एकल जांच के आवेदन: मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग और परिवेश की स्थिति के तहत सिंगल सेल विश्लेषण

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Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. J. Vis. Exp. (112), e53911, doi:10.3791/53911 (2016).

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Abstract

Protocol

पशु उपयोग और कल्याण की समीक्षा की और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए एनआईएच गाइड का पालन करना चाहिए। माउस ऊतकों के नमूनों सहयोगी डॉ Chuanbin माओ द्वारा प्रदान किया गया।

1. माउस ऊतक अनुभाग तैयारी

  1. अच्छी तरह से ब्याज (मस्तिष्क, गुर्दे, जिगर, आदि) के एक छोटे से प्लास्टिक के केंद्र में की एक पूरी माउस अंग (जैसे, 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट) प्लेस, और ऊतकों में डूब के बारे में 10 मिमी ऊंचाई को यौगिक अप embedding। सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुला ऊतक embedding परिसर में और उस अंग वांछित अभिविन्यास (यानी, बाण, राज्याभिषेक, आदि) में रखा गया है का गठन नहीं है सुनिश्चित करें।
  2. इसके तत्काल बाद फ़्लैश ठंड के लिए तरल नाइट्रोजन में ऊतकों जगह है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमे हुए नमूनों की दुकान।
  3. जमे हुए माउस अंग ले लो और एक temperatu में डिग्री सेल्सियस -15 के लिए पिघलनानियंत्रित cryomicrotome रहे हैं।
  4. ऊतक embedding परिसर के लगभग 500 μl और के साथ सुरक्षित ऊतक एक स्टील के आधार पर एक cryomicrotome इसलिए माउंट कि वांछित सेक्शनिंग उन्मुखीकरण चाकू लिए प्रस्तुत किया है सेक्शनिंग पर रखें।
  5. खंड एक 12 माइक्रोन मोटाई के लिए ऊतक। sectioned ऊतक स्लाइस पॉली कार्बोनेट खुर्दबीन स्लाइड पर रखें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए शुष्क करने छोड़ दें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमे हुए स्लाइड की दुकान।

2. सेल संस्कृति

नोट: सेल संस्कृति बाँझ शर्तों के तहत जैविक सुरक्षा कैबिनेट (जैव सुरक्षा स्तर द्वितीय) में प्रदर्शन किया गया था। हेला सेल लाइन एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और कोशिकाओं पारंपरिक प्रोटोकॉल का पालन के साथ पूरा मध्यम संस्कृति में सुसंस्कृत थे:

  1. गर्म अभिकर्मकों (यानी, ट्रिप्सिन, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), और सेल संस्कृति के माध्यम से) 37 डिग्री सेल्सियस तक।
    नोट: सेल संस्कृति के माध्यम अकार्बनिक SA ​​शामिलएलटीएस, अमीनो एसिड, विटामिन, और दूसरों। घटक दलों की एक पूरी सूची के लिए, निर्माता से तैयार करने के लिए देखें।
  2. सेल नमूना (जैसे, 1 मिलीलीटर हेला सेल निलंबन) प्राप्त करें और एक मानक 10 सेमी सेल संस्कृति की थाली में पूरा सेल संस्कृति के माध्यम से 9 मिलीलीटर में जोड़ें। प्रारंभिक सेल नंबर के आसपास 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल है। कोशिकाओं संस्कृति में जब तक बढ़ रहा सतह सेल संस्कृति की थाली पर 70-80% पर कवर किया जाता है 2-3 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। एक के बाद एक दौर के लिए रिकार्ड सेल बीतने संख्या।
  3. सेल संस्कृति की थाली में सेल passaging (यानी, सेल बंटवारे) प्रदर्शन करना।
    1. महाप्राण मध्यम विकास, और 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर का उपयोग कोशिकाओं कुल्ला करने के लिए। एक बाँझ आकांक्षा टिप का उपयोग पीबीएस निकालें, और संस्कृति की थाली से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 5 मिनट के लिए trypsin (0.25%) के 2.5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: वास्तविक trypsin उपचार समय विशिष्ट trypsin produ के अनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकतासीटी निर्माता से खरीदा है। जबकि अत्यधिक उपचार कोशिका मृत्यु की ओर जाता है अपर्याप्त उपचार समय, कोशिकाओं की थाली से जुड़ी छोड़ देता है।
    2. 7.5 मिलीलीटर पूरा सेल संस्कृति के माध्यम से जोड़कर trypsin गतिविधि को रोकने, और फिर समान रूप से कोशिकाओं (कुल मात्रा 10 मिलीग्राम) resuspend। संस्कृति (2.2 कदम) या एस सी एम एस के नमूने (2.4 चरण) की तैयारी के लिए सेल निलंबन का प्रयोग करें।
  4. एस सी एम एस के प्रयोगों के लिए सेल के नमूने तैयार करें।
    1. एक 12 अच्छी तरह से थाली में अलग-अलग सूक्ष्म कवर स्लाइड प्लेस, और 1.8 मिलीलीटर सेल संस्कृति के माध्यम से जोड़ सकते हैं और अच्छी तरह से में सेल निलंबन के 0.2 मिलीलीटर।
    2. धीरे थाली के हल्के आंदोलन के साथ कोशिकाओं के मिश्रण, और ~ के लिए 24 घंटा 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 के वातावरण में सेते हैं। संवर्धित कोशिकाओं को दवा इलाज करने के लिए, 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में एक दवा यौगिक समाधान (जैसे, DMSO में (डाइमिथाइल sulfoxide)) जोड़ें।
      नोट: फाइनल दवा एकाग्रता (जैसे, 10 एनएम, 100 एनएम, 1 माइक्रोन, और 10 माइक्रोन) के और टीreatment समय (जैसे, 4 घंटा) के अध्ययन के विशिष्ट उद्देश्य के अनुसार विविध रहे हैं। प्रकोष्ठों सूक्ष्म कवर स्लाइड से जुड़ी है और CSMS प्रयोगों (6 चरण) के लिए तैयार कर रहे हैं।

3. एकल जांच फैब्रिकेशन

  1. दोहरे बोर क्वार्ट्ज ट्यूबिंग (भीतरी व्यास (आईडी) 127 माइक्रोन, बाहरी व्यास (ओवर ड्राफ्ट) 500 माइक्रोन) एक लेजर micropipette खींचने में रखें और एक दोहरे बोर क्वार्ट्ज सुई खींच। शुरुआती बिंदु के रूप में निम्नलिखित मानकों का प्रयोग करें: गर्मी = 400, Fil = 3, वेल = 80, डेल = 150, और पुल = 250 (सभी इकाइयों के निर्माता की इकाइयां हैं)। खींच लिया दोहरे बोर क्वार्ट्ज सुई सुनिश्चित इष्टतम जांच संपत्तियों के लिए एक पतला टिप है। खींच लिया टिप कट इतना है कि वहाँ unpulled दोहरे बोर क्वार्ट्ज केशिका दूसरे छोर पर छोड़ दिया की लंबी 5 मिमी है ~।
    नोट: लेजर खींचने की वास्तविक मापदंडों साधन की विशिष्ट परिस्थितियों के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  2. जुड़े सिलिका केशिका के एक ~ 80 मिमी धारा कट (आईडी 40 माइक्रोन, आयुध डिपो। विलायक के रूप में 105 माइक्रोन) केशिका प्रदान करने, और दोहरे बोर क्वार्ट्ज सुई के फ्लैट अंत में एक बोर में डालें।
  3. जुड़े सिलिका केशिका (आईडी 40 माइक्रोन, आयुध डिपो 105 माइक्रोन) के एक ~ 40 मिमी धारा कट और मध्य बिंदु से दाढ़ी बनाने के लिए polyimide कोटिंग की ~ 5 मिमी एक रेजर का उपयोग करें। एक प्रोपेन लौ का उपयोग जल्दी से गर्मी और एक ठीक शंकु के साथ एक नैनो electrospray आयनीकरण (ईएसआई) emitter में जुड़े हुए केशिका खींचने के लिए। एक नैनो ईएसआई emitter (~ 7-10 मिमी लंबे) में कटौती, और दोहरे बोर क्वार्ट्ज सुई के फ्लैट अंत में अन्य बोर में डालें। वैकल्पिक रूप से, लेजर खींचने का उपयोग ठीक एक घटना का उत्पादन।
  4. दोहरे बोर क्वार्ट्ज सुई के फ्लैट अंत पर (~ 1-2 μl) यूवी इलाज राल की एक न्यूनतम राशि लागू करें, और एक एलईडी यूवी लैंप के लिए ~ विलायक सुरक्षित करने के लिए 20 सेकंड का उपयोग कर केशिका और नैनो उपलब्ध कराने राल जमना ईएसआई emitter। प्रक्रियाओं एक एकल जांच में अलग अलग हिस्सों को इकट्ठा करने के लिए चित्रा 1 ए में दिखाया जाता है।
  5. एक मानक माइक्रोस्कोप जीएल कटगधा स्लाइड (1 "एक्स 3") छमाही में लंबेबल। गिलास स्लाइड इतना है कि नैनो ईएसआई emitter बाहर की ओर इशारा किया है के एक छोर पर एकल जांच जगह। एकल जांच के शरीर के लिए नियमित रूप से epoxy लागू इतना है कि यह कांच स्लाइड (चित्रा 1 बी) पर सुरक्षित हो जाता है। सख्त के लिए रात भर छोड़ दें। युगल एकीकृत एकल जांच सेटअप (चित्रा -1 सी) है, जो के रूप में चित्रा 1 डी में सचित्र एक मास स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़ा हुआ है के साथ निर्मित एकल जांच।

4. एकीकृत एकल जांच एमएस सेटअप बनाएँ

  1. मास स्पेक्ट्रोमीटर के आयन स्रोत इंटरफ़ेस निकला हुआ संशोधित करें और स्टैंड डिजिटल त्रिविमदर्शी की (समायोज्य स्थिति और ऊंचाई के साथ) बनाना (आंकड़े 1e और 1F)।
    1. दो छेद एक एल्यूमीनियम ऑप्टिकल बोर्ड की कुर्की के लिए अनुमति के साथ एक आयन स्रोत इंटरफ़ेस निकला हुआ ड्रिल। (से जुड़ी एक स्लाइड रेल डिवाइस और एक ऊंचाई समायोजन रॉड बनाओठीक स्थिति में बदलाव के लिए एक XY मंच), ऐसा है कि डिजिटल प्रणाली त्रिविमदर्शी एल्यूमीनियम ऑप्टिकल बोर्ड (चित्रा 1e से सम्बद्ध किया जा सकता है)।
  2. संशोधित डिजिटल स्टीरियो माइक्रोस्कोप, एक यूएसबी डिजिटल माइक्रोस्कोप, एक लचीला दबाना धारक के साथ एक लघु मैनुअल XYZ अनुवाद चरण, एल्यूमीनियम ऑप्टिकल बोर्ड है, जो मास स्पेक्ट्रोमीटर के अनुकूलित आयन स्रोत इंटरफ़ेस निकला हुआ पर मुहिम शुरू की है करने के लिए मोटर XYZ अनुवाद चरण प्रणाली संलग्न (आंकड़े -1 सी और 1F)। लचीला दबाना धारक का प्रयोग गिलास स्लाइड एक एकल जांच के साथ संलग्न ठीक करने के लिए।
  3. मास स्पेक्ट्रोमीटर (चित्रा 1F) के लिए एकल जांच सेटअप संलग्न। मास स्पेक्ट्रोमीटर के प्रवेश के सामने एकल जांच के emitter जगह के लिए लचीला दबाना धारक और लघु XYZ मंच समायोजित करें। एकल-पी के एक तेजी से बढ़ी छवि प्रदान करने के लिए एकल जांच के पक्ष में यूएसबी डिजिटल माइक्रोस्कोप (समायोज्य दृष्टि कोण के साथ) का प्रयोग करेंबागे टिप या नैनो ईएसआई emitter, और डिजिटल त्रिविमदर्शी (समायोज्य ऊंचाई के साथ) एकल जांच से ऊपर कोशिकाओं और जांच टिप देखने के लिए।
    नोट: इसी आयन स्रोत निकला हुआ किनारा उपयोग करना, इस एकीकृत एकल जांच प्रणाली परिवेश आयनीकरण स्रोतों से लैस मास स्पेक्ट्रोमीटर के किसी भी अन्य प्रकार के लिए मिलकर किया जा सकता है।

5. परिवेश एमएसआई

  1. कमरे के तापमान पर नमूना खंड गला लें और एकल जांच के नीचे मोटर चालित XYZ अनुवाद चरण प्रणाली पर जगह है। नियंत्रण सॉफ्टवेयर में निर्देशांक बदलकर नमूना स्थिति को समायोजित करें।
  2. सिरिंज का प्रयोग एक उचित दर (जैसे, 0.2 μl / मिनट) पर नमूना विलायक पंप, और आयनीकरण वोल्टेज (जैसे, 5 केवी) लागू करने के लिए। नमूना विलायक का चयन लचीला है, और आम लोगों MeOH में शामिल हैं: पानी (9: 1) और acetonitrile। नैनो ईएसआई emitter के मृत मात्रा ~ 3 NL, और जांच-surfa के बीच के समय होने का अनुमान थासीई से संपर्क करें और आयन संकेत अवलोकन आम तौर पर कम से कम 1 सेकंड 15 है।
    नोट: अनुकूलित आयन स्रोत इंटरफ़ेस निकला हुआ आयनीकरण वोल्टेज एक मगरमच्छ क्लिप के माध्यम से एक प्रवाहकीय संघ के मास स्पेक्ट्रोमीटर से बचाया जा सकता है। आयनीकरण वोल्टेज तो केशिका और एकल जांच चैनलों के अंदर विलायक करने के लिए एक प्रवाहकीय यूनियन के माध्यम से प्रेषित किया है, और नैनो-ईएसआई emitter जांचा analytes योण बनाना पर लागू किया जाता है। सुनिश्चित करें कि आयनीकरण वोल्टेज बंद कर दिया है जब प्रवाहकीय संघ के साथ मगरमच्छ क्लिप को जोड़ने।
  3. एकल जांच इतना है कि यह सिर्फ नमूना की सतह से ऊपर आराम कर रही है और चयापचयों की सतह-निष्कर्षण प्रदर्शन करने में सक्षम है की ऊंचाई को समायोजित करें। ध्यान से जेड मंच उठा, और फिर यूएसबी डिजिटल माइक्रोस्कोप (एकल जांच के पक्ष में) का उपयोग एकल जांच टिप और ऊतकों की सतह के बीच की दूरी परिवर्तन पर नजर रखने के लिए। इस ऊंचाई समायोजन के दौरान बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम में बदलाव पर नजर रखने, और लिफ्ट बंद करोजेड चरण हैैं जब ऊतक चयापचयों के लिए विलायक पृष्ठभूमि से आयन संकेत का एक परिवर्तन मनाया जाता है।
  4. दोहराएँ कदम 5.3 तीन बार स्वचालित सतह सपाट समायोजन के लिए मंच नियंत्रण कार्यक्रम के भीतर तीन अलग-अलग अंक निर्धारित करने। एक दूसरे से अलग के बारे में 10 मिमी की दूरी पर नमूना की सतह पर तीन बिंदुओं पर भी जांच की नोक रखें। अप का उपयोग करके और माउस के नीचे ऊंचाई समायोजन करते हैं, और "योजना विधि" के तहत की स्थिति में तीन अंक ताला।
  5. नमूना इस प्रोग्राम का उपयोग कर के भीतर ब्याज की धारा भर में rastering के लिए अन्य मानकों सेट करें। माउस गुर्दे यहाँ प्रस्तुत वर्गों के लिए, एक 10.0 माइक्रोन / सेकंड की गति और rastering लाइनों के बीच 20 माइक्रोन दूरी का उपयोग करें। मोटर चालित मंच प्रणाली एक 0.1 माइक्रोन न्यूनतम वेतन वृद्धि प्रस्ताव है। एकल जांच टिप और ऊतकों के बीच की दूरी 5.3 चरण से प्राप्त की है।
  6. मास स्पेक्ट्रोमीटर से एमएस स्पेक्ट्रा के स्वचालित अधिग्रहण के लिए एक विधि सेट करें। एफओआर उच्च सामूहिक संकल्प, माउस गुर्दे नमूना पर MSI निम्नलिखित मानकों का उपयोग करें: सामूहिक संकल्प 60,000 (M / Δm), ~ 5 केवी सकारात्मक मोड, 1 Microscan, 150 मिसे अधिकतम इंजेक्शन समय, और एजीसी पर। एमएस छवि के व्यक्ति लाइनों का प्रतिनिधित्व करने वाले सभी का अधिग्रहण एमएस स्पेक्ट्रा प्रत्येक स्कैन के बीच एक समान समय अंतर के साथ स्कैन के एक ही नंबर था, यह दर्शाता है कि उत्पादित छवियों के लिए पिक्सेल आकार समान रूप से वितरित किया गया।
  7. एमएसआई डाटा अधिग्रहण आरंभ करें। मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए एमएस अधिग्रहण अनुक्रम आरंभ, और फिर XYZ नियंत्रण कार्यक्रम के लिए rastering अनुक्रम आरंभ करें।
    1. उदाहरण के लिए, एमएस डाटा अधिग्रहण यहाँ उपयोग कार्यक्रम में, "अनुक्रम सेटअप" जाओ, "नए अनुक्रम", 01 से एक्स, जहां एक्स के लिए इस्तेमाल किया लाइनों की संख्या है गिने एक नया क्रम के लिए फ़ाइलों का एक सेट उत्पन्न वांछित एमएस छवि लिया जा सकता है, और फिर प्रेस "भागो अनुक्रम"।
    2. सॉफ्टवेयर एक conta का उत्पादन करने की अनुमति देने के लिए एक घर का बना इलेक्ट्रॉनिक डिवाइस का प्रयोग करेंमास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए सीटी बंद संकेत डेटा एकत्र करने के लिए। सर्किट आरेख अनुपूरक चित्रा (चित्रा एस 1) एक संदर्भ के रूप में दिखाया गया है।
  8. उचित एमएसआई दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग कच्चे एमएस फाइलों से एमएस छवियों का निर्माण। उदाहरण के लिए, जब PNNL 17 Laskin के समूह द्वारा विकसित सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर, निम्न चरणों का प्रदर्शन करते हैं।
    1. "भौंहें फ़ाइल क्लिक करें।" एमएसआई प्रयोग से प्राप्त पहली फ़ाइल का चयन करें। निर्दिष्ट करें जहां के तहत फ़ाइल से शुरू होता है और खत्म "लाइनों की संख्या।" "दर्ज MZ रेंज" के अंतर्गत एमएस छवि की श्रृंखला के लिए मी / z मूल्यों की एक श्रृंखला का चयन करें।
    2. छवि निर्माण की प्रक्रिया शुरू करने के लिए बटन "शुरू" दबाएँ। एक बार एमएस छवि बना दिया है, कंप्यूटर में छवियों को स्टोर करने के लिए क्लिक करें "छवि सहेजें" "टूलबार 'के तहत।

6. में सीटू लाइव एस सी एम एस

  1. सेटअप प्रति निर्देश के रूप में एकल जांच प्रणालीएमएसआई के लिए आयनों। विलायक (जैसे, MeOH / एच 2 ओ या acetonitrile) को समायोजित प्रवाह की दर (जैसे, ~ 25 nl / मिनट)।
  2. सांस्कृतिक मीडिया और बाह्य दवा घटकों को दूर करने के लिए पीबीएस के साथ, सुसंस्कृत कोशिकाओं है, जो सूक्ष्म कवर गिलास स्लाइड पर जुड़े होते हैं धो लें। प्रयोग के लिए मोटर XYZ अनुवाद चरण प्रणाली पर गिलास स्लाइड युक्त सेल रखें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, (भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त बिना) ताजा सेल संस्कृति के माध्यम का उपयोग संवर्धित कोशिकाओं कुल्ला करने के लिए। कम आयन दमन देखा गया है। इसके अलावा, सेल प्रयोग जहां परिवेश के तापमान (~ 20 डिग्री सेल्सियस) तापमान संस्कृति (37 डिग्री सेल्सियस) की तुलना में काफी कम है के दौरान लंबे समय के लिए जीवित रह सकते हैं। दवा प्रकार, समाधान एकाग्रता, और उपचार के समय विभिन्न अध्ययनों में भिन्नता है।
  3. एकल जांच की नोक पर (नमूना) से ऊपर डिजिटल स्टीरियो माइक्रोस्कोप फोकस विश्लेषण के दौरान सेल प्रवेश नजर रखने के लिए। रों पर यूएसबी डिजिटल माइक्रोस्कोप (प्रयोगएकल जांच के आईडीई) एकल जांच पर नैनो ईएसआई emitter के काम करने की स्थिति पर नजर रखने के लिए।
  4. मोटरयुक्त XYZ चरण नियंत्रण कार्यक्रम और डिजिटल स्टीरियो माइक्रोस्कोप (कोशिकाओं) से ऊपर का प्रयोग करें ब्याज की एक सेल का पता लगाने के लिए, और ठीक नमूना ऊपर एकल जांच टिप स्थिति। एमएस डाटा अधिग्रहण शुरू होने से पहले एकल जांच टिप सेल में डाला जाता है।
    1. सामूहिक संकल्प 100,000 (M / Δm), ~ 3 केवी सकारात्मक और नकारात्मक मोड, 1 Microscan, 150 मिसे अधिकतम इंजेक्शन समय, पर एजीसी मोड: एमएस विश्लेषण के लिए संदर्भ में एक उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर के रूप में निम्नलिखित मानकों का प्रयोग करें। एमएस स्पेक्ट्रा की स्वचालित अधिग्रहण एमएस डाटा अधिग्रहण कार्यक्रम में "शुरू" पर क्लिक करके किया जाता है।
    2. कोशिका झिल्ली घुसना और सेल से उत्पन्न एमएस संकेत रिकॉर्डिंग रखने के लिए आइकन पर क्लिक करके मोटर जेड चरण लिफ्ट। 1-2 सेकंड के एक समय में देरी आमतौर पर जांच प्रविष्टि और एमएस संकेत का पता लगाने के बीच मनाया जाता है। के अन्य पुष्टि के रूप मेंसेल प्रवेश, एमएस संकेतों के एक नाटकीय बदलाव कोशिका झिल्ली के प्रवेश पर देखा जा सकता है। intracellular यौगिकों के एमएस संकेतों आमतौर पर ~ एक से पहले 15-20 सेकंड में काफी कमी पिछले कर सकते हैं।
    3. सेल प्लेट युक्त सेल से एकल जांच टिप बाहर खींचने के लिए नीचे कम। यह आमतौर पर सेलुलर यौगिकों के आयन संकेतों के लिए <15 सेकंड लेता शोर स्तर दृष्टिकोण करने के लिए। के लिए ~ 3 मिनट के लिए पूरी तरह से एकल जांच फ्लश करने के लिए विलायक प्रवाह करते हैं। इस बीच, अगले सेल का पता लगाने की मोटर चालित XYZ चरण प्रणाली की स्थिति का विश्लेषण किया जाए। प्रत्येक कोशिका प्रयोग ~ 3 मिनट के पूरा होने की आवश्यकता है।

Representative Results

एकल जांच सफलतापूर्वक sectioned माउस गुर्दे ऊतक 15 के परिवेश एमएसआई के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। डिवाइस सतह तरल सूक्ष्म निष्कर्षण (चित्रा 1 ए), जो एक छोटे से क्षेत्र से अत्यधिक कुशल analyte निकासी प्रदान करता एमएसआई परिणामों में प्रचुर मात्रा में आयन संकेतों तीव्रता के लिए अग्रणी के तंत्र का उपयोग करता है। उदाहरण के लिए, 10 से अधिक 7 के संकेत तीव्रता कुछ प्रचुर मात्रा में चयापचयों (चित्रा 2A) के लिए हासिल की है। चयापचयों की एक बड़ी संख्या इस तरीके से पता चला रहे थे, (एस) sphingomyelin की एक संख्या है और phosphatidylcholine (पीसी) जैसे प्रजातियों [एस.एम. (34: 1) + एनए] सहित + (725.5575 मी / z), [पीसी (32: 0) + एच] + (734.5700 मी / z), [पीसी (34: 1) + एनए] + (782.5696 मी / z), और [पीसी (38: 5 + ना)] + (814.5726 मी / z)। जब टी मिलकर इन यौगिकों उच्च सामूहिक संकल्प और बड़े पैमाने पर सटीकता के साथ की पहचान की गईOA उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमीटर। उदाहरण के लिए, पहचान कम से कम 4 पीपीएम मी / z जन सटीकता (यानी, मनाया और सैद्धांतिक मूल्यों के बीच अंतर) परिणामों में (चित्रा 2 बी) प्रत्येक मेटाबोलाइट के लिए यहाँ प्रस्तुत के साथ हासिल की थी। इसके अलावा, मिलकर एमएस विश्लेषण करती है (यानी, एमएस / एमएस) ने भी ब्याज की प्रजातियों में से अधिक आत्मविश्वास पहचान के लिए आयोजित की गई। 15

एक छोटे से क्षेत्र पर कुशल तरल सूक्ष्म निष्कर्षण प्रदर्शन करने की क्षमता के कारण, एकल जांच डिवाइस परिवेश की स्थिति 15 के तहत उच्च स्थानिक संकल्प एमएसआई प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, माउस गुर्दे वर्गों की विस्तृत एमएस छवियों का चयन किया चयापचयों (चित्रा 2 सी) के स्थानिक वितरण illustrating प्राप्त किया गया है। एमएस छवि के स्थानिक संकल्प, 8.5 माइक्रोन होना करने के लिए निर्धारित किया गया था transiti होने का व्यापक रूप से इस्तेमाल मीट्रिक निम्नलिखित। एमएस संकेत के एक 20-80% तीव्रता परिवर्तन के भीतर निर्धारित एक तेज सुविधा के बिंदु 18 के फॉस्फोलिपिड मामले में पर [पीसी (38: 5 + ना)] + माउस गुर्दे अनुभाग, भीतरी मज्जा के बीच सुविधा संक्रमण पर और बाहरी मज्जा chronogram में एक चक्र स्कैन भर में जगह लेता है, एक तीव्रता परिवर्तन से अधिक 20-80% रेंज दिखा। नमूना चलती गति (10.0 माइक्रोन / सेक) और एमएस डाटा अधिग्रहण दर (0.85 सेकंड / स्पेक्ट्रम), नमूना एक एमएस में दूरी स्कैन चक्र (8.5 माइक्रोन), यानी, एमएसआई स्थानिक संकल्प चलती है, गणना की जा सकती है (चित्रा के आधार पर 2 डी)। इस स्थानिक संकल्प उच्चतम अभी तक जैविक नमूने पर आयोजित परिवेश एमएसआई तकनीक के लिए हासिल बीच है।

एस सी एम एस के लिए एकल जांच व्यक्ति को लाइव हेला कोशिकाओं 16 के विश्लेषण को प्राप्त करने में सक्षम था। एकल जांच की नोक आकार आम तौर पर कम से कम 10 माइक्रोन है (छविUre 3 ए), जो काफी छोटा है सीधे कोशिकाओं, के कई प्रकार में डाला जाएगा, जिनमें से व्यास ~ 10 माइक्रोन, निकासी और एमएस विश्लेषण के लिए है। एक सेल में एकल जांच टिप की प्रविष्टि प्रक्रिया नेत्रहीन एक डिजिटल स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग नजर रखी जा सकती है (चित्रा 3 बी), और कोशिका झिल्ली प्रवेश पीबीएस (या ताजा सेल संस्कृति से जन स्पेक्ट्रा के तेजी से और महत्वपूर्ण परिवर्तन के माध्यम से इस बात की पुष्टि की जा सकती है मध्यम) intracellular यौगिकों (आंकड़े -3 सी और 3 डी) के लिए। प्रयोगों आणविक प्रजातियों के व्यापक प्रकार का पता लगाने के लिए दोनों सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड में आयोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 18 विभिन्न प्रजातियों लिपिड, सकारात्मक मोड में पहचान की गई है, sphingomyelins (एस) और phosphatidylcholines (पीसी) सहित जबकि एडेनोसाइन फॉस्फेट (एएमपी, ADP, और एटीपी) नकारात्मक आयन मोड (आंकड़े -3 सी और डी) में पाया गया। एकल जांच प्रविष्टि मैं के बीच के समय में देरीएक सेल और संकेत का पता लगाने Nto आम तौर पर कम से कम दो सेकंड था, सेलुलर चयापचयों के एक निकट वास्तविक समय का पता लगाने की इजाजत दी। एस सी एम एस भी प्रयोगों जहां कोशिकाओं विरोधी दवाओं (जैसे, OSW -1, PACLITAXEL, और डॉक्सोरूबिसिन) 19] के साथ इलाज किया गया करने के लिए लागू किया गया था। इसी दवाओं सांद्रता (यानी, 10 एनएम, 100 एनएम, 1 माइक्रोन, और 10 माइक्रोन) के DMSO में (डाइमिथाइल sulfoxide), इलाज कोशिकाओं का उपयोग (केवल DMSO जोड़ने की एक श्रृंखला में 4 घंटे के इलाज के बाद हेला कोशिकाओं के भीतर पाया जा सकता है ) नियंत्रण के रूप में। दवाओं के एमएस संकेतों बाह्य पीबीएस या नियंत्रण (3E चित्रा) के भीतर मौजूद नहीं थे, लेकिन एकल जांच एमएस तकनीक (केवल 100 एनएम उपचार के परिणाम चित्रा 3F में दिखाया जाता है) का उपयोग कर एकल कक्षों के भीतर पाया गया। क्योंकि कोशिकाओं पीबीएस (या ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से) के साथ rinsed थे, बाह्य यौगिकों और संदूषण दूर करने के लिए अंतर्जात चयापचयों (जैसे, सेल लिपिड एक का पता लगाने केडी एडेनोसाइन फॉस्फेट) और बहिर्जात यौगिकों (जैसे, विरोधी दवाओं) इंगित करता है कि एकल जांच एमएस तकनीक intracellular यौगिकों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1. निर्माण और परिवेश एमएसआई और एस सी एम एस के विश्लेषण के लिए एकल जांच के सेटअप। क) एकल जांच का निर्माण प्रक्रियाओं। ख) एक गढ़े एकल जांच एक गिलास स्लाइड। ग) एकल की तस्वीर से जुड़ी की तस्वीर जांच सेटअप एक मास स्पेक्ट्रोमीटर। डी से जुड़ी) एकल जांच एक मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ मिलकर सेटअप का आरेख। एक प्रयोग के दौरान, नमूना विलायक लगातार सिरिंज से प्रदान की जाती है, आयनीकरण वोल्टेज मास स्पेक्ट्रोमीटर से प्रवाहकीय संघ के लिए लागू किया जाता है, दो डिजिटल माइक्रोस्कोप नमूना प्लेसमेंट के निगरानी के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, मोटरयुक्त XYZ मंचप्रणाली नमूना गति को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और एक मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए विश्लेषण। प्रयोग किया जाता है) अनुकूलित डिजिटल त्रिविमदर्शी प्रणाली। एफ) फोटोग्राफ डिजिटल त्रिविमदर्शी एक ऑप्टिकल बोर्ड के माध्यम से आयन स्रोत इंटरफ़ेस निकला हुआ किनारा करने के लिए संलग्न दिखा की तस्वीर। के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र 2
चित्रा 2. उच्च स्थानिक और सामूहिक संकल्प के साथ एक माउस गुर्दे खंड के एक परिवेश एमएसआई अध्ययन से परिणाम। क) एकल जांच एमएसआई से एक प्रतिनिधि जन स्पेक्ट्रम। पता चला चयापचयों की अधिकतम तीव्रता 3.39 10 x 7 (मनमाना इकाइयों) तक पहुँच सकते हैं। ख) का पता चला चयापचयों का उनके बड़े पैमाने पर सटीकता। ग के साथ प्रस्तुत)एमएस छवियों [पीसी (32: 0) + एच] और [पीसी (34: 1) + ना] + 8.5 माइक्रोन स्थानिक संकल्प पर एक माउस गुर्दे अनुभाग से लिया। पीसी: phosphatidylcholine। स्केल पट्टी: 2 मिमी, 0.20 मिमी (इनसेट) घ) के लिए एमएस छवि के स्थानिक संकल्प का निर्धारण। [पीसी (38: 5) + एनए] + (संदर्भ 15 से अनुमति के साथ अनुकूलित)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. उच्च सामूहिक संकल्प के साथ दवा इलाज किया हेला कोशिकाओं के एक परिवेश एस सी एम एस विश्लेषण से परिणाम। एक) में बढ़कर एकल जांच व्यास में <10 माइक्रोन का एक विशिष्ट आकार दिखा टिप की तस्वीर। ख) फोटोग्राफ के बिंदु पर लिया एक हेला सेल में एकल जांच प्रविष्टि। स्केल पट्टी: 50 माइक्रोन।ग) पीसी (phosphatidylcholine) प्रजातियों। घ) हेला कोशिकाओं सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड में दोनों। एफई) के लिए जन स्पेक्ट्रा एस सी एम एस के विश्लेषण से पता चला चयापचयों का एक प्रतिनिधि सूची के एक नंबर की पहचान के साथ एक ठेठ सकारात्मक आयन मोड जन स्पेक्ट्रम नियंत्रण और इलाज (100 एनएम OSW -1) कोशिकाओं (संदर्भ 16 से अनुमति के साथ अनुकूलित)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा एस 1। इलेक्ट्रॉनिक मास स्पेक्ट्रोमीटर डेटा एकत्र करने के लिए संपर्क बंद संकेत का उत्पादन किया जाता डिवाइस के सर्किट आरेख। देख सकते हैं या यह आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

एकल जांच एक multifunctional डिवाइस है कि दोनों MSI और एस सी एम एस के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एकल जांच सेटअप (अनुवाद चरण प्रणाली, माइक्रोस्कोप, आयन स्रोत इंटरफ़ेस निकला हुआ किनारा, आदि सहित) एक ऐड-ऑन घटक है कि लचीले ढंग से मौजूदा मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए अनुकूलित किया जा सकता के रूप में बनाया गया है। एकल जांच सेटअप और पारंपरिक ईएसआई आयन स्रोत के बीच एक तेजी से आदान-प्रदान एक मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है। सिद्धांत रूप में, उचित आयन स्रोत इंटरफ़ेस का उपयोग कर निकला हुआ, एकल जांच सेटअप किसी अन्य मास स्पेक्ट्रोमीटर लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, नमूना अभिकर्मकों की एक किस्म युक्त विलायक प्रतिक्रियाशील एमएसआई और एस सी एम एस के प्रयोगों के लिए एकल जांच सेटअप है, जो बहुत biomolecules के व्यापक पर्वतमाला का पता लगाने को बढ़ाता है के साथ प्रयोग किया जा सकता है। जानवरों के ऊतकों और सेल लाइनों के अलावा, एकल जांच भी इस तरह के पौधों के रूप में अन्य जैविक प्रणालियों का विश्लेषण करने में सक्षम है। इसलिए, एक ही प्रयोगात्मक सेटअप के साथ औरइसी तरह के उपयोगकर्ता प्रशिक्षण, अध्ययन की एक किस्म के लिए एक एकल साधन का उपयोग किया जा सकता है और एक ही उपयोगकर्ताओं द्वारा, कुशल और बहुमुखी प्रयोगों के लिए अनुमति देने के लिए न्यूनतम प्रशिक्षण समय और इंस्ट्रूमेंटेशन लागत के साथ पूरा किया जा सके।

एकल जांच एमएस तकनीक के प्रमुख घटक जांच ही है। एकल जांच की गुणवत्ता में अपने प्रदर्शन है, जो काफी हद तक दोनों MSI और एस सी एम एस के प्रयोगों की गुणवत्ता निर्धारित करता है पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है। जब एकल जांच fabricating, यकीन है कि दोहरे बोर ट्यूबिंग के अंदर केशिकाओं सुरक्षित प्रयोगों के दौरान विलायक रिसाव की संभावना को समाप्त करने के लिए चिपके रहे हैं। यह यूवी का इलाज epoxy की एक न्यूनतम राशि है, कि इस तरह के orifices और केशिकाओं जांच निर्माण के दौरान भरा नहीं कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।

एकल जांच जैविक नमूने 15 पर संचालन करने के लिए उच्च स्थानिक और सामूहिक संकल्प परिवेश एमएसआई इस्तेमाल किया गया है। खत्म परिवेश एमएसआई के प्रमुख लाभगैर-परिवेश के तरीकों कि नमूना तैयार करने के लिए एक वैक्यूम नमूना पर्यावरण के लिए कोई जरूरत नहीं है, जो नमूना एक के पास देशी राज्य 8 में विश्लेषण करने की अनुमति देता के साथ एक न्यूनतम पर रखा जाता है। अधिकांश अन्य परिवेश एमएसआई तकनीक के लिए प्रमुख बाधाओं में से एक स्थानिक संकल्प 1 की कमी की गई है। desorption आधार के साथ तुलना MSI, एकल जांच की छोटी सी टिप आकार की अनुमति देता है एक और अधिक मजबूत और कुशल सतह तरल सूक्ष्म निष्कर्षण के एक उच्च स्थानिक संकल्प के लिए अग्रणी, एक छोटे से क्षेत्र पर प्रदर्शन किया जा रहा है (जैसे कि देसी और LAESI के रूप में) तकनीक 8.5 माइक्रोन, जो परिवेश एमएसआई तकनीक का प्रयोग कर प्राप्त 15 सबसे ज्यादा लोगों के बीच है। इसके अलावा, नमूना विलायक के घटकों का समायोजन अतिरिक्त लचीलेपन के प्रयोगों का संचालन करने के लिए प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, नमूने अभिकर्मकों (जैसे, dicationic यौगिकों) युक्त सॉल्वैंट्स प्रतिक्रियाशील एमएसआई प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, पहचान चयापचयों पीई की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि के लिए अनुमतिआर प्रयोग 20। एकल जांच के अन्य लाभ यह एकीकृत डिजाइन, जो पूरे डाटा अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान आपरेशन में आसानी प्रदान करता है। क्योंकि नोक और ऊतकों की सतह के बीच की दूरी आयन संकेत तीव्रता और स्थिरता, एक फ्लैट ऊतक अनुभाग प्राप्त करने और समायोजन सपाट दूरी विचरण को कम से कम करने के लिए सतह के संचालन के लिए बहुत ही संवेदनशील है उच्च गुणवत्ता एमएसआई प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण है। यह इस प्रकार है कि एकल जांच एमएसआई तकनीक असमान सतहों के उच्च स्थानिक एमएस छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

एक उच्च गुणवत्ता जांच fabricating के अलावा, ध्यान से साधन ट्यूनिंग सफल एमएसआई प्रयोग के लिए आवश्यक है। सभी ट्यूनिंग कदम के अलावा, ऊपर ऊतक अनुभाग सतह एकल जांच टिप की ऊंचाई का समायोजन सबसे महत्वपूर्ण एक है। जब जांच ऊंचाई का समायोजन, नमूने विलायक पंप और, आयनीकरण वोल्टेज पर बारी इतना है कि केवल विलायक पृष्ठभूमि आयन संकेतों observ हो सकता हैईडी। फिर जन स्पेक्ट्रम के परिवर्तन की निगरानी करते हुए सावधानी से जब तक ऊतक अनुभाग से मजबूत और स्थिर आयन संकेतों मनाया जा सकता है मोटर जेड चरण उठाने से जांच-सतह दूरी को कम करने; इस जांच ऊंचाई प्रयोग के दौरान एमएसआई डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। इसके अलावा, एक अनुकूलित विलायक प्रवाह की दर एमएसआई प्रयोगों के लिए आवश्यक है। अनुकूलित जांच ऊंचाई के साथ प्रवाह दर को समायोजित। सुनिश्चित करें ऊतक सतह पर कोई विलायक प्रसार है कि वहाँ (यानी, प्रवाह की दर बहुत अधिक है) या नैनो ईएसआई emitter (यानी, प्रवाह की दर बहुत कम है) के अंदर बुलबुला गठन।

एकल जांच bioanalysis के लिए एक multifunctional डिवाइस है। एमएसआई के प्रयोगों के अलावा, यह वास्तविक समय में सीटू एस सी एम एस लाइव कोशिकाओं 16 से विस्तृत रासायनिक जानकारी है, जो एक बड़ा फायदा है अन्य वैक्यूम के साथ तुलना में स्पष्ट करने के लिए निकट आयोजित करने में सक्षम है इस तरह के MALDI 10 और एस के रूप में आधारित एस सी एम एस तकनीक ( 21 (जैसे, dicationic यौगिकों) युक्त सॉल्वैंट्स एस सी एम एस प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है, और सेलुलर घटकों में से एक व्यापक रेंज से पहले से कहीं ज्यादा एक लाइव एकल कोशिका में पाया जा सकता है (चल रहे अनुसंधान, डेटा नहीं दिखाए जाते हैं)। हालांकि वास्तविक समय विश्लेषण झिल्ली और सेलुलर सामग्री की निकासी की सेल पैठ के कारण लाइव एकल कक्षों की रासायनिक प्रोफाइल, प्रदान करेगा, जांच के तहत सेल प्रयोग के बाद मार डाला जाएगा, जिसका अर्थ एकल जांच एस सी एम एस तकनीक अभी भी है कि एक विनाशकारी विधि। इसके अलावा, जांच टिप और एकल जांच में नैनो ईएसआई emitter आसानी से अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए भरा जा सकता है। डिवाइस clogging की संभावना को कम करने के लिए, जब एक सेल में एकल जांच टिप डालने नाभिक को छू से बचने के लिए सुनिश्चितएल। Clogging होता है, तो डिवाइस भरा जांच टिप या एक homebuilt हीटिंग का तार 16 का उपयोग emitter नैनो ईएसआई को हीटिंग द्वारा पुनर्जीवित किया जा सकता है। एकल जांच एस सी एम एस तकनीक का एक और सीमा यह है कि केवल चिपकने वाला कोशिकाओं (यानी, कोशिकाओं सतहों से जुड़े होते हैं) मौजूदा सेटअप का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है। हालांकि, एकल जांच एमएस तंत्र में सेल हेरफेर प्रणाली को शामिल करके, सेल के व्यापक प्रकार भविष्य में अध्ययन किया जा सकता है।

एमएसआई प्रयोग करने के लिए भी इसी तरह, एक उच्च गुणवत्ता जांच और एक अनुकूलित विलायक प्रवाह की दर प्राप्त करने एस सी एम एस के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। जब विलायक प्रवाह की दर ट्यूनिंग, एकल जांच टिप नमूना ऊपर रखा गया है (यानी, सेल या संस्कृति के माध्यम से कोई संपर्क नहीं), और यह सुनिश्चित जांच टिप या नैनो ईएसआई के अंदर बुलबुला गठन से कोई विलायक टपकता है कि वहाँ emitter।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Single-probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120’’ × 0.005” × 12” Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ  MBT-005-020-2Q
Micropipette laser puller  Sutter Instrument Co., Novato, CA  Model P-2000
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 110 µm Molex, Lisle, IL TSP040105
UV curing resin  Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA Item No. 006.030
LED UV lamp Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China LY-C240
Epoxy resin Devcon, Danvers, MA  Part No. 20945
Inline MicroFilter  IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL M-520
Microunion  IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL M-539
Microscope slide (glass) C & A Scientific - Premiere, Manassas, VA  9105
Syringe  Hamilton, Reno, NV 1725LTN 250UL
Mass spectrometer
LTQ Orbitrap Mass sprectrometer Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA  LTQ Orbitrap XL
Xcalibur 2.1 Software Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA  XCALIBUR21
Fance Stage Control Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA
MSI QuickView Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA
Contact closure device
USB-6009 Multifunction DAQ National Instruments, Austin, TX 779026-01
DR-5V SDS Relay Panasonic, Kadoma, Japan  DR-SDS-5
Logic Gates 50 Ohm Line Driver Texas Instruments, Dallas, TX  SN74128N
Single-probe setup
Motorized linear stage and controller (3 sets) Newport, Irvine, CA Conex-MFACC
Miniature XYZ stage Newport, Irvine, CA MT-XYZ 
Translation XY stage ThorLab, Newton, NJ PT1 and PT102
Thermo LTQ XL ion source interface flange New Objective, Woburn, MA  PV5500
Digital stereo microscope, 250X - 2,000X Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China Supereyes T004
USB Digital Photography Microscope  DX.com, HongKong, China S02 25~500X 
Syringe pump Chemyx Inc., Stafford, TX  Nexus 3000
Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" Thorlabs, Newton, NJ MB810
Flexible clamp holder Siskiyou, Grants Pass, OR   MXB-3h
Solvents
Methol  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 34860 Chromasolv
Water Sigma-Aldrich, St. Louis, MO W4502
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 34967 Chromasolv
Cell culture
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)  Cellgro, Manasas, VA 10-013-CV
10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Gibco/Life Technologies, Long Island, NY 10100-139
Penicillin/Streptomycin  Cellgro, Manasas, VA 30-002-CI
10 mM HEPES (pH 7.4)  Cellgro, Manasas, VA 25-060-CI
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Cellgro, Manasas, VA 46-013-CM
TrypLE Express  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  12604-013
12-well plates  Corning Inc., Corning, NY  Falcon 351143
T25 flask Corning Inc., Corning, NY  Falcon 3055
Micro Cover Glasses, Round, No. 1 VWR International, Radnor, PA  48380-046
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) VWR International, Radnor, PA  BDH1115-1LP
Tissue imaging
Cyro-Cut Microtome American Optical Coporation
Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT)  Sakura Finetek Inc., Torrance, CA 4583
Microscope slide (polycarbonate) Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL P11011P

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References

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