عزل وتوصيف من الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا حيوانية وجود الجذعية خصائص الخلية

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gilormini, M., Wozny, A. S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J. Vis. Exp. (111), e53958, doi:10.3791/53958 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

على الرغم من التقدم في فهم الرأس والعنق سرطان الخلايا الحرشفية (HNSCC) تقدم، يبقى معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات منخفضا بسبب تكرار المحلية والانبثاث البعيد. إحدى الفرضيات لتفسير هذا تكرار هي وجود سرطان خلايا شبيهة بخلايا المنشأ (الجذعية السرطانية) التي تقدم chemo- الكامنة والإذاعة المقاومة. من أجل وضع استراتيجيات علاجية جديدة، فمن الضروري أن يكون هناك نماذج التجريبية التي تحقق فعالية من العلاجات المستهدفة، وبالتالي لديها وسائل موثوق بها لتحديد وعزل الخلايا الجذعية السرطانية. تحقيقا لهذه الغاية، نقدم بروتوكول لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا HNSCC الإنسان أن يعتمد على مزيج من اثنين من sortings المتعاقبة الخلية التي يقوم بها مضان خلية تنشيط الفرز (FACS). ويستند أول واحد على الممتلكات الخلايا الجذعية السرطانية إلى بإفراط ATP-التجليد كاسيت (ABC) بروتينات نقل، وبالتالي استبعاد، من بين أمور أخرى، والأصباغ الحمض النووي الحيوية مثل هويشت 33342. الخلايا فرزها مع الويتم تحديد طريقة ك "سكان الجانب" (SP). كما تمثل الخلايا SP نسبة منخفضة (<5٪) من الخلايا الأبوية، في مرحلة النمو أمر ضروري من أجل زيادة عددهم قبل الفرز الخلية الثانية. الخطوة التالية تسمح لاختيار الخلايا التي تمتلك اثنين من الخصائص الخلايا الجذعية HNSCC أخرى أي مستوى التعبير عال من علامة سطح الخلية CD44 (CD44 عالية)، والإفراط في التعبير عن نازعة ألدهيد (عالية ALDH). لأن استخدام علامة واحدة لديها العديد من القيود والعثرات لعزل الخلايا الجذعية السرطانية، والجمع ليرة سورية، وCD44 وعلامات ALDH توفر أداة مفيدة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية لمزيد من المقايسات التحليلية وظيفية تتطلب خلايا قابلة للحياة. تم التحقق من صحة خصائص تشبه الجذعية الخلايا الجذعية السرطانية في نهاية المطاف في المختبر عن طريق تشكيل tumorispheres والتعبير عن β-كاتينين.

Introduction

الرأس والرقبة الخلايا الحرشفية سرطان (HNSCC) هي خباثة مشتركة في جميع أنحاء العالم، وعلى الرغم من التقدم في العلاجات الحالية، والمرضى الذين يعانون من مرض متقدم لها بسوء التشخيص. معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات الشامل للمريض حوالي 30٪ على الرغم من مزيج من الطرق العلاجية بما في ذلك الجراحة، العلاج الكيميائي، العلاج الإشعاعي والعلاجات المستهدفة. وتعزو الدراسات الحديثة تكرار المحلية والانبثاث البعيد لبقاء الخلايا السرطانية شبيهة بخلايا المنشأ (الجذعية السرطانية) بعد العلاجات المضادة للسرطان 1. وهناك أدلة تراكم دعم وجود خلايا تقديم الخلايا الجذعية خصائص (وضع غير متمايز، تجديد الذات والتمايز القدرات، والنشاط التيلوميراز) في الأورام الصلبة المختلفة بما في ذلك الثدي والدماغ والبروستاتا والرئة والقولون والبنكرياس والكبد والجلد 2- 10. ومع ذلك، فإن أصل الخلايا الجذعية السرطانية لا يزال من غير الواضح 11،12. ويمكن أن ينتج عن التحول السرطاني للخلايا الجذعية العادية 3،13 أو dedifferentiation من الخلايا السرطانية التي تحصل على ميزات الخلايا الجذعية السرطانية مثل 14،15. ولذلك، فهم مسارات مميزة تتعلق الخلايا الجذعية السرطانية ستوفر نظرة ثاقبة على تشخيص وعلاج HNSCC مقاومة في وقت مبكر.

وقد اقترح أن الخلايا الجذعية السرطانية تمتلك أيضا الظواهر مقاومة تتهرب من العلاج الكيماوي التقليدي والعلاج الإشعاعي، مما أدى إلى انتكاس الورم مقارنة مع الجزء الأكبر من الخلايا السرطانية 16-19 وتكون مترجمة إلى نقص الأوكسجين الكوات 20. وقد اقترحت عدة عوامل لتفسير هذه المقاومة الخلايا الجذعية السرطانية، مثل الميل إلى السكون، وتعزيز إصلاح الحمض النووي، وآليات الرقابة دورة الخلية يصل التنظيم، والكسح الجذور الحرة 21. وعلاوة على ذلك، العديد من المسارات الجزيئية أنكجنيك قد يتم تفعيلها على وجه التحديد في الخلايا الجذعية السرطانية 17. من أجل تحسين المعرفة الخلايا الجذعية السرطانية مقابل العلاجات المستهدفة أبعد من ذلك، نحن بحاجة الى طرق يمكن الاعتماد عليها لتحديد وعزل الخلايا الجذعية السرطانية، وذلك بسبب عدم تجانس علامات ذات الصلة الخلايا الجذعية فيأنواع مختلفة من السرطانات 22.

في HNSCC، وقف مثل تم عزلها الخلايا السرطانية بدء من أورام المريض الأساسي عن طريق فرز الخلايا معربا عن المؤشرات الحيوية CSC مختلفة (مثل هروب رأس المال المخدرات النقل التعبير 23، CD44 عالية، CD24 CD133 ارتفاع منخفض، ج-الأرصاد + النمط الظاهري 10،24، 25، أو ALDH ارتفاع النشاط 26) أو زراعة ورم المريض الأساسي لتشكيل squamospheres التي لها خصائص ديوان الخدمة المدنية. ومع ذلك، فإن عددا من squamospheres يقلل بشكل كبير بعد اثنين من الممرات، مما يعطي حجم العينة صغير لمزيد من التوصيف يدرس 27. لذلك، فحوصات في المختبر بدءا من خطوط الخلايا راسخة هو الحل الأسهل لتصميم التجارب من أجل تحسين المعرفة الخلايا الجذعية السرطانية.

والهدف من هذه المقالة هو اقتراح طريقة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا HNSCC باستخدام multiparametric تدفق cytometric التحليلالثانية خلية الفرز. التعبير عن CD44 في علاقة مع العديد من الخصائص الخلايا الجذعية السرطانية بما في ذلك النشاط ALDH، وتستخدم جانب السكان (SP) النمط الظاهري، والقدرة تشكيل كروي وtumorigenicity لعزل وتوصيف هذا شبه السكان الخلايا الجذعية السرطانية. CD44، وهو بروتين سكري سطح الخلية، وتشارك في التصاق الخلية والهجرة. وأعرب عن CD44 للغاية في كثير من الأورام الصلبة الخلايا الجذعية السرطانية 28، بما في ذلك سرطان الرأس والعنق نماذج 29-31. وعلاوة على ذلك، يمكن CD44 الخلايا عالية تولد في الجسم الحي الورم غير المتجانسة في حين الخلايا منخفضة CD44 لا يمكن 10. ويستند مقايسة SP على إمكانات التفاضلية من الخلايا لهروب رأس المال الصبغة هويشت 22 عن طريق الأسرة كاسيت ملزمة ATP (ABC) من البروتينات نقل overexpressed داخل غشاء ديوان الخدمة المدنية. ويشمل هذا الاختبار استخدام مثبطات نقل ABC مثل فيراباميل في عينات السيطرة. ألدهيد نازعة (ALDH) هو انزيم الخلايا التي تشارك في تحويل الريتينول إلى المتقاعدحمض inoic خلال الجذعية في وقت مبكر تمايز الخلايا 25،26. الخلايا التي تظهر ارتفاع ALDH عرض النشاط سلوك الخلية مثل الجذعية في HNSCC 26 وعدد قليل جدا من خلايا عالية ALDH قادرة على توليد أورام في الجسم الحي 26،32.

تم استخدام مزيج من هذه العلامات والخصائص بنجاح من قبل برتراند ه ر ال. لدراسة المقاومة في التجارب المختبرية والحية من هذه الخلايا الجذعية السرطانية إلى الفوتون والإشعاع 19 أيون الكربون. وأظهرت نتائجها بوضوح أن الجمع بين مختلف علامات الخلية وخصائص أكثر انتقائية للدراسات مفيدة على السكان HNSCC الخلايا الجذعية السرطانية من النهج علامة واحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية على رعاية الحيوان. تمت الموافقة على جميع تفاصيل هذه الدراسة من قبل CECCAPP، لجنة الأخلاق الفرنسية.

1. اختيار من السكان الجانب (SP) من قبل هويشت صبغ الدفق الفحص

  1. تلطيخ 50 مليون الخلايا مع هويشت 33342 صبغ.
    1. إعداد اثنين من 15 مل أنابيب معقمة مع قاع مخروطي الشكل: أنبوب واحد المسمى "هويشت" واحد المسمى "هويشت وفيراباميل". إعداد 10 مل من 5 ملي فيراباميل حل هيدروكلوريد في الماء المعقم. إعداد مستنبت (CM) للخلايا الجذعية.
      1. لإعداد CM لديوان الخدمة المدنية (CM-CSC)، والجمع بين ما يلي: Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM): F12 (1: 3، ت: ت)، و 5٪ من مصل العجل الجنين (FCS)، 0.04 ملغ / لتر من الهيدروكورتيزون و 100 U / مل من البنسلين، 0.1 غرام / لتر من الستربتومايسين، و 20 ميكروغرام / لتر من عامل نمو البشرة (EGFR).
    2. تحت غطاء تدفق الصفحي، ويعرض للتريبسين الخلايا. إزالة وسائل الاعلام، ويغسل مع الصورةterile الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA (0.5 جم / لتر) لقارورة 75 سم مربع. احتضان 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. وقف رد فعل عن طريق إضافة مستنبت المستخدمة في خط الخلية الوالدية. حساب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلية.
      1. لإعداد CM عن خط الخلية الوالدية (CM-P)، تكملة DMEM مع 10٪ FCS، 0.4 ملغم / لتر من الهيدروكورتيزون، 100 U / مل من البنسلين و 0.1 غرام / لتر من الستربتومايسين).
    3. تمييع تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.1.2 للحصول على 10 7 خلية / مل في CM-P. تقسيم تعليق خلية في أنابيب 2 إعداد: وضع 100 ميكرولتر (10 6 خلايا) في الأنبوب "هويشت وفيراباميل" و 4 مل (4 × 10 7 الخلايا) في أنبوب "هويشت".
    4. في عينة "هويشت وفيراباميل"، إضافة 10 ميكرولتر من 5 ملم فيراباميل هيدروكلوريد الحل (تركيز النهائي: 0.5 ملم) وتخلط بلطف. إضافة 5 ميكرولتر من 1 غرام / حل L هويشت (تركيز النهائي: 0.1 جم / لتر). في عينة & #34؛ هويشت "، إضافة 5 ميكرولتر من 1 غرام / لتر الحل لكل 10 6 خلايا (200 ميكرولتر الكل) هويشت من الآن فصاعدا، والحفاظ على عينات الحماية من التعرض للضوء المباشر باستخدام رقائق الألومنيوم.
    5. احتضان جميع الأنابيب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة. المزيج بلطف كل 15 دقيقة لمنع الخلايا من يستقر.
    6. أنابيب الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend كل بيليه مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
    7. أنابيب الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. و resuspend "هويشت وفيراباميل" بيليه في 500 ميكرولتر من 5 ملغم / لتر يوديد propidium (PI) المخفف في برنامج تلفزيوني العازلة و"هويشت" بيليه في 4 مل من 5 ملغ / لتر PI مخففة في العازلة في برنامج تلفزيوني.
    8. نقل الحلول العينة من خلال مصفاة 70 ميكرومتر خلية لإزالة الركام وجمع الخلايا وحيدة في أنابيب لامتصاص العينة على تدفق عداد الكريات. الاحتفاظ بعينات على الجليد وحماية من التعرض للضوء المباشر باستخدام رقائق الألومنيوم.
  2. أناتحلول من سكان جانبية باستثناء هويشت صبغ من قبل الفرز الخلية.
    1. أداء هويشت فصل الخلية سلبي على التدفق الخلوي فارز مع المعلمات التالية: ليزر الأشعة فوق البنفسجية (355 نانومتر)، 2 كاشفات على مسار الأشعة فوق البنفسجية ليزر مع هويشت الأزرق (450/50 BP) والأحمر هويشت (610/20 BP) مرشحات، و 2 جامعي.
      1. أولا، تحليل عينة "هويشت" التي هي بمثابة مراقبة إيجابية لتلطيخ وتدفق عداد الكريات انشاء.
      2. باستخدام برنامج الكريات، في إطار "ورقة عمل العالمي"، انقر على "مؤامرة نقطة" (الخامسة أعلى الصورة اليمنى) وإنشاء تخطيط في ورقة العمل العالمية. على تنسيق، مع النقر بالزر الأيمن، حدد FSC-A (مبعثر إلى الأمام) وعلى الإحداثي السيني، SSC-A (الجانب مبعثر) (الشكل 1A). في نفس الطريق، وإنشاء SSC-W مقابل SCC-H مؤامرة نقطة. في هذه مؤامرة نقطة الثانية، لإنشاء منطقة P1، انقر فوق "بوليجون بوابة" (الرابع عشر أعلى الصورة اليمنى) (الشكل 1B) 33.
        ملاحظة: إن المنطقة P1تشمل الخلايا واحد وتميز الحلل.
      3. اختياري: استبعاد PI خلايا إيجابية من خلال خلق FSC-A مقابل PI بوابات على P1. في هذه النقطة المؤامرة، حدد PI سلبي للسكان (P2) لاستبعاد PI الخلايا الميتة إيجابية.
      4. باستخدام برنامج الكريات، في إطار "ورقة عمل العالمي"، انقر على "مؤامرة نقطة" وإنشاء مخطط في ورقة العمل العالمية. على تنسيق، مع النقر بالزر الأيمن، حدد الأزرق هويشت-A وعلى الإحداثي السيني، أحمر هويشت-A. مع الحق في الضغط على السكان، حدد "إظهار السكان" و P1. في هذه مؤامرة نقطة، وخلق منطقة (P2) لتحديد الخلايا سلبي هويشت السكان الجانب صبغ (SP) الذي يظهر على شكل ذراع الجانب على الجانب الأيسر من السكان الرئيسي من الخلايا (الشكل 1C).
    2. تحليل العينة "هويشت" وجمع 10،000 الأحداث. للتأكد من أن P2 البوابة، التي تمثل السكان ليرة سورية، في وضع جيد، وتحليل عينة "هويشت وفيراباميل" (10000 الأحداث)لمراقبة اختفاء السكان SP (1D الشكل).
    3. جمع الخلايا السلبية SP هويشت صبغ في أنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من CM-CSC أعد 1.1.1.1.
    4. في نهاية الفرز الخلية، الطرد المركزي تعليق خلية في 250 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف و resuspend بيليه مع 1 مل من CM-CSC. حساب عدد الخلايا فرزها باستخدام عداد الخلايا ونقل العدد المناسب من الخلايا إلى قارورة الثقافة (انظر الجدول 1). إضافة CM-CSC واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
    5. الحفاظ على الخلايا في الثقافة تحت نفس الظروف لمدة أقصاها 2 الممرات حتى يكون هناك ما لا يقل عن 5 × 10 7 خلايا (راجع الخطوة 3، "طريقة خلية ثقافة").

2. اختيار من CD44 عالية / ALDH عالية الفرعية السكان في مجال السكان التصنيف الجانبية لل

  1. تلطيخ 50 مليون من خلايا ليرة سورية مع كشف ALDH كيت وCD44 الجسم المضاد.
    1. إعداد سبعة 15 مل أنابيب معقمة وصفت على النحو التالي: "غير ملوثين" (أنبوب أ)، "CD44-APC" (أنبوب ب)، "IgG1-APC" (أنبوب ج)، "ALDH" (أنبوب د)، "ALDH وDEAB "(أنبوب ه)،" ALDH وCD44-APC "(أنبوب و)،" ALDH، DEAB وCD44-APC "(أنبوب ز). منع جميع الأنابيب والكواشف في 4 درجات مئوية خلال تلطيخ.
    2. إعداد عازلة مع 4.5 مل من العازلة 1 (الواردة في المجموعة) و 45 ميكرولتر من-APC CD44 (Allophycocyanin) الأجسام المضادة (التخفيف 1: 100). إعداد B العازلة مع 100 ميكرولتر من العازلة 1 و 1 ميكرولتر من IgG1-APC الأجسام المضادة (التخفيف 1: 100). إعداد عازلة C مع 4 مل من العازلة 1 و 20 ميكرولتر من كاشف لعدة.
    3. إعداد تعليق خلية من الخلايا مرتبة سابقا (الخطوة 1.2.5) في 10 7 خلية / مل. إضافة 100 ميكرولتر (10 6 خلايا) من خلية إلى تعليق أنابيب أ، ب، ج، و 4 مل (4 × 10 7 خلايا) لأنبوب و. لحظة لا تترك الخلايا في أنابيب د، ه) و (ز.
    4. أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على الخلايا في 250 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف و resuspend الكريات في أنابيب أ، ب، ج في 100 ميكرولتر من العازلة 1. إضافة 5 ميكرولتر من diethylaminobenzaldehyde (DEAB)، مثبط ALDH لأنابيب الإلكترونية وز.
      1. Resuspend الخلايا في الأنبوب و مع 4 مل كاشف C وعلى الفور نقل 100 ميكرولتر في أنابيب د، ه) و (ز. احتضان جميع الأنابيب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وحماية من التعرض للضوء المباشر باستخدام رقائق الألومنيوم. مزيج تعليق خلية بلطف قبل vortexing بعد 15 دقيقة لمنع الخلايا من تسوية.
    5. من هذه اللحظة، والحفاظ على أنابيب على الجليد وحمايتها من التعرض للضوء المباشر باستخدام رقائق الألومنيوم. الطرد المركزي جميع الأنابيب في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف.
    6. أنبوب و resuspend و في 4 مل والأنابيب و (ز) مع 100 ميكرولتر من العازلة ألف و resuspend أنبوب ج مع 100 ميكرولتر من العازلة B. لأنابيب أخرى، إضافة 100 ميكرولتر من العازلة 1. احتضان 10 دقيقة على 4 درجات؛ ج.
    7. الطرد المركزي جميع الأنابيب في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف. شطف مرة واحدة مع 1 مل من العازلة 1 (4 مل لأنبوب و) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. اعادة تعليق أنبوب و بيليه في 4 مل وجميع أنابيب أخرى في 1 مل من العازلة 1.
    8. نقل الحلول من خلال عينة 70 مصافى خلية ميكرون لإزالة الركام وجمع الخلايا وحيدة في أنابيب المناسبة لامتصاص العينة على تدفق عداد الكريات.
  2. عزل CD44 عالية ALDH السكان / ارتفاع الخلية بواسطة الإسفار المنشط الفرز الخلية.
    1. أداء CD44 عالية / ALDH خلية عالية فرز على التدفق الخلوي فارز مع المعلمات التالية: الليزر الأزرق (488 نانومتر) والليزر الأحمر (633 نانومتر) (1)، للكشف على طريق الليزر الأزرق مع فلتر FITC (530/30) (1)، كاشف على طريق الليزر الأحمر مع مرشح APC (660/20) و 2 جامعي.
    2. باستخدام برنامج الكريات، انقر على "دوت منظمة التحرير الفلسطينيةر "(خامس أعلى الصورة اليمنى) لإنشاء FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة نقطة كما هو موضح في قسم 1.2.1.2، للتحقق مورفولوجيا الخلايا وحدد السكان يتألف من خلايا وحيدة مع SSC-W مقابل SSC-H نوع من الرسم البيانى الأحصائى.
    3. باستخدام برنامج الكريات، في إطار "ورقة عمل العالمي"، انقر على "مؤامرة نقطة" وإنشاء مخطط في ورقة العمل العالمية. على تنسيق، مع النقر بالزر الأيمن، حدد APC-A وعلى الإحداثي السيني، FITC-A من أجل تحديد السكان الملون مزدوج. إنشاء بوابة باستخدام أنابيب d و e لتحديد الخلايا عالية ALDH (الشكل 2A). ملاحظة: خلايا الإيجابية تختفي في أنبوب البريد تعامل مع DEAB (الشكل 2B).
      1. على نفس الرسم البياني، إنشاء بوابة ثانية باستخدام أنابيب ب و ج من أجل تحديد خلايا عالية CD44 (الشكل 2C و 2D). تختفي خلايا إيجابية في أنبوب يحتوي على IgG1-APC. تحليل أنابيب f و g وإنشاء بوابة الثالثة التي تضم CD44 عالية / ALDH <سوب> خلايا عالية (الشكل 2E و2F).
        ملاحظة: إذا خلايا إيجابية موجودة في أنبوب يحتوي على IgG1-APC (الشكل 2D)، والتفاعل بين الخلايا والأجسام المضادة الملون APC-ليست محددة.
    4. جمع CD44 عالية / ALDH خلايا عالية في أنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من CM-CSC. جمع أيضا انخفاض CD44 / ALDH أدنى مستوى في أنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من CM 19. ملاحظة: إعداد CM-CSC كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.1.
    5. الطرد المركزي تعليق خلية في 250 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف و resuspend بيليه مع 1 مل من CM-CSC. حساب عدد الخلايا فرزها.

3. خلية أسلوب ثقافة

  1. بعد المزدوج فرز الخلايا كما هو موضح أعلاه، لوحة الخلايا التي تم فرزها في ثقافة قارورة المناسبة (الجدول 1) مع CM-CSC عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. بعد 18-24 ساعة،معرفة ما اذا انضمت الخلايا وتغيير ثقافة المتوسط. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل 3 أيام حتى المستعمرات توسيع أكبر من 50٪ متموجة.
  2. استخدام حجم مناسب من التربسين 0.5 غرام / لتر - EDTA (الجدول 1) يعرض للتريبسين الخلايا من قارورة الثقافة. احتضان خلايا 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة حجم مناسب من CM-CSC (الجدول 1) إلى وقف عمل التربسين.
  3. حساب عدد الخلايا التي تم الحصول عليها ولوحة 4 × 10 5 خلايا في قارورة الثقافة 175 سم ² مع CM-CSC. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. في هذا التركيز، فإن الخلايا مع مضاعفة زمن قدره 24 ساعة يكون 70٪ متكدسة في 7 أيام.
  4. استخدام الخلايا الجذعية السرطانية لفي المختبر أو في التجارب المجراة قبل أن خضعت 3 الممرات.

4. التأكيد على إمكانية ورم وخصائص CSC

  1. ورم المجال تشكيل لتأكيد إمكانية ورم من CD44 عالية / ALDHخلايا عالية.
    1. يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في 3.2. إضافة 1 × 10 6 خلايا لأنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه في DMEM: F12 (3: 1) FCS المتوسطة مجانا، 20 نانوغرام / مل من rhEGF، 4 ملغم / لتر من الهيبارين و1X B27. احتضان الخلايا في 6 المنخفضة جيدا لوحات مرسى الثقافة قارورة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
      ملاحظة: استخدام DMEM: F12 (3: 1) متوسطة تحتوي على 5٪ من FCS، 20 نانوغرام / مل من rhEGF، 4 ملغم / لتر من الهيبارين و1X B27 إذا كانت الخلية التي لا تنمو دون FCS.
    2. مراقبة تشكيل الورم المجال مع المجهر الضوئي 4-10 أيام بعد البذر (الشكل 3A).
      ملاحظة: يجب أن تكون ورم المجال قطرها أكثر من 35 ميكرون. سوف CD44 عالية ALDH خلية / عالية تظهر تكوين المجال بشكل أسرع وأكثر المحسنة الورم من حيث العدد والحجم بالمقارنة مع CD44 منخفض منخفض / ALDH.
  2. تقييم في فيفو Tumorigenicity بعدحقن تحت الجلد CD44 ارتفاع الخلايا عالية / ALDH في الفئران-NOD SCID.
    1. بعد الفرز، وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني في ثلاثة تركيزات مختلفة (10 4 خلية / مل، 10 5 خلية / مل، و 10 6 خلية / مل). حقن تحت الجلد 100 ميكرولتر من 10 4 خلية / مل (10 3 خلايا) في منطقة الجهة اليمنى من 6 الفئران. تفعل الشيء نفسه لمدة 10 5 خلية / مل (10 4 خلايا)، و 10 6 خلية / مل (10 5 خلايا).
      ملاحظة: تخفيف أقل مما يمكن اختبار 10 3 خلايا.
    2. حقن نفس التركيز من CD44 الخلايا منخفضة منخفضة / ALDH في منطقة الجناح الأيسر. رصد حقن الفئران لمدة تصل إلى 10 أسبوعا لمعرفة تطور الورم 19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا HNSCC المطلوبة اثنين الفرز على التوالي بسبب نسبة ضئيلة جدا من الخلايا الجذعية السرطانية في خط الخلية الوالدية. واستند الفرز الأول على قدرة الخلايا الجذعية السرطانية لاستبعاد الصبغة هويشت يرجع إلى النقل هروب رأس المال المخدرات. وأدى ذلك إلى الحصول على 1-5٪ من مجموع السكان خلية مرتبة (الشكل 1). خلال هويشت صبغ الخلايا السلبية الفرز، والتحقق من حجم وتحبيب الخلايا مرتبة من خلال النظر في FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة نقطة (الشكل 1A). ثم، تميز الحلل والخلايا شظايا باستخدام SSC-W مقابل SSC-H مؤامرة نقطة واختيار P1 السكان (الشكل 1B). على هذه الفئة من السكان P1، إنشاء هويشت الأحمر-A مقابل هويشت بلو مؤامرة نقطة. مع أنبوب المسمى "هويشت"، يظهر SP باعتباره الذراع الجانب على الناحية اليسرى من الخلايا السكان الرئيسي (الشكل 1C). يجب أن تختفي هذه الفئة من السكان عندما عالبريد تعامل مع فيراباميل (1D الشكل)، المانع من نقل اي بي سي. تلطيخ PI يسمح استبعاد الخلايا الميتة-PI إيجابي لهذه الفئة من السكان تحت النطاق على هويشت الأحمر مقياس (الشكل 1C و1D، الحذف الزرقاء).

واستند الفرز الخلية الثانية على التعبير عالية من مستقبلات وALDH ارتفاع نشاط انزيم CD44 الذي سمح للشراء 0.5-2٪ من الخلايا SP مرتبة سابقا (الشكل 2). قبل الفرز، واستخدمت الضوابط المختلفة. أول تلك هي "ALDH" و "ALDH + DEAB" الأنابيب اللازمة لوضع البوابة الأولى على خلايا عالية FITC (أرقام 2A و 2B): تم بوابات الخلايا عالية ALDH على FITC-A مقابل APC-A نقطة مؤامرة باستخدام "ALDH" أنبوب (الشكل 2A). وقد دققت في وضع جيد من البوابة باستخدام "محددة المدةH + DEAB "أنبوب:.. كما يمنع DEAB ALDH، يجب أن خلايا إيجابية تختفي من بوابة (الشكل 2B) إذا لم يفعلوا ذلك، تغيير ظروف التفاعل (عن طريق زيادة كمية DEAB على سبيل المثال) والسيطرة الثانية هي" CD44-APC "و" IgG1-APC "الأنابيب التي سمحت لوضع البوابة الثانية على الخلايا عالية APC (أرقام 2C و 2D) باستخدام الخلايا ملطخة الأجسام المضادة CD44-APC (الشكل 2C). يجب أن تختفي هذه الفئة من السكان مع أنبوب السيطرة التي تحتوي خلايا IgG1-APC (الشكل 2D). إذا لم يحدث ذلك، فإن السندات مع الأجسام المضادة ليست محددة وBSA ينبغي أن تضاف 0.5٪ إلى عازلة 1 من عدة كشف ALDH خلال رد فعل الأجسام المضادة. وأخيرا، والثالث السيطرة يتعلق "ALDH وCD44-APC" أنبوب و"ALDH، DEAB وCD44-APC" أنابيب (أرقام 2E، 2F، 2G و 2H)، وستا مزدوجيستخدم ining ALDH أنبوب / CD44 لوضع بوابة الماضية على خلايا مزدوجة إيجابية (الشكل 2E) ونفس أنبوب تعامل مع DEAB هو السيطرة للتحقق من أن ALDH خلايا عالية تختفي (الشكل 2F).

يستخدم هذا البروتوكول لفرز الخلايا الجذعية السرطانية من SQ20B وخطوط الخلايا FaDu. عندما يتم الفرز للمرة الأولى على خط الخلايا الجديدة، وذلك للتأكد من أن الخلايا التي تم فرزها لديها خلايا شبيهة بخلايا المنشأ الخصائص، فمن الضروري لتأكيد إمكانية الورم. واحد من خاصية الخلية مثل الجذعية هي قدرتها على تشكيل tumorspheres في المختبر في وسط الحرة FSC. تحت هذا الشرط، يمكن خلايا السرطان فقط مثل الجذعية البقاء على قيد الحياة وتتكاثر (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، تشير التجارب QPCR تعبير عالية من β-كاتينين (علامة من الخصائص مثل الجذعية) في CD44 ارتفاع الخلايا / ALDH عالية (الشكل 3B)، وكذلك مؤشر كتلة الجسم (1) والشق 19 </ سوب>. وأخيرا، CD44 عالية / ALDH خلايا عالية هي أيضا قادرة على تشكيل الأورام عندما تم حقنها بكميات منخفضة بالمقارنة مع CD44 منخفض / ALDH خلايا منخفضة 19.

الشكل 1
الشكل 1: عزل السكان الجانب استبعاد الصبغة هويشت (A) FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة نقطة. (ب) SSC-W مقابل SSC-H مؤامرة نقطة. (C، D) هويشت الأحمر-A مقابل هويشت الأزرق-A مؤامرة نقطة باستخدام "هويشت" أنبوب (C) أو مع أنبوب "هويشت وفيراباميل" (D). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: لذلك rting من CD44 عالية ALDH خلية / عالية من الخلايا السلبية هويشت صبغ. FITC-A مقابل APC-A مؤامرة نقطة باستخدام "ALDH" أنبوب (A)، و "ALDH + DEAB" أنبوب (ب)، و "CD44-APC" أنبوب (C)، و "IgG1-APC" أنبوب (D)، و "ALDH وCD44-APC" أنبوب (E و G) أو أنبوب "ALDH، DEAB وCD44-APC" (F و H). الأرقام A، تم الحصول عليها B، C، D، E و F باستخدام خط خلية SQ20B. الأرقام G و H تم الحصول عليها باستخدام خط الخلية FaDu. الأخضر يشير CD44 منخفض / ALDH خلايا منخفضة (Q3)؛ الأزرق الداكن يشير CD44 منخفض / ALDH خلايا عالية (Q1)؛ الأرجواني يشير CD44 عالية / ALDH خلايا منخفضة (Q4)؛ اللون الأزرق الفاتح يشير CD44 عالية / ALDH خلايا عالية (Q2)._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
وكان تأكيد من إمكانات الورم من CD44 ارتفاع الخلايا عالية / ALDH التصنيف CD44 ارتفاع الخلايا عالية / ALDH قادرة على تشكيل tumorspheres في المختبر (A) في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى السفح: الرقم 3. شريط النطاق، 25 ميكرون. وعلاوة على ذلك، CD44 عالية / ALDH عالية بإفراط β-كاتينين، علامة tumorigenicity (B). وقد تم تنفيذ هذا تقدير من قبل QPCR وأشرطة الخطأ تمثل SD. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

عدد الخلايافرز ثقافة نوع قارورة حجم التربسين (مل) ثقافة متوسطة الحجم (مل)
10،000-200،000 1 بئر من لوحة 6 جيدا أو 3.5 سم طبق بتري 0.5 2
200،000-1،000،000 قارورة ثقافة T25 1 1 4
> 1000000 قارورة ثقافة T75 1 2 10

الجدول 1: الثقافة نوع قارورة لاستخدام وفقا لعدد من الخلايا مرتبة تفاصيل عن حجم الثقافة قارورة لالعدد التقريبي للخلايا فرز تعطى. كما يتم توفير حجم التربسين وحجم المتوسطة المطلوبة لنوع الثقافة قارورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول وسيلة يمكن الاعتماد عليها لعزل الخلايا الجذعية السرطانية ناجحة من خط خلية معينة أن تنطبق على خطوط الخلايا HNSCC أخرى. معزولة الخلايا الجذعية السرطانية في الرأس والرقبة ثم يتم مناسبة لمزيد من التوصيف الجزيئي في المختبر، والتحقق من صحة وظيفية من قبل زرعها في الفئران العوز المناعي (19). ومع ذلك، يمكن اختبار بعض التعديلات تبعا لعدد السكان الجانب أو CD44 عالية / ALDH نسب عالية موجودة في خط الخلية الوالدية. على سبيل المثال، إذا كانت النسبة المئوية للخلايا في عدد السكان الجانب منخفضة جدا في خط خلية معينة، وCD44 عالية / ALDH الفرز عالية لا يمكن أن يؤديها مباشرة. قد يتم استبدال علامات المستخدمة في هذه الدراسة من قبل علامات الأخرى الملائمة لخط الخلية درس مثل CD133 ارتفاع 34 أو CD10 ارتفاع 35.

ويستند هذا البروتوكول على اثنين من sortings الخلية. وكان ثلاثة فرز الألوان مع SP + CD44 + ALDH غير ممكنه مع خطوط الخلايا التي تم اختبارها. أولا، خطوط الخلايا الأبوية اختبار هنا الحاضر أقل من 5٪ ليرة سورية، وأقل من 10٪ CD44 عالية / ALDH خلايا عالية في SP. لذلك، SP / CD44 عالية / ALDH تمثل أعلى مستوى أقل من 0.5٪ من خط الخلية الوالدية. ومن ثم، فإن أول الفرز SP ضروري من أجل إثراء السكان في CD44 الخلايا عالية عالية و / أو ALDH. ثانيا، لفرز 1٪ من خط الخلية الوالدين، فإنه يأخذ 5 ساعة للحصول على ما يقرب من 300،000 الخلايا. لذلك، إذا تم الاضطلاع فرز الخلايا 3 اللون، وكمية من الخلايا التي تم جمعها سوف تكون منخفضة للغاية. وعلاوة على ذلك، تعد الفرز ليس الموصى بها لأنها قد تؤثر على بقاء الخلية.

بسبب الانتقائية من هذا البروتوكول العزلة، والقيد الرئيسي هو عدد صغير من الخلايا الجذعية السرطانية التي تم الحصول عليها. هذا يمكن أن يكون مشكلة لأداء المزيد من التجارب، لأنه لا ينصح باستخدامها بعد 3 الممرات بسبب فقدان سريع لCD44 و Aعلامات LDH. وعلاوة على ذلك، قبل كل تجربة جديدة، وينبغي اختبار نسبة CD44 عالية / ALDH خلايا عالية لا تزال موجودة في تعليق خلية من أجل التحقق من عدد الخلايا الجذعية السرطانية التي متباينة.

لا بد من إعداد فيراباميل حل هيدروكلوريد والمتوسطة الثقافة التي تحتوي على EGF فقط قبل استخدامها لأن هذه الجزيئات غير مستقرة جدا. حل سهم EGF في 20 ملغم / لتر هو ثابت لمدة ثلاثة أشهر في -20 درجة مئوية. الاختلافات في بروتوكول هويشت موجودة، ولكن تركيز الصبغة النهائية شيوعا هو 5 ميكروغرام / مل. وعلاوة على ذلك، خلال الفرز الأول، ينبغي اختبار مختلف وسائل الاعلام تركيبة ثقافة وفقا لخط الخلايا المستخدمة. مرة واحدة يتم التحقق من صحة شروط الفرز، فمن الضروري للتحقق من خصائص السكان الخلية فرزها باستخدام أساليب مختلفة (القسم 4).

علامات سطح الخلية، والنشاط ALDH والقدرة على هروب رأس المال الأصباغ الحيوية قد استخدمت بالفعل individuaLLY في الأدب لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من HNSCC. ومع ذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا لديه ميزة فريدة من نوعها باستخدام مزيج من علامات مختلفة من أجل تحقيق نوعية عالية في الخلايا الجذعية السرطانية بمعزل عن خطوط الخلايا HNSCC. وعلاوة على ذلك، فإن CD44 الفرز يمكن أن تتحقق مع الأجسام المضادة لمكافحة CD44 مترافق مع الخرز الصغير المغناطيسية وفرزها مع عمود المغناطيسي 36، ولكن هذا الأسلوب لا ينطبق إلا على علامات سطح الخلية والتي لا يمكن استخدامها لفرز ALDH، ومنع الفرز مزدوج . طريقة أخرى تستخدم للحصول على الخلايا الجذعية السرطانية هي ثقافة tumorsphere من الأورام الأولية 37 أو xenografts 38. ومع ذلك، وترتبط عملية الاستحواذ هذه الأورام الأولية أو xenografts مع القيود الأخلاقية.

منذ هذه الطريقة على عزل الخلايا الجذعية السرطانية HNSCC قابلة للحياة، ويمكن استخدامها (بعد التحقق tumorigenicity بهم) في عدد من التجارب لقياس وظيفة فسيولوجية من هذه الخلايا. وبالتالي فإنه يسمح تقييم السلوكالخلايا الجذعية السرطانية التالية مقاربات مختلفة العلاجية (العلاج الإشعاعي، والعلاج الكيميائي). كما يسمح للدراسة مختلف العوامل البيولوجية مثل الهجرة / الغزو، وإصلاح الحمض النووي، مما يشير الخليوي، الخ. وبالتالي، والحصول على الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا المختلفة يعد اختيارا جذابا للتحقيق في الخلايا الجذعية السرطانية خصائص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Calf Serum Gold GE Healthcare A15-151
Hydrocortisone water soluble Sigma-Aldrich H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100x Dominique Dutscher L0022-100
DMEM Gibco 61965-026
F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I Gibco 31765-027
EGF Promega G5021 The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin StemcellTM Technologies 7980
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A Gibco 12587-010
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich 14533 Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride Sigma-Aldrich V-4629 Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4170 Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit Stem Cell 1700
CD44-APC, human antibody Miltenyi Biotech 130-095-177
IgG1-APC, human antibody Miltenyi Biotech 130-093-189
Z1 coulter particle Beckman Coulter 6605698
Optical microscope Olympus  CKX31
SQ20B cell line Gift from the John Little’s Laboratory -
FaDu cell line ATCC HTB-43
Low anchorage plates Thermo Fischer Scientific 145383
BD FACSDiva software v8.0.1 BD Biosciences -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8, (7), 545-554 (2008).
  2. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100, (7), 3983-3988 (2003).
  3. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, (7015), 396-401 (2004).
  4. Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65, (23), 10946-10951 (2005).
  5. Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15, (3), 504-514 (2008).
  6. Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104, (24), 10158-10163 (2007).
  7. Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1, (3), 313-323 (2007).
  8. Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, (2), 153-166 (2008).
  9. Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65, (20), 9328-9337 (2005).
  10. Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104, (3), 973-978 (2007).
  11. Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66, (19), 9339-9344 (2006).
  12. Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32, (3), 425-440 (2011).
  13. Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7, (3), 403-417 (2010).
  14. Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, (36), 13427-13432 (2008).
  15. Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43, (4), 175-181 (2005).
  16. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444, (7120), 756-760 (2006).
  17. Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
  18. Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322, (2), 139-147 (2012).
  19. Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10, (1), 114-126 (2013).
  20. Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26, (7), 1818-1830 (2008).
  21. Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458, (7239), 780-783 (2009).
  22. Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
  23. Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277, (2), 227-234 (2009).
  24. Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289, (2), 151-160 (2010).
  25. Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129, (10), 2337-2348 (2011).
  26. Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385, (3), 307-313 (2009).
  27. Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47, (2), 83-91 (2011).
  28. Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14, (2), 163-176 (2000).
  29. Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70, (23), 9969-9978 (2010).
  30. Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33, (2), 208-215 (2011).
  31. Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9, (11), 2879-2892 (2010).
  32. Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32, (9), 1195-1201 (2010).
  33. Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. BD Biosciences. (2012).
  34. Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117, (3), 455-460 (2007).
  35. Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111, (3), 506-514 (2014).
  36. Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133, (11), 1219-1226 (2013).
  37. Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12, (22), 3407-3415 (2012).
  38. Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4, (5), 792-801 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics