अलगाव और एक सिर और गर्दन के स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा उप-जनसंख्या के बाद स्टेम सेल के लक्षण की विशेषता

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Gilormini, M., Wozny, A. S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J. Vis. Exp. (111), e53958, doi:10.3791/53958 (2016).

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Abstract

सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSCC) प्रगति की समझ में प्रगति के बावजूद, पांच साल के जीवित रहने की दर स्थानीय पुनरावृत्ति और दूर मेटास्टेसिस के कारण कम रहता है। एक परिकल्पना इस पुनरावृत्ति को समझाने के लिए कैंसर स्टेम कोशिकाओं की तरह (सीएससी) कि निहित chemo- और रेडियो-प्रतिरोध पेश की उपस्थिति है। आदेश में नए चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने के लिए यह प्रयोगात्मक मॉडल है कि लक्षित उपचार के प्रभाव को मान्य है और इसलिए पहचान और सीएससी के अलगाव के लिए विश्वसनीय तरीके हैं करने के लिए आवश्यक है। यह अंत करने के लिए, हम मानव HNSCC सेल लाइनों से सीएससी के अलगाव कि छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा किया जाता लगातार दो सेल sortings (FACS) के संयोजन पर निर्भर करता है के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। पहले एक सीएससी की संपत्ति पर आधारित है एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर प्रोटीन और इस तरह बाहर करते हैं, दूसरों के बीच में overexpress करने के लिए, इस तरह के Hoechst 33342. कोशिकाओं के रूप में महत्वपूर्ण डीएनए रंगों वें के साथ हलविधि एक "पक्ष जनसंख्या" (सपा) के रूप में पहचाने जाते है। सपा कोशिकाओं को एक कम प्रतिशत पैतृक कोशिकाओं की (<5%) का प्रतिनिधित्व के रूप में, एक से बढ़ चरण आदेश दूसरी सेल छँटाई से पहले उनकी संख्या बढ़ाने के लिए आवश्यक है। अगले कदम कोशिकाओं है कि अधिकारी दो अन्य HNSCC स्टेम सेल विशेषताओं कोशिका की सतह मार्कर CD44 (CD44 उच्च) और (ALDH उच्च) एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज की अधिक अभिव्यक्ति की उच्च अभिव्यक्ति के स्तर यानी के चयन के लिए अनुमति देता है। चूंकि एक एकल मार्कर का उपयोग सीएससी, सपा के संयोजन के अलगाव के लिए कई सीमाओं और नुकसान है, CD44 और ALDH मार्कर आगे विश्लेषणात्मक और कार्यात्मक रूप से व्यवहार्य कोशिकाओं की आवश्यकता होती है assays के लिए सीएससी को अलग-थलग करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करेगा। सीएससी के तने की तरह विशेषताओं अंत में tumorispheres के गठन और β-catenin की अभिव्यक्ति द्वारा इन विट्रो में मान्य किया गया था।

Introduction

सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNSCC) एक आम द्रोह दुनिया भर में है और वर्तमान उपचार में प्रगति के बावजूद, उन्नत रोग के साथ रोगियों में एक गरीब रोग का लक्षण है। कुल मिलाकर 5 साल मरीज के जीवित रहने की दर 30% के आसपास सर्जरी, केमो-रेडियोथेरेपी और लक्षित-चिकित्सा सहित चिकित्सकीय दृष्टिकोण के संयोजन के बावजूद है। हाल के अध्ययनों से कैंसर स्टेम कोशिकाओं की तरह के अस्तित्व (सीएससी) कैंसर विरोधी उपचारों 1 निम्न करने के लिए स्थानीय पुनरावृत्ति और दूर मेटास्टेसिस बताते हैं। जमते सबूत पेश स्तन, मस्तिष्क, प्रोस्टेट, फेफड़े, पेट, अग्न्याशय, जिगर और त्वचा 2- सहित विभिन्न ठोस ट्यूमर में स्टेम कोशिकाओं गुण (अविभाजित स्थिति, आत्म नवीकरण और भेदभाव क्षमता, और टेलोमिरेज गतिविधि) कोशिकाओं के अस्तित्व का समर्थन नहीं है 10। हालांकि, सीएससी के मूल स्पष्ट नहीं 11,12 बनी हुई है। वे सामान्य स्टेम कोशिकाओं 3,13 या dedifferen की घातक परिवर्तन से हो सकता हैट्यूमर कोशिकाओं है कि सीएससी-जैसी सुविधाओं 14,15 हासिल की tiation। इसलिए, सीएससी से संबंधित विशिष्ट रास्ते को समझने के शीघ्र निदान और प्रतिरोधी HNSCC के उपचार में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा।

यह प्रस्ताव किया गया है कि सीएससी भी ट्यूमर कोशिकाओं को 16-19 के थोक की तुलना में प्रतिरोधी phenotypes कि मानक कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी से बचने, ट्यूमर पतन में जिसके परिणामस्वरूप के अधिकारी और hypoxic में अनुवादित कर रहे हैं niches 20। कई कारकों जैसे निष्क्रियता के लिए प्रवृत्ति के रूप में सीएससी के इन resistances, बढ़ाया डीएनए की मरम्मत, विनियमित कोशिका चक्र नियंत्रण तंत्र, और मुक्त कट्टरपंथी सफाई 21 को समझाने के लिए प्रस्तावित किया गया है। इसके अलावा, कई ऑन्कोजेनिक आणविक रास्ते विशेष सीएससी 17 में सक्रिय किया जा सकता है। आगे लक्षित-उपचार के लिए सीएससी के ज्ञान में सुधार करने के लिए, हम पहचान और सीएससी के अलगाव के लिए विश्वसनीय तरीकों की जरूरत है, में स्टेम सेल से संबंधित मार्कर की विविधता के कारणकैंसर के 22 के विभिन्न प्रकार के।

HNSCC में, स्टेम-जैसे ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं ऐसी दवा तपका ट्रांसपोर्टरों अभिव्यक्ति 23, CD44 उच्च, CD24 कम CD133 उच्च, सी-मेट + phenotype 10,24 के रूप में विभिन्न सीएससी बायोमार्कर (व्यक्त कोशिकाओं छँटाई द्वारा प्राथमिक मरीज ​​के ट्यूमर से पृथक किया गया है, 25, या ALDH उच्च गतिविधि 26) या प्राथमिक रोगी ट्यूमर की खेती squamospheres है कि सीएससी गुण के रूप में। फिर भी, squamospheres की संख्या दो मार्ग के बाद नाटकीय रूप से कम हो जाती है, इस प्रकार आगे लक्षण वर्णन के लिए एक छोटा सा नमूना आकार अध्ययन 27 दे रही है। इसलिए, इन विट्रो assays अच्छी तरह से स्थापित सेल लाइनों से शुरू सीएससी के ज्ञान में सुधार करने के क्रम में प्रयोगों डिजाइन करने के लिए एक आसान उपाय है।

इस लेख का उद्देश्य multiparametric प्रवाह cytometric विश्लेषण एक का उपयोग कर HNSCC सेल लाइनों से सीएससी को अलग-थलग करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करने के लिए हैएन डी सेल छँटाई। ALDH गतिविधि सहित कई सीएससी गुणों के साथ संबंध में CD44 की अभिव्यक्ति, साइड जनसंख्या (सपा) phenotype, अंडाकार आकृति गठन करने की क्षमता और tumorigenicity अलग और सीएससी के इस उप-जनसंख्या को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। CD44, एक सेल सतह ग्लाइकोप्रोटीन, कोशिका आसंजन और प्रवास में शामिल है। CD44 अत्यधिक सीएससी 28 कई ठोस ट्यूमर में व्यक्त किया जाता है, सिर और गर्दन के कैंसर मॉडल 29-31 में भी शामिल है। इसके अलावा, CD44 उच्च कोशिकाओं विवो में उत्पन्न कर सकते हैं, जबकि CD44 कम कोशिकाओं को एक विषम ट्यूमर 10 नहीं कर सकते। सपा परख कोशिकाओं के अंतर संभावित सीएससी झिल्ली के भीतर overexpressed ट्रांसपोर्टर प्रोटीन की एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) के माध्यम से परिवार Hoechst डाई 22 तपका पर आधारित है। इस परख इस तरह के नियंत्रण के नमूनों में verapamil के रूप में एबीसी ट्रांसपोर्टर अवरोधकों का उपयोग भी शामिल है। एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज (ALDH) एक intracellular एंजाइम है कि रेटिनोल परिवर्तित करने के लिए गीला करना में शामिल हैजल्दी स्टेम सेल भेदभाव 25,26 दौरान inoic एसिड। कोशिकाओं है कि उच्च ALDH गतिविधि शो स्टेम तरह HNSCC 26 में सेल व्यवहार और ALDH उच्च कोशिकाओं का एक बहुत कुछ नंबर का प्रदर्शन विवो 26,32 में ट्यूमर उत्पन्न करने में सक्षम हैं।

इन मार्करों और गुणों के संयोजन सफलतापूर्वक बर्ट्रेंड ई टी अल द्वारा इस्तेमाल किया गया था। इन विट्रो में और इन विवो सीएससी के फोटान करने और कार्बन आयन विकिरण 19 में प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए। उनके परिणाम स्पष्ट रूप से पता चला है कि विभिन्न सेल मार्कर और गुणों के संयोजन एकल मार्कर दृष्टिकोण से भी HNSCC सीएससी आबादी पर अध्ययन के लिए उपयोगी अधिक चयनात्मक हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं जानवरों की देखभाल पर स्थानीय दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया। इस अध्ययन के सभी विवरण CECCAPP, एक फ्रांसीसी आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

Hoechst डाई तपका परख द्वारा एक तरफ जनसंख्या (सपा) के 1. चयन

  1. Hoechst 33342 डाई के साथ 50 लाख की कोशिकाओं को धुंधला हो जाना।
    1. एक ट्यूब लेबल "Hoechst" और एक लेबल "Hoechst और Verapamil": दो 15 मिलीलीटर एक शंक्वाकार नीचे के साथ बाँझ ट्यूबों तैयार। 5 बाँझ पानी में मिमी Verapamil हाइड्रोक्लोराइड समाधान के 10 मिलीलीटर की तैयारी। स्टेम कोशिकाओं के लिए संस्कृति के माध्यम से (मुख्यमंत्री) तैयार करें।
      1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM): F12 (1: 3, वी वी), भ्रूण बछड़ा सीरम के 5% (एफसीएस), 0.04 मिलीग्राम / hydrocortisone के एल सीएससी (मुख्यमंत्री-सीएससी) के लिए मुख्यमंत्री को तैयार करने के लिए निम्न गठबंधन , 100 यू / पेनिसिलिन की मिलीलीटर, 0.1 ग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन के एल, और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGFR) के 20 माइक्रोग्राम / एल।
    2. एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत, कोशिकाओं trypsinize। मीडिया निकालें, एस के साथ धोनेterile फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और एक 75 सेमी ² कुप्पी के लिए trypsin-EDTA के 1 मिलीलीटर (0.5 ग्राम / एल) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट सेते हैं। माता पिता के सेल लाइन के लिए इस्तेमाल संस्कृति के माध्यम से जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो। एक सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की संख्या की गणना।
      1. माता पिता का सेल लाइन (मुख्यमंत्री-पी) के लिए मुख्यमंत्री को तैयार करने के लिए, 10% एफसीएस, 0.4 मिलीग्राम / hydrocortisone के एल, 100 यू / पेनिसिलिन की मिलीग्राम और 0.1 ग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन के एल) के साथ DMEM के पूरक है।
    3. सेल निलंबन कदम 1.1.2 में प्राप्त 10 7 कोशिकाओं / सीएम-पी में मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए पतला। तैयार 2 ट्यूबों में सेल निलंबन विभाजित: ट्यूब "Hoechst और Verapamil" और ट्यूब "Hoechst" में 4 मिलीलीटर (4 10 x 7 कोशिकाओं) में 100 μl (10 6 कोशिकाओं) डाल दिया।
    4. नमूना "Hoechst और Verapamil" में, 5 मिमी Verapamil हाइड्रोक्लोराइड समाधान (अंतिम एकाग्रता: 0.5 मिमी) के 10 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण। (: 0.1 ग्राम / एल अंतिम एकाग्रता) 1 जी / एल Hoechst समाधान के 5 μl जोड़ें। में नमूना & #34; Hoechst ", 1 ग्राम के 5 μl जोड़ें / एल Hoechst 10 6 कोशिकाओं प्रति समाधान (200 μl कुल) इसके बाद, नमूने एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम से संरक्षित रखने के लिए।।
    5. 1 घंटा 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में सभी ट्यूबों को सेते हैं। धीरे हर 15 मिनट के बसने से कोशिकाओं को रोकने के लिए मिश्रण।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। तैरनेवाला निकालें और 1x पीबीएस के 2 एमएल के साथ प्रत्येक गोली resuspend।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। सतह पर तैरनेवाला निकालें। Resuspend "Hoechst और Verapamil" के 5 मिलीग्राम / एल propidium आयोडाइड (पीआई) 500 μl में गोली पीबीएस में पतला बफर और 5 मिलीग्राम / एल पीआई पीबीएस बफर में पतला के 4 मिलीलीटर में "Hoechst" गोली।
    8. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से नमूना समाधान स्थानांतरण समुच्चय प्रवाह पर नमूना तेज के लिए ट्यूबों में हटाने और एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए। बर्फ पर नमूने रखें और एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम से बचाने के लिए।
  2. मैंसाइड जनसंख्या सेल छंटनी से Hoechst डाई को छोड़कर solation।
    1. सॉर्टर एक प्रवाह cytometry निम्नलिखित मानकों के साथ पर Hoechst नकारात्मक सेल जुदाई प्रदर्शन: यूवी लेजर (355 एनएम), नीले Hoechst (बीपी 450/50) और लाल Hoechst (610/20 बीपी) फिल्टर के साथ यूवी लेजर पथ पर 2 डिटेक्टरों, और 2 कलेक्टरों।
      1. सबसे पहले, विश्लेषण नमूना "Hoechst" है कि धुंधला हो जाना और प्रवाह कोशिकामापी सेट-अप के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
      2. , कोशिकामापी सॉफ्टवेयर का उपयोग करना "ग्लोबल वर्कशीट" खिड़की पर, पर "डॉट साजिश" पर क्लिक करें (पांचवें शीर्ष सही तस्वीर) और वैश्विक वर्कशीट पर एक चार्ट बना सकते हैं। तालमेल पर, एक सही क्लिक के साथ, FSC-ए (आगे तितर बितर) और भुज पर, एसएससी-ए (ओर तितर बितर) (चित्रा 1 ए) का चयन करें। उसी तरह, एक एसएससी-W बनाम एस सी सी एच डॉट साजिश बनाने के लिए। इस दूसरे डॉट भूखंड पर, एक P1 क्षेत्र बनाने के लिए, "बहुभुज गेट" (चौदहवें शीर्ष सही तस्वीर) (चित्रा 1 बी), 33 पर क्लिक करें।
        नोट: P1 क्षेत्र होगाएकल कक्षों धरना और दोहरी भेदभाव।
      3. वैकल्पिक: पीआई बनाम एक एफएससी-ए P1 पर गेटेड बनाने के द्वारा सकारात्मक कोशिकाओं को बाहर पीआई। इस डॉट भूखंड पर, पीआई सकारात्मक मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए पीआई नकारात्मक आबादी (P2) का चयन करें।
      4. , कोशिकामापी सॉफ्टवेयर का उपयोग करना "ग्लोबल वर्कशीट" खिड़की पर, पर "डॉट साजिश" क्लिक करें और वैश्विक वर्कशीट पर एक चार्ट बना सकते हैं। तालमेल पर, एक सही क्लिक के साथ, नीले Hoechst-एक का चयन करें और भुज में रेड Hoechst-ए। जनसंख्या पर एक सही क्लिक के साथ, "दिखाएँ जनसंख्या" और P1 का चयन करें। इस डॉट भूखंड पर, एक क्षेत्र (P2) नकारात्मक Hoechst डाई पक्ष आबादी (सपा) कोशिकाओं है कि कोशिकाओं के मुख्य आबादी (चित्रा 1 सी) की बाईं तरफ एक तरफ हाथ के रूप में प्रकट होता है चयन करने के लिए पैदा करते हैं।
    2. नमूना "Hoechst" विश्लेषण और 10,000 घटनाओं इकट्ठा। यह सुनिश्चित करें कि गेट P2, जो सपा आबादी का प्रतिनिधित्व करता है, अच्छी तरह से तैनात है, नमूना विश्लेषण "Hoechst और Verapamil" (10,000 घटनाओं)सपा आबादी (चित्रा -1) के लापता होने के निरीक्षण करने के लिए।
    3. 1.1.1.1 में तैयार मुख्यमंत्री सीएससी के 1 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सपा Hoechst डाई नकारात्मक कोशिकाओं को ले लीजिए।
    4. सेल छँटाई के अंत में, सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 250 XG पर सेल निलंबन, सतह पर तैरनेवाला हटाने और मुख्यमंत्री सीएससी के 1 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend। एक सेल काउंटर का उपयोग कर हल कोशिकाओं की संख्या की गणना और एक संस्कृति कुप्पी के लिए कक्षों की उपयुक्त संख्या हस्तांतरण (1 टेबल देखें)। मुख्यमंत्री सीएससी जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 माहौल पर सेते हैं।
    5. 2 मार्ग की एक अधिकतम के लिए एक ही परिस्थितियों में संस्कृति में कोशिकाओं को बनाए रखें जब तक वहाँ 5 10 x 7 कोशिकाओं (चरण 3, "सेल कल्चर विधि" देखें) की एक न्यूनतम है।

2. CD44 उच्च / ALDH उच्च पक्ष जनसंख्या छाँटे में उप-जनसंख्या का चयन

  1. ALDH जांच किट और सी के साथ सपा प्रकोष्ठों के 50 लाख धुंधलाD44 एंटीबॉडी।
    1. "बेदाग" (ट्यूब), "CD44 एपीसी" (ट्यूब ख), "IgG1 एपीसी" (ट्यूब ग), "ALDH" (ट्यूब डी), "ALDH और DEAB: इस प्रकार के रूप में सात से 15 मिलीलीटर लेबल बाँझ ट्यूबों तैयार "(ट्यूब ई)," ALDH और CD44 एपीसी "(ट्यूब एफ)," ALDH, DEAB और CD44 एपीसी "(ट्यूब छ)। धुंधला दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी ट्यूबों और अभिकर्मकों रखें।
    2. बफर 1 (किट में निहित) के 4.5 मिलीग्राम और CD44 एपीसी (Allophycocyanin) एंटीबॉडी (: 100 कमजोर पड़ने 1) के 45 μl के साथ बफर तैयार करें। बफर 1 के 100 μl और IgG1 एपीसी एंटीबॉडी के 1 μl (: 100 कमजोर पड़ने 1) के साथ बफर बी तैयार करें। बफर 1 का 4 मिलीग्राम और किट के अभिकर्मक के 20 μl के साथ बफर सी तैयार करें।
    3. 10 7 कोशिकाओं / एमएल पर पहले से हल कोशिकाओं (कदम 1.2.5) के एक सेल निलंबन तैयार करें। सेल निलंबन के 100 μL (10 6 कोशिकाओं) ट्यूबों को ए, बी और सी, और ट्यूब एफ के लिए 4 मिलीलीटर (4 एक्स 10 7 कोशिकाओं) जोड़ें। क्षण के लिए में ट्यूबों डी, ई और जी कोशिकाओं मत डालो।
    4. 5 मिनट के लिए 250 XG पर कोशिकाओं से युक्त ट्यूबों अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और (DEAB) diethylaminobenzaldehyde के 5 μl, ट्यूब ई और जी एक ALDH अवरोध जोड़े नलियों ए, बी और बफर 1. के 100 μl में ग में छर्रों resuspend।
      1. 4 मिलीलीटर अभिकर्मक सी के साथ और तुरंत च ट्यूब में Resuspend कोशिकाओं में ट्यूब डी, ई और जी 100 μl हस्तांतरण। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में सभी ट्यूबों सेते हैं और एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम से बचाने के लिए। सेल निलंबन बसने से कोशिकाओं को रोकने के लिए 15 मिनट के बाद vortexing द्वारा धीरे मिलाएं।
    5. इस पल से, बर्फ पर ट्यूबों रखने के लिए और एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम से रक्षा की। अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर सभी ट्यूबों और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    6. 4 मिलीलीटर और बी और अन्य ट्यूबों के लिए बफर बी के 100 μl के साथ बफर ए Resuspend ट्यूब ग के 100 μl के साथ जी ट्यूब, ट्यूब में Resuspend च 4 डिग्री पर 1. सेते 10 मिनट के बफर के 100 μl जोड़ने;सी।
    7. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर सभी ट्यूबों और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। एक बार में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर फिर से बफर 1 के 1 मिलीलीटर (ट्यूब च के लिए 4 मिलीलीटर) और सेंट्रीफ्यूज के साथ कुल्ला। सतह पर तैरनेवाला निकालें। पुनः निलंबित 4 मिलीलीटर और बफर 1 के 1 मिलीलीटर में अन्य सभी ट्यूबों में ट्यूब च गोली।
    8. 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से नमूना समाधान स्थानांतरण समुच्चय प्रवाह पर नमूना तेज के लिए उचित ट्यूबों में हटाने और एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए।
  2. CD44 उच्च / ALDH उच्च सेल प्रतिदीप्ति द्वारा जनसंख्या के अलगाव सेल छंटनी सक्रिय।
    1. प्रदर्शन करना CD44 उच्च / ALDH उच्च सेल सॉर्टर एक प्रवाह cytometry निम्नलिखित मानकों के साथ पर छंटनी: एक FITC फिल्टर (530/30), 1 के साथ नीले लेजर पथ पर ब्लू लेजर (488 एनएम) और लाल लेजर (633 एनएम), 1 डिटेक्टर एक एपीसी फिल्टर (660/20) और 2 लेनेवालों के साथ लाल लेजर पथ पर डिटेक्टर।
    2. कोशिकामापी सॉफ्टवेयर का प्रयोग, "पर डॉट पीएलओ क्लिक करेंटी "(पांचवें शीर्ष सही चित्र) सेल आकृति विज्ञान की जाँच करें और एक एसएससी-W बनाम एसएससी-एच के साथ एकल कक्षों की रचना की आबादी का चयन करने के लिए खंड 1.2.1.2 में वर्णित के रूप बनाम एसएससी-एक डॉट साजिश एक एफएससी-ए बनाने के लिए, बिंदु साजिश।
    3. , कोशिकामापी सॉफ्टवेयर का उपयोग करना "ग्लोबल वर्कशीट" खिड़की पर, पर "डॉट साजिश" क्लिक करें और वैश्विक वर्कशीट पर एक चार्ट बना सकते हैं। तालमेल पर, एक सही क्लिक के साथ, ताकि डबल दाग आबादी का चयन करने में एपीसी-ए और भुज, FITC-A पर चयन करें। ALDH उच्च कोशिकाओं (चित्रा 2A) का चयन करने के लिए डी और ई ट्यूब का उपयोग एक गेट बनाएँ। नोट: सकारात्मक कोशिकाओं ट्यूब ई DEAB (चित्रा 2 बी) के साथ इलाज में गायब हो जाते हैं।
      1. एक ही चार्ट पर, आदेश में ट्यूबों बी और सी का उपयोग कर CD44 उच्च कोशिकाओं (चित्रा -2 और 2 डी) का चयन करने के लिए एक दूसरे गेट बनाने के लिए। सकारात्मक कोशिकाओं IgG1 एपीसी युक्त ट्यूब में गायब हो जाते हैं। ट्यूबों के विश्लेषण एफ और जी और एक तिहाई गेट कि CD44 उच्च / ALDH <शामिल बनानेsup> उच्च कोशिकाओं (चित्रा 2 ई और 2 एफ)।
        नोट: सकारात्मक कोशिकाओं से युक्त IgG1 एपीसी (चित्रा 2 डी) ट्यूब में मौजूद हैं, कोशिकाओं और एपीसी से सना हुआ एंटीबॉडी के बीच बातचीत के लिए विशिष्ट नहीं है।
    4. मुख्यमंत्री सीएससी के 1 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में CD44 उच्च / ALDH उच्च कोशिकाओं को ले लीजिए। यह भी CD44 कम / ALDH कम मुख्यमंत्री 19 के 1 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ले लीजिए। नोट: कदम 1.1.1.1 में वर्णित के रूप में मुख्यमंत्री सीएससी तैयार करें।
    5. 5 मिनट के लिए 250 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटाने और मुख्यमंत्री सीएससी के 1 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend। हल कोशिकाओं की संख्या की गणना।

3. सेल संस्कृति विधि

  1. कोशिकाओं के रूप में ऊपर वर्णित के डबल-छंटाई के बाद, 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक उचित संस्कृति कुप्पी (तालिका 1) मुख्यमंत्री सीएससी के साथ में हल कोशिकाओं थाली। 18-24 घंटे के बाद,अगर जांच कोशिकाओं पालन किया है और संस्कृति के माध्यम से बदल जाते हैं। संस्कृति के माध्यम से परिवर्तन हर 3 दिन तक का विस्तार कालोनियों में 50% से अधिक मिला हुआ हैं।
  2. संस्कृति कुप्पी से कोशिकाओं trypsinize को EDTA (तालिका 1) - trypsin 0.5 ग्राम / एल की उचित मात्रा का प्रयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते 3 से 5 मिनट। मुख्यमंत्री सीएससी (तालिका 1) की उचित मात्रा trypsin की कार्रवाई को रोकने के लिए जोड़ें।
  3. प्राप्त कोशिकाओं और प्लेट मुख्यमंत्री सीएससी के साथ एक 175 सेमी ² संस्कृति फ्लास्क में 4 x 10 5 कोशिकाओं की संख्या की गणना। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2। इस एकाग्रता में 24 घंटा का दोहरीकरण समय के साथ कोशिकाओं को 7 दिनों में 70% मिला हुआ होगा।
  4. इन विट्रो के लिए या विवो प्रयोगों में सीएससी का प्रयोग करने से पहले वे 3 मार्ग से गुजरा है।

4. ट्यूमर संभावित और सीएससी के लक्षण की पुष्टि

  1. ट्यूमर क्षेत्रः गठन CD44 उच्च / ALDH के ट्यूमर की पुष्टि करने के लिए संभावितउच्च कोशिकाओं।
    1. 3.2 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं Trypsinize। 5 मिनट के लिए 250 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक DMEM में गोली फिर से निलंबित: F12 (3: 1) मध्यम एफसीएस मुक्त, 20 एनजी / rhEGF मिलीलीटर, हेपरिन और 1x B27 के 4 मिलीग्राम / एल। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 6 अच्छी तरह से कम लंगर प्लेटों संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं को सेते हैं और 5% सीओ 2।
      नोट: उपयोग DMEM: F12 (3: 1) एफसीएस के 5%, rhEGF के 20 एनजी / एमएल, 4 मिलीग्राम / हेपरिन के एल और 1x B27 अगर सेल के बिना एफसीएस हो जाना नहीं है युक्त मध्यम।
    2. बोने (चित्रा 3) के बाद 4 से 10 दिनों से एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ ट्यूमर क्षेत्र गठन का निरीक्षण करें।
      नोट: ट्यूमर क्षेत्र व्यास होना चाहिए और अधिक से अधिक 35 माइक्रोन। CD44 उच्च / ALDH उच्च कोशिकाओं CD44 कम / ALDH कम की तुलना में संख्या और आकार के मामले में एक तेजी से और अधिक बढ़ाया ट्यूमर क्षेत्र गठन दिखाएगा।
  2. में विवो tumorigenicity के मूल्यांकन के बादइशारा-SCID चूहों में CD44 उच्च / ALDH उच्च कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन।
    1. छंटाई के बाद, कोशिकाओं पीबीएस में तीन अलग-अलग सांद्रता (10 4 कोशिकाओं / एमएल, 10 5 कोशिकाओं / एमएल, और 10 6 कोशिकाओं / एमएल) पर फिर से निलंबित। 6 चूहों की सही दिशा क्षेत्र में subcutaneously 10 4 कोशिकाओं / एमएल (10 3 कोशिकाओं) के 100 μl इंजेक्षन। 10 5 कोशिकाओं / एमएल (10 4 कोशिकाओं), और 10 6 कोशिकाओं / एमएल (10 5 कोशिकाओं) के लिए एक ही मत करो।
      नोट: लोअर कमजोर पड़ने से कम 10 3 कोशिकाओं का परीक्षण किया जा सकता है।
    2. बायीं ओर क्षेत्र में CD44 कम / ALDH कम कोशिकाओं का एक ही एकाग्रता इंजेक्षन। 10 सप्ताह के लिए मॉनिटर इंजेक्शन चूहों ट्यूमर प्रगति 19 देखने के लिए।

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Representative Results

HNSCC सेल लाइनों से सीएससी के अलगाव के माता पिता का सेल लाइन में सीएससी का बहुत कम प्रतिशत की वजह से आवश्यक लगातार दो छँटाई। पहले छँटाई सीएससी की क्षमता दवा तपका ट्रांसपोर्टरों के कारण Hoechst डाई को बाहर करने के आधार पर किया गया था। इस हल कुल सेल आबादी (चित्रा 1) के 1-5% के अधिग्रहण में हुई। Hoechst डाई नकारात्मक सेल छँटाई के दौरान, बनाम एसएससी-ए डॉट साजिश (चित्रा 1 ए) एफएससी-ए को देखकर आकार और हल कोशिकाओं की दानेदार बनाने की जाँच करें। फिर, एसएससी-W बनाम एसएससी-एच डॉट साजिश का उपयोग कर और जनसंख्या P1 (चित्रा 1 बी) का चयन करके दोहरी और कोशिकाओं के टुकड़े भेदभाव। इस P1 आबादी पर, बनाम Hoechst ब्लू-ए डॉट साजिश एक Hoechst लाल-ए पैदा करते हैं। ट्यूब लेबल "Hoechst" के साथ, सपा मुख्य कोशिकाओं आबादी (चित्रा 1 सी) से बाईं तरफ एक तरफ हाथ के रूप में प्रकट होता है। इस आबादी गायब हो जाना चाहिए, जब वे गिरफ्तारीई Verapamil (चित्रा -1), एबीसी ट्रांसपोर्टरों के एक अवरोध करनेवाला के साथ इलाज किया। पीआई धुंधला पीआई पॉजिटिव मृत कोशिकाओं के बहिष्कार की अनुमति देता है, क्योंकि इस आबादी के तहत पैमाने Hoechst लाल-ए पैमाने (चित्रा 1C और -1 डी, नीले ellipses) पर है।

दूसरी सेल छँटाई CD44 रिसेप्टर और उच्च ALDH एंजाइम गतिविधि है जो सपा कोशिकाओं पहले (चित्रा 2) के अनुसार क्रमबद्ध से 0.5-2% के अधिग्रहण की अनुमति के उच्च अभिव्यक्ति पर आधारित था। सॉर्ट करने से पहले, विभिन्न नियंत्रण इस्तेमाल किया गया। पहले वाले "ALDH" और "ALDH + DEAB" ट्यूब आदेश FITC उच्च कोशिकाओं (आंकड़े 2A और 2 बी) पर पहले गेट के लिए जगह में जरूरत है: ALDH उच्च कोशिकाओं बनाम एपीसी-ए डॉट FITC-A पर gated थे साजिश "ALDH" ट्यूब (2A चित्रा) का उपयोग कर। गेट की अच्छी स्थिति "ALD का उपयोग कर जाँच की थीएच + DEAB "ट्यूब:।। के रूप में DEAB ALDH रोकता है, सकारात्मक कोशिकाओं गेट (चित्रा 2 बी) से गायब हो जाना चाहिए कि वे नहीं, प्रतिक्रिया की स्थिति बदल सकता है (उदाहरण के लिए DEAB की राशि में वृद्धि से) दूसरे नियंत्रण है" CD44 एपीसी "और" IgG1 एपीसी "ट्यूब जो एपीसी उच्च कोशिकाओं (आंकड़े -2 सी और 2 डी) कोशिकाओं CD44 एपीसी एंटीबॉडी (चित्रा 2 सी) के साथ दाग का उपयोग करने पर दूसरे गेट की स्थिति के लिए अनुमति दी। इस आबादी के साथ गायब हो जाना चाहिए नियंत्रण ट्यूब जो निहित IgG1 एपीसी कोशिकाओं (चित्रा 2 डी)। यदि ऐसा नहीं होता, एंटीबॉडी के साथ बंधन नहीं विशिष्ट 0.5% प्रतिरक्षी प्रतिक्रिया के दौरान ALDH का पता लगाने किट से बफर 1 में जोड़ा जाना चाहिए और बीएसए। अंत में, तीसरे नियंत्रण चिंताओं "ALDH और CD44 एपीसी" ट्यूब और "ALDH, DEAB और CD44 एपीसी" ट्यूब (आंकड़े 2 ई, 2 एफ, 2 जी और 2H)। डबल स्टेशनining ALDH / CD44 ट्यूब डबल सकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 2 ई) और एक ही ट्यूब DEAB के साथ इलाज पर पिछले गेट की स्थिति के लिए प्रयोग किया जाता है सत्यापित करने के लिए कि ALDH उच्च कोशिकाओं गायब (चित्रा 2 एफ) एक नियंत्रण है।

इस प्रोटोकॉल SQ20B और FaDu सेल लाइनों से सीएससी सुलझाने के लिए प्रयोग किया जाता है। जब छंटाई, एक नया सेल लाइन पर पहली बार के लिए किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित करें कि हल कोशिकाओं स्टेम कोशिकाओं की तरह गुण होते हैं, यह उनके ट्यूमर संभावित पुष्टि करने के लिए आवश्यक है। स्टेम सेल की तरह संपत्ति में से एक एक एफएससी मुक्त माध्यम में इन विट्रो में tumorspheres फार्म करने की क्षमता है। इस शर्त के तहत, केवल कैंसर स्टेम कोशिकाओं की तरह जीवित है और पैदा करना (चित्रा 3 ए) कर सकते हैं। इसके अलावा, qPCR प्रयोगों के साथ-साथ CD44 उच्च / ALDH उच्च कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) में β-catenin (स्टेम की तरह विशेषता के मार्कर) के एक उच्च अभिव्यक्ति दिखाने, बीएमआई -1 और पायदान 19 </ Sup>। अंत में, CD44 उच्च / ALDH उच्च कोशिकाओं को भी जब CD44 कम / ALDH कम कोशिकाओं 19 की तुलना में कम मात्रा में इंजेक्शन ट्यूमर के रूप में करने में सक्षम हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: एक ओर जनसंख्या Hoechst डाई को छोड़कर के अलगाव (ए) एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए डॉट साजिश है।। (बी) एसएससी-W बनाम एसएससी-एच डॉट साजिश है। (सी, डी) Hoechst लाल-ए बनाम Hoechst ब्लू-ए डॉट साजिश "Hoechst" ट्यूब (सी) या "Hoechst और Verapamil" ट्यूब (डी) के साथ इस्तेमाल करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: तो Hoechst डाई नकारात्मक कोशिकाओं से CD44 उच्च / ALDH उच्च कोशिकाओं के rting। FITC-ए बनाम एपीसी-ए डॉट "ALDH" ट्यूब (ए), "ALDH + DEAB" ट्यूब (बी), "CD44 एपीसी 'का उपयोग कर साजिश ट्यूब (सी), "IgG1 एपीसी" ट्यूब (डी), "ALDH और CD44 एपीसी" ट्यूब (ई और जी) या "ALDH, DEAB और CD44 एपीसी" ट्यूब (एफ और एच)। आंकड़े ए, बी, सी, डी, ई और एफ SQ20B सेल लाइन का उपयोग कर प्राप्त किया गया। आंकड़े जी और एच FaDu सेल लाइन का उपयोग कर प्राप्त की। ग्रीन CD44 कम / ALDH कम कोशिकाओं (Q3) इंगित करता है; गहरे नीले रंग की CD44 कम / उच्च ALDH कोशिकाओं (क्यू 1) इंगित करता है; बैंगनी CD44 उच्च / कम ALDH कोशिकाओं (Q4) इंगित करता है; हल्के नीले रंग CD44 उच्च / ALDH उच्च कोशिकाओं (Q2) इंगित करता है।_upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। छाँटे CD44 उच्च / ALDH उच्च कोशिकाओं CD44 उच्च / ALDH उच्च कोशिकाओं का ट्यूमर क्षमता की पुष्टि एक गरीब-एफसीएस मीडिया में tumorspheres इन विट्रो (ए) के रूप में करने में सक्षम थे। स्केल बार, 25 माइक्रोन। इसके अलावा, CD44 उच्च / ALDH उच्च overexpress β-catenin, tumorigenicity (बी) के एक मार्कर। इस मात्रा का ठहराव का प्रतिनिधित्व करते हैं एसडी qPCR और त्रुटि सलाखों के द्वारा प्रदर्शन किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कोशिकाओं की संख्याछाँटे गए संस्कृति फ्लास्क प्रकार Trypsin वॉल्यूम (एमएल) संस्कृति मध्यम मात्रा (एमएल)
10,000-200,000 6 अच्छी तरह से थाली के 1 अच्छी तरह से या 3.5 सेमी पेट्री डिश 0.5 2
200,000-1,000,000 1 T25 संस्कृति फ्लास्क 1 4
> 1000000 1 T75 संस्कृति फ्लास्क 2 10

तालिका 1: संस्कृति फ्लास्क प्रकार हल किया दिए गए हैं कोशिकाओं की अनुमानित संख्या के लिए हल कोशिकाओं की संख्या के अनुसार उपयोग करने के संस्कृति कुप्पी आकार का विवरण।। trypsin और संस्कृति फ्लास्क प्रकार के लिए आवश्यक माध्यम की मात्रा की मात्रा भी प्रदान की जाती हैं।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एक विशेष सेल लाइन है कि अन्य HNSCC सेल लाइनों के लिए लागू है से सीएससी के सफल अलगाव के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन है। पृथक सिर और गर्दन सीएससी तो आगे आणविक immunodeficient चूहों 19 में प्रत्यारोपण द्वारा इन विट्रो और कार्यात्मक सत्यापन में लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त हैं। हालांकि, कुछ संशोधनों के पक्ष आबादी या CD44 उच्च / ALDH उच्च पैतृक सेल लाइन में मौजूद प्रतिशत के आधार पर परीक्षण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि पक्ष जनसंख्या में कोशिकाओं का प्रतिशत एक विशेष सेल लाइन में बहुत कम है, CD44 उच्च / ALDH उच्च छँटाई सीधे किया जा सकता है। इस अध्ययन में इस्तेमाल मार्कर ऐसे CD133 उच्च 34 या CD10 उच्च 35 के रूप में सेल लाइन के लिए उचित अन्य मार्कर द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता का अध्ययन किया।

इस प्रोटोकॉल दो सेल sortings पर आधारित है। तीन रंग सपा + CD44 + ALDH साथ छँटाई संभव नहीं थापरीक्षण किया सेल लाइनों के साथ ई। सबसे पहले, माता पिता का सेल लाइनों में यहाँ सपा सपा के% और 10% से कम CD44 उच्च / ALDH उच्च कोशिकाओं में मौजूद कम से कम 5 का परीक्षण किया। इसलिए, सपा / CD44 उच्च / ALDH उच्च पैतृक सेल लाइन के कम से कम 0.5% प्रतिनिधित्व करते हैं। इसलिए, एक पहले सपा छँटाई आदेश में उच्च और / या ALDH उच्च कोशिकाओं CD44 में जनसंख्या समृद्ध करने के लिए आवश्यक है। दूसरा, माता पिता का सेल लाइन का 1% से हल करने के लिए, यह लगभग 300,000 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 5 घंटा लेता है। इसलिए, अगर एक 3 रंग सेल छँटाई किया जाता है, एकत्र की कोशिकाओं की मात्रा बहुत कम हो जाएगा। इसके अलावा, अब छँटाई की सिफारिश नहीं है यह सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है।

इस अलगाव प्रोटोकॉल के चयनात्मकता के कारण, मुख्य सीमा प्राप्त सीएससी की छोटी संख्या है। यह आगे के प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है, क्योंकि यह CD44 और एक की तेजी से नुकसान की वजह से 3 मार्ग के बाद उन्हें इस्तेमाल करने की सिफारिश नहीं हैLDH मार्करों। इसके अलावा, प्रत्येक नए प्रयोग से पहले, CD44 उच्च / ALDH उच्च अभी भी सेल निलंबन में मौजूद कोशिकाओं का प्रतिशत क्रम में सीएससी कि भेदभाव किया है की संख्या की जांच करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए।

यह Verapamil हाइड्रोक्लोराइड समाधान और संस्कृति EGF युक्त सिर्फ उपयोग करने से पहले के रूप में इन अणुओं बहुत अस्थिर कर रहे हैं मध्यम तैयार करने के लिए आवश्यक है। 20 मिलीग्राम / एल EGF के एक शेयर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर तीन महीने के लिए स्थिर है। Hoechst प्रोटोकॉल के बदलाव मौजूद हैं, लेकिन आमतौर पर इस्तेमाल किया अंतिम डाई एकाग्रता 5 माइक्रोग्राम / एमएल है। इसके अलावा, पहले छँटाई के दौरान, अलग संस्कृति मीडिया रचनाओं सेल इस्तेमाल लाइन के अनुसार परीक्षण किया जाना चाहिए। एक बार जब छँटाई की स्थिति पुष्टि कर रहे हैं, यह अलग तरीकों (धारा 4) का उपयोग कर हल सेल की आबादी की संपत्ति की जांच करने के लिए आवश्यक है।

कोशिका की सतह मार्कर, ALDH गतिविधि और महत्वपूर्ण रंगों तपका करने की क्षमता पहले से ही individua इस्तेमाल किया गया हैlly साहित्य में HNSCC से सीएससी को अलग-थलग करने के लिए। हालांकि, यहां वर्णित प्रोटोकॉल क्रम में विभिन्न मार्करों के संयोजन का उपयोग कर HNSCC सेल लाइनों से सीएससी अलगाव में उच्च विशिष्टता प्राप्त करने के लिए अनूठा लाभ है। इसके अलावा, CD44 छँटाई एक एंटीबॉडी विरोधी CD44 चुंबकीय सूक्ष्म मोती के साथ संयुग्मित और एक चुंबकीय स्तंभ 36 के साथ हल के साथ महसूस किया जा सकता है, लेकिन इस पद्धति का ही कोशिका की सतह मार्करों के लिए लागू है और एक ALDH छँटाई के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, डबल छँटाई रोकने । सीएससी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया एक अन्य विधि प्राथमिक ट्यूमर 37 या 38 xenografts से tumorsphere संस्कृति है। हालांकि, इन प्राथमिक ट्यूमर या xenografts के अधिग्रहण के नैतिक कमी के साथ जुड़े रहे हैं।

चूंकि यह विधि व्यवहार्य HNSCC सीएससी आइसोलेट्स, वे प्रयोगों है कि इन कोशिकाओं के शारीरिक समारोह को मापने की एक संख्या में (उनके tumorigenicity की जाँच के बाद) का इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए यह व्यवहार के आकलन के लिए अनुमति देता हैसीएससी के विभिन्न चिकित्सकीय दृष्टिकोण (रेडियोथेरेपी, कीमोथेरेपी) के बाद। यह भी इस तरह के पलायन / आक्रमण, डीएनए की मरम्मत, सेल संकेतन, आदि के रूप में विभिन्न जैविक मापदंडों के अध्ययन की अनुमति देता है। इसलिए, अलग सेल लाइनों से सीएससी प्राप्त करने सीएससी संपत्तियों की जांच के लिए एक आकर्षक विकल्प है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Calf Serum Gold GE Healthcare A15-151
Hydrocortisone water soluble Sigma-Aldrich H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100x Dominique Dutscher L0022-100
DMEM Gibco 61965-026
F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I Gibco 31765-027
EGF Promega G5021 The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin StemcellTM Technologies 7980
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A Gibco 12587-010
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich 14533 Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride Sigma-Aldrich V-4629 Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4170 Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit Stem Cell 1700
CD44-APC, human antibody Miltenyi Biotech 130-095-177
IgG1-APC, human antibody Miltenyi Biotech 130-093-189
Z1 coulter particle Beckman Coulter 6605698
Optical microscope Olympus  CKX31
SQ20B cell line Gift from the John Little’s Laboratory -
FaDu cell line ATCC HTB-43
Low anchorage plates Thermo Fischer Scientific 145383
BD FACSDiva software v8.0.1 BD Biosciences -

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