisherScientific S271-3 make stock in water and use for de-yolking buffer
KCl Sigma Aldrich P5405 make stock in water and use for de-yolking buffer
NaHCO3 Sigma Aldrich S6014 make stock in water and use for de-yolking buffer
Leibovitz's L-15 Gibco 21083-027
FBS FisherScientific 03-600-511 Heat inactivate; any brand of FBS should be fine
Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE Life Technologies 12605-010 Store at room temperature.
Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax Genlantis T200100 Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use
pronase (optional) Sigma P5147
L/D Dye - Sytox Blue Life Technologies S34857 Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work
Trypan Blue Gibco 15250-061
Name Company Catalog Number Comments
Reagents for IFC plate use and qRT-PCR
Gene-specific probes Probes will vary by experiment
TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1
TaqMan Probe gata4 Life Technologies Dr03443262_g1
TaqMan Probe nk2-5 Life Technologies Dr03074126_m1
TaqMan Probe myl7 Life Technologies Dr03105700_m1
TaqMan Probe vmhc Life Technologies Dr03431136_m1
TaqMan Probe isl1 Life Technologies Dr03425734_m1
TaqMan Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Reagents listed in IFC manufacturer's protocol
C1 Reagent Kit Fluidigm 100-5319 Reagents for loading cells onto IFC plate
Ambion Single Cell-to-CTTM Life Technologies 4458237 Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps
Molecular Biology Quality Water Corning 46-000CM
C1 IFC for PreAmp (5-10 um) Fluidigm 100-5757 IFC plate for small cells
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C1 AutoPrep machine Fluidigm 100-5477 For IFC plate use
Hemocytometer  Sigma Aldrich Z359629 For counting cells and assessing cell size
Dissecting microscope For removing embryos from chorion
Tissue culture microscope For assessing single cell digestion
FACS machine For isolating cells of interest

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References

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