1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 3School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Published 5/18/2016
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Immunology and Infection

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Summary

इधर, फसल को बनाए रखने, और रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) और लिस्टेरिया monocytogenes के साथ माउस छोटी आंतों organoids के इलाज के लिए एक प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन के लिए उचित सामान्य बनाने की तकनीक पर जोर देने के रूप में वर्णित है।

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Rothschild, D. E., Srinivasan, T., Aponte-Santiago, L. A., Shen, X., Allen, I. C. The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (111), e54033, doi:10.3791/54033 (2016).

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Abstract

प्राथमिक आंतों organoids एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली संभावित काफी श्लैष्मिक इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र को प्रभावित करने के लिए हो गया है। हालांकि, organoid विकास विशेषताओं की जटिलताओं अन्वेषक के लिए महत्वपूर्ण निरंतर ले। विशेष रूप से, प्रत्येक व्यक्ति organoid के विकास पैटर्न अत्यधिक चर रहे हैं और संस्कृति में उपकला कोशिकाओं के एक विषम जनसंख्या पैदा करते हैं। इस तरह के निरंतर के साथ, आम टिशू कल्चर प्रथाओं बस सेलुलर संरचना की जटिलता के कारण organoid प्रणाली को लागू नहीं किया जा सकता है। गिनती और सेल नंबर है, जो इस तरह के सेल लाइनों के रूप में व्यक्तिगत रूप से अलग कोशिकाओं, के लिए आम बात है पर पूरी तरह आधारित चढ़ाना, organoids के लिए एक विश्वसनीय विधि जब तक कुछ सामान्य बनाने की तकनीक लागू किया जाता है नहीं है। कुल प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्य निवासी प्रोटीन मैट्रिक्स के कारण जटिल बना दिया है। जब secreted चुनाव के मूल्यांकन के सेल नंबर, आकार और प्रकार की कोशिका के संदर्भ में इन विशेषताओं को ध्यान में रखा जाना चाहिएorganoid जन से टेंट। इस प्रोटोकॉल संस्कृति के लिए एक सरल प्रक्रिया की रूपरेखा और माइक्रोबियल रोगज़नक़ों और रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) के साथ छोटे आंतों organoids के इलाज के लिए उत्पन्न किया गया है। यह भी सामान्य बनाने की तकनीक है कि जब प्रोटीन विश्लेषण एक ऐसी चुनौती के बाद आयोजित की जाती हैं लागू किया जाना चाहिए पर जोर दिया।

Introduction

क्षमता फसल के लिए और संस्कृति प्राथमिक organoids छोटी आंत, पेट, अग्न्याशय, जिगर और मस्तिष्क के लिए वर्णित किया गया है और कर रहे हैं रोमांचक अग्रिम ऊतक जीव विज्ञान 1-5 के लिए एक अधिक physiologically प्रतिनिधि घटना को समझने के लिए सार्थक। संस्कृति और छोटे आंत्र organoids के रखरखाव का वर्णन पहली तरीकों सातो एट अल द्वारा सूचना मिली थी। हंस Clevers 1 की प्रयोगशाला से बाहर। इस विधि, संचयन और प्राथमिक आंतों उपकला साबित हुई कोशिकाओं की संस्कृति से पहले सीमित और उपकला कोशिकाओं के विकास को बनाए रखने में अप्रभावी हो। इस तरह के तरीके कोलैजिनेज़ और Dispase के रूप में एंजाइमों, जो अंततः intermixed प्राथमिक fibroblast कोशिकाओं 6 के परिणाम के लिए नेतृत्व करेंगे के साथ ऊष्मायन के माध्यम से ऊतक की हदबंदी शामिल थे। इन वजहों से भी समय उपकला सेल संस्कृति को बनाए रखने में प्रतिबंधित किया जाएगा। कोई उपकला सेल आला करने के लिए कम से कम, फार्म के रूप में उपकला कोशिकाओं के कारण apoptosis दर्ज होगाउचित वृद्धि कारक या संपर्क अखंडता के नुकसान की कमी है, anokis 7 करार दिया। 3 डी-organoid संस्कृति प्रणाली के आगमन के संस्कृति प्राथमिक आंतों निरंतर संस्कृति 1 में आंतों सेल प्रकार की एक स्पेक्ट्रम युक्त कोशिकाओं के लिए एक विधि प्रदान की गई है। ये उपकला organoids सेल लाइनों की जा रही है कि वे कई विभेदित कोशिकाओं से बना रहे हैं से अधिक लाभ है, और बेहतर अंग वे विवो 8 में से निकाली गई है नकल। प्रक्रिया अंतत "बढ़ने एक थाली में एक मिनी पेट" के लिए विभिन्न उत्तेजनाओं के तहत आंतों उपकला की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है। माइक्रोबियल रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) के साथ प्राथमिक आंतों की कोशिकाओं की बातचीत की जांच इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र के लिए प्रासंगिक के रूप में इन आणविक पैटर्न दोनों मेजबान और सूक्ष्म जीव 9 से विविध प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित कर सकते है। इतना ही नहीं जांचकर्ताओं अब माउस organoids के साथ इन संबंधों का पता लगाने कर सकते हैं, लेकिन वेअच्छी तरह से 2 के रूप में मनुष्यों से संवर्धित किया जा सकता है। इस तकनीक के संभावित नाटकीय रूप से व्यक्तिगत दवा को बदलने के लिए है और यह प्रगति के बारे में अटकलें हैं कि इस तकनीक को निकट भविष्य में संभव कर देगा आकर्षक है।

इस विधि के समग्र लक्ष्य उत्तेजनाओं की एक किस्म के साथ संस्कृति, विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल, और आंतों organoids के उपचार प्रदान करना है। इस तरह की उत्तेजनाओं टीके, बैक्टीरियल PAMPs, जीना रोगजनकों, जठरांत्र (सैनिक) और कैंसर चिकित्सा विज्ञान से अंततः लेकर कर सकते हैं। अलगाव और माउस आंतों organoids की संस्कृति सातो एट अल से अनुकूलित किया गया है। हालांकि मूल विधि से मामूली विचलन, अंत उत्पाद संस्कृति organoid जा रहा है अभी भी हासिल की है जब इस प्रोटोकॉल के बाद कर रहे हैं। इस विधि को उचित सामान्य बनाने के लिए एक पर्याप्त तकनीक का वर्णन है जब गैर-समरूप सेल संरचनाओं, जो जब सेल n पर आधारित एक परख का आयोजन ध्यान में रखा जाना चाहिए के साथ काम करने पर ध्यान केंद्रित किया हैभूरा रंग।

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Protocol

सभी अनुसंधान मंजूरी दे दी है और वर्जीनिया टेक IACUC दिशा निर्देशों के तहत आयोजित किया गया

1. तैयार आर-Spondin1 HEK293T-Rspo1 कोशिका लाइन से वातानुकूलित मीडिया

  1. HEK293T-Rspondin1 कोशिकाओं की पीढ़ी पहले 10 में वर्णित किया गया है। बीज HEK293T-Rspondin1 कोशिकाओं 5-10% confluency पर 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 कोशिकाओं 1x Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 40 मिलीलीटर + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (साथ स्रावित, लगभग, एक टी-175 फ्लास्क में एफबीएस) विकास मीडिया के रूप में, और 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
    नोट: HEK293T-Rspondin1 स्रावित कोशिकाओं आर-spondin1 वातानुकूलित मीडिया के रूप में काम करेगा के लिए विकास मीडिया। आर-spondin1 वैकल्पिक रूप से 500 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में इस्तेमाल एक पुनः संयोजक वृद्धि कारक के रूप में खरीदा जा सकता है।
  2. सात दिनों के लिए या उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित 95% confluency तक पहुँचने तक HEK293T-Rspondin1 कोशिकाओं को विकसित। एक 50 वातानुकूलित मीडिया और हस्तांतरण के 40 मिलीलीटर हार्वेस्टमिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब। HEK293T-Rspondin1 स्रावित कोशिकाओं की टी-175 कुप्पी त्यागें।
  3. अपकेंद्रित्र ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर वातानुकूलित मीडिया वाले सेलुलर मलबे गोली। सतह पर तैरनेवाला लीजिए, 15 मिलीलीटर ट्यूबों में आर-spondin1 वातानुकूलित मीडिया, और विभाज्य करार दिया। अल्पकालिक या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots।
    नोट: एक बार thawed, आर Spondin1 वातानुकूलित मीडिया 1 सप्ताह एक 4 डिग्री सेल्सियस तक संग्रहित किया जा सकता है।

2. organoid वृद्धि मीडिया की तैयारी और कटाई छोटे आंतों तहखाने के लिए अभिकर्मकों  

  1. एक दिवसीय कटाई करने से पहले, बर्फ पर जमे हुए प्रोटीन मैट्रिक्स जगह और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पिघलना। कैंची, संदंश और गिलास स्लाइड कि तहखाना फसल के लिए इस्तेमाल किया जाएगा विदारक आटोक्लेव।
  2. अगले दिन, 1x डीएम के 40 मिलीलीटर के लिए शेयर सांद्रता जोड़कर आपूर्ति करता है और वृद्धि कारकों युक्त organoid विकास मीडिया के 40 मिलीलीटर की तैयारी द्वारा शुरूईएम / F-12। मीडिया की खुराक होते हैं: 10 मिमी 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-YL] ethanesulfonic एसिड (HEPES) - 400 μl, 1x glutamine पूरक - 400 μl, 1x B27 विटामिन ए के बिना - 400 μl, 1x एन 2 - 200 μl, 1 मिमी एन एसिटाइल सिस्टीन - 40 μl, 100 एनजी / एमएल एम नोगिन - 40 μl, 50 एनजी / एमएल एम EGF - 4 μl और उपयोग जब तक एक 37 सी नहाने के पानी में जगह। एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए आर-spondin1 की एक 15 मिलीलीटर विभाज्य गर्म।
  3. गर्म तीन बाँझ 24 अच्छी तरह से 37 डिग्री सेल्सियस तक कम से कम 30 मिनट के लिए एक मशीन में रखकर प्लेटें। 4 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रति माउस 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) + 2 मिमी ethylenediamine tetraacetic एसिड (EDTA) और शांत 50 मिलीलीटर की तैयारी। 1x पीबीएस 10% FBS और 4 डिग्री सेल्सियस तक शांत युक्त माउस प्रति 100 मिलीलीटर की तैयारी।

Organoid संस्कृति 1 के लिए 3. कटाई मस मस्कुलस छोटे आंतों तहखाने

  1. एक पुरुष C57B6 / जम्मू माउस आयु उम्र के 6-12 हफ्तों के मानक कृंतक चाउ और उपलब्ध पानी पर उठाया बलिदानजी भरकर संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार। सीओ के माध्यम से Euthanize 2 asphyxiation ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पीछा किया।
    ध्यान दें: ऊतक फसल जब तक बर्फ पर शव रखें और संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में ऊतक फसल प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: एक पुरुष या महिला माउस organoids उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. (वैकल्पिक) 70% इथेनॉल में submersing पहले फर दूर करने के लिए माउस दाढ़ी। 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में माउस डुबोना और माउस बोर्ड को छूने के पृष्ठीय पक्ष के साथ बोर्ड लगाए करने के लिए हाथ-पैर पिन।
  3. का प्रयोग पूर्व निष्फल माउस के उदर भाग पर एक मध्य लाइन चीरा बनाने के लिए कैंची और संदंश विदारक। जननांग गर्दन के आधार करने के कपाल पर आगे बढ़ने से चीरा। चिमटी के साथ laterally त्वचा चीरा खोलें और पेरिटोनियम बेनकाब करने के लिए लगाए बोर्ड को त्वचा पिन।
  4. कैंची विदारक के साथ पेट की पेरिटोनियम में एक मध्य लाइन चीरा और वें गुनाआदेश पेट अंगों को बेनकाब करने में laterally संदंश और लगाए बोर्ड को पिन के साथ ई पेरिटोनियम।
    ध्यान दें: पेट अंगों को काटने से बचने के लिए ध्यान रखना।
  5. पेट और बाहर का काएकुम से जुड़े जंक्शन से जुड़ा छोटी आंत के समीपस्थ जंक्शन काटने से संदंश और कैंची विदारक के साथ पेट की गुहा से छोटी आंत निकालें। पीबीएस 1x बर्फ के ठंडे के 10 मिलीग्राम से युक्त एक बाँझ पेट्री डिश में छोटी आंत रखें।
  6. सामग्री पीबीएस 1x बर्फ के ठंडे 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग के साथ छोटी आंत के लुमेन के भीतर निहित फ्लश। इस चरण को दोहराएँ जब तक छोटी आंत के लुमेन के भीतर मलबा हटा दिया जाता है।
  7. 3-4 लगभग बराबर लंबाई स्ट्रिप्स में कैंची विदारक साथ छोटी आंत कट और longitudinally एक नया बाँझ पेट्री डिश पर स्ट्रिप्स करना। प्रत्येक पट्टी के लिए, एक चीरा पूरी लंबाई ओ बनाने के लिए छोटी आंत के लुमेन अंदर विदारक कैंची की धार डालनेपट्टी च। संदंश का प्रयोग करें laterally आदेश छोटी आंत के लुमेन को बेनकाब करने में चीरा खुला गुना करने के लिए।
  8. एक बाँझ गिलास स्लाइड का प्रयोग धीरे छोटी आंत के ल्यूमिनल सतह पर विल्ली दूर परिमार्जन करने के लिए। विदारक कैंची के साथ 1-2 सेमी लंबाई स्ट्रिप्स में छोटी आंत कट और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार पीबीएस 1x 10 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे युक्त ट्यूब करने के लिए इन स्ट्रिप्स हस्तांतरण।
  9. सामग्री 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब inverting द्वारा धीरे मिक्स और ऊतक सामग्री 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं। 1x पीबीएस Aspirate और पीबीएस 1x बर्फ के ठंडे के 10 मिलीलीटर के साथ ऊतक धोने से इस तीन बार दोहराएँ। अंतिम धोने पर पीबीएस 1x 10 मिलीलीटर और छोटी आंत ऊतक खंडों से युक्त 10 मिनट के लिए बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूब छोड़ दें।
  10. 1x पीबीएस Aspirate और 1x पीबीएस + 2 मिमी EDTA के 25 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए या एक बर्फ बाल्टी में एक कमाल मंच पर रखें। ऊतक incubating है, वहीं छह से 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों लेबल "अंश # 1-6।"
  11. ऊतक सामग्री ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें। निकालें और ट्यूब 15 मिलीलीटर लेबल "अंश 1" शंक्वाकार स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। 1x पीबीएस + 10% FBS कदम (3.11) पाँच बार दोहराएँ और मिलाते हुए उचित लेबल अंश ट्यूब करने के क्रम में सतह पर तैरनेवाला सामग्री को स्थानांतरित।
  12. 5 मिनट के लिए 125 XG पर अपकेंद्रित्र। 5 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend छर्रों Aspirate पूर्व गर्म 1x DMEM / F-12, कोई विकास कारकों के साथ जोड़ा जाता है।
  13. 2 मिनट के लिए 78 XG पर अपकेंद्रित्र। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला के 4 मिलीलीटर और शेष मीडिया के 1 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली resuspend।
  14. प्रत्येक अंश से 20 मिलीलीटर निकालें और एक गिलास स्लाइड में जोड़ें। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे तहखाने और मलबे कल्पना और जो अंशों गठबंधन करने के लिए निर्धारित है और सबसे बड़ी Perce प्राप्त करने के लिए तदनुसार पूलमलबे के अनुपात में तहखाने की ntage।
    नोट: भिन्न 2-6 उपज तहखाने का सबसे बड़ा प्रतिशत चढ़ाया जा सके। पूल के अंशों को सबसे अधिक बार अंश 4, और 5 अंश अंश 6 के साथ साथ अंश 3 रहे हैं।
  15. अपकेंद्रित्र अंशों 5 मिनट के लिए 125 XG पर चढ़ाया जाए। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला गोली ऊपर शेष 50-100 μl छोड़ने।
  16. बर्फ पर ट्यूबों रखें और जमा भिन्न करने के लिए प्रोटीन मैट्रिक्स के 1 मिलीलीटर जोड़ें। Pipet और धीरे धीरे नीचे हवा के बुलबुले के अलावा रोकने के लिए।
  17. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से पूर्व गर्म 24 अच्छी तरह प्लेटें निकालें और अच्छी तरह से प्रत्येक के बीच में प्रोटीन मैट्रिक्स / तहखाना निलंबन के 50 μl जोड़ें। 10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर वरीयता प्राप्त प्लेट स्थानांतरण प्रोटीन मैट्रिक्स बूंद जमना करने की अनुमति।
  18. पहले से तैयार organoid विकास मीडिया + आर-spondin1 के 50 μl प्रति अच्छी तरह से वातानुकूलित मीडिया के 450 μl जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 रातोंरात प्लेटें सेते हैं।
  19. आर-spondin1 वातानुकूलित दवा के 50-100 μl जोड़ेअच्छी तरह से दैनिक प्रति एक। हर 3 दिन के हौसले से तैयार organoid विकास मीडिया के 450 μl / अच्छी तरह से कदम 2.2 में वर्णित के साथ पूरे organoid विकास मीडिया की जगह। इसके अतिरिक्त प्रति अच्छी तरह से आर-spondin1 वातानुकूलित मीडिया के 50-100 μl जोड़ें।
    नोट: प्रोटीन मैट्रिक्स ड्रॉप एक सप्ताह के लिए अपनी अखंडता को बनाए रखता है, लेकिन 7 दिनों के बाद passaging organoids करने के लिए आगे बढ़ें।

4. Passaging Organoids हर 7 वें दिन

  1. 4 डिग्री सेल्सियस passaging पहले दिन पर बर्फ रातोंरात पर प्रोटीन मैट्रिक्स गला लें। कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली। organoid विकास मीडिया कदम 2.2 में वर्णित तैयार है और उपयोग जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
  2. इनक्यूबेटर से organoid थाली निकालें और बर्फ पर थाली के passaging शुरू। 3-4 कुओं से एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ महाप्राण विकास मीडिया शुरू करने के लिए।
    नोट: 10 मिलीलीटर पिपेट में aspirated मीडिया रखने के रूप में इस अगले चरण में प्रोटीन मैट्रिक्स बूंद को बेदखल करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  3. के रूप मेंपायरेटेड कुओं, पिपेट ऊपर और नीचे के क्रम में थाली से प्रोटीन मैट्रिक्स बूंद को बेदखल करने के लिए। एक 10 मिलीलीटर पिपेट की नोक के साथ कोमल scraping प्रोटीन मैट्रिक्स बूंद dislodging में सहायक है। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सामग्री हस्तांतरण।
  4. 15 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 125 XG पर 10 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूबों सेते हैं। शंक्वाकार ट्यूब के नीचे एक सफेद गोली का निरीक्षण करें। धीरे aspirate और organoid गोली गोली ऊपर 100-200 μl छोड़ने ऊपर सतह पर तैरनेवाला / पुराने organoid विकास मीडिया के बहुमत त्यागें।
  5. एक 23 गेज सुई एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी का उपयोग करके organoid तहखाने टूट गया। महाप्राण और व्यवस्था तहखाने को अलग कर देना करने के लिए 10-15 बार बाहर निकालें। अत्यधिक pipetting के कारण एयर बबल गठन को कम।
  6. प्रोटीन मैट्रिक्स के 500 μl में organoids Resuspend और एक नया पूर्व गर्म 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 50 μl जोड़ें। पहले से तैयार organoid विकास मीडिया के 450 μl जोड़े आर-spondin1 के 50 μlअच्छी तरह से प्रति वातानुकूलित मीडिया। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।

5. चढ़ाना Organoids PAMPs और जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के लिए लिस्टेरिया monocytogenes के साथ पैटर्न पहचान रिसेप्टर उत्तेजना के लिए 14 दिन पर

  1. दो दिन बाहर एल चुनौती देने के लिए, लकीर से पहले एक BHI अगर प्लेट पर monocytogenes।
  2. अगले दिन एक एल लेने कॉलोनी monocytogenes और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर BHI शोरबा के 10 मिलीलीटर में बढ़ने 200 rpm पर मिलाते हुए।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस organoid चुनौती से पहले दिन में बर्फ रातोंरात पर प्रोटीन मैट्रिक्स गला लें। कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली। organoid विकास मीडिया कदम 2.2 में वर्णित तैयार है और उपयोग जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
  4. इनक्यूबेटर से organoid संस्कृति निकालें और organoids के passaging शुरू।
  5. 3-4 कुओं से महाप्राण मीडिया और 10 मिलीलीटर pipete में aspirated मीडिया रखने के रूप में इस प्रोटीन मैट्रिक्स बूंद को बेदखल करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। ऊपर पिपेट औरआदेश की थाली से प्रोटीन मैट्रिक्स बूंद को बेदखल करने के लिए नीचे। एक 10 मिलीलीटर पिपेट की नोक के साथ कोमल scraping प्रोटीन मैट्रिक्स बूंद dislodging में सहायक है। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सामग्री हस्तांतरण।
  6. 10 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूबों सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 125 XG पर अपकेंद्रित्र। शंक्वाकार ट्यूब के नीचे एक सफेद गोली का निरीक्षण करें। धीरे सतह पर तैरनेवाला के पीछे अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला के लगभग 100 μl छोड़ने aspirate।
  7. पीबीएस 1x बर्फ के ठंडे के 5 मिलीलीटर में organoid गोली Resuspend और उनकी गिनती के लिए एक 10 μl विभाज्य को हटा दें। गिलास को कवर पर्ची के बिना एक hemocytometer के बीच करने के लिए 10 μl विभाज्य जोड़ें। धीरे बूंद के शीर्ष पर गिलास coverslip उपरिशायी।
    ध्यान दें: hemocytometer organoids साथ रोकना होगा यदि गिलास स्लाइड पहले हटा नहीं है।
  8. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के माध्यम से organoids की कुल संख्या की गणना हर ग्रिड में / hemocytometer की पूरी कक्ष और organoid एकाग्रता का निर्धारण: NUMकुल organoids की संख्या 10 μl प्रति गिना।
  9. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कि organoids की पर्याप्त संख्या परख और सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 125 XG पर इस निलंबन के लिए वरीयता प्राप्त करने की अनुमति देगा से एक उचित मात्रा निकालें।
    नोट: एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 40-100 organoids के बीच सीमा शाही सेना के विश्लेषण के लिए पर्याप्त है। ठेठ organoid आकार व्यास में 300 माइक्रोन से 1000 माइक्रोन से लेकर कर सकते हैं।
  10. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और हवा के बुलबुले पैदा करने के बिना प्रोटीन मैट्रिक्स की 500 मिलीलीटर में गोली resuspend। एक 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति organoid / प्रोटीन मैट्रिक्स निलंबन के 50 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: organoids resuspend करने के लिए उपचार की स्थिति और तकनीकी प्रतिकृति की संख्या के लिए अलग-अलग होगा इस्तेमाल किया प्रोटीन मैट्रिक्स की राशि।
  11. प्रत्येक अच्छी तरह से (बिना एन एसिटाइल सिस्टीन) organoid विकास मीडिया के 500 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
  12. PAMPs की 2x सांद्रता तैयार (यानी flagellin,lipopolysaccharide) और एल रहते हैं monocytogenes। लाइव एल के आयुध डिपो उपाय monocytogenes और गिनती के लिए एक BHI प्लेट पर स्टेक। 1 एक्स 10 6 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) / मिलीलीटर में organoids समझो।
    नोट: CFU निर्धारण करने के लिए आयुध डिपो बैक्टीरिया टाइप करें और उत्तेजना organoid करने से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए द्वारा अलग अलग होंगे। उदाहरण के लिए, 0.6 ≈ 1 एक्स 10 9 CFU / एल के लिए ML के एक आयुध डिपो monocytogenes, लेकिन यह भी स्वतंत्र रूप से प्रयोग करने से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
  13. बाहर एल के इलाज के स्टॉक से एक धारावाहिक कमजोर पड़ने स्ट्रीक monocytogenes सही उपचार CFU / एमएल निर्धारित करने के लिए। लेखकों पाते हैं कि एक BHI अगर प्लेट पर 100 μl की एक 1 एक्स 10 8 कमजोर पड़ने के लिए एक सटीक CFU / एमएल निर्धारित करने के लिए कालोनियों गिनती करने के लिए पर्याप्त है।
  14. एल के एक गर्मी की मौत हो समाधान तैयार लाइव एल के 1 मिलीलीटर विभाज्य लेने के द्वारा monocytogenes 10 मिनट के लिए 5000 XG पर समाधान और सेंट्रीफ्यूज monocytogenes। सतह पर तैरनेवाला और धोने Aspirate1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ बैक्टीरिया गोली।
    1. एल अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 5000 XG पर monocytogenes और 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend। गर्मी एल मारने 1 घंटे के लिए 80-90 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने से एक 1.7 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में monocytogenes। संस्कृति गर्मी की 100 μl विभाज्य एल मारे गए एक BHI अगर प्लेट पर monocytogenes पुष्टि करने के लिए कोई जीवित बैक्टीरिया रहते हैं।
    2. उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित नामित कुओं में 500 μl निवासी मीडिया को उचित 2x पीएएमपी और / या सूक्ष्म जीव उपचार के 500 μl जोड़ें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
      नोट: निवासी मीडिया के 500 μl के लिए एक 2x पीएएमपी / सूक्ष्म जीव उपचार के लिए एक 500 μl विभाज्य जोड़ना 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा में 1x को उपचार एकाग्रता लाएगा।
  15. अगले दिन, मैन्युअल एल गिनती उपचार CFU / एमएल का सही निर्धारण के लिए कालोनियों monocytogenes। इलाज किया organoids की थाली से महाप्राण मीडिया और कुओं टी धोने1x पीबीएस के साथ hree बार।
  16. फिनोल / क्लोरोफॉर्म 11 या निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार एक शाही सेना निकासी किट के माध्यम से शाही सेना निकासी के लिए आगे बढ़ें। मानक QRT- पीसीआर 12 का उपयोग जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन।

6. चढ़ाना Organoids पीएएमपी और सतह पर तैरनेवाला में प्रोटीन विश्लेषण के लिए एल monocytogenes चैलेंज के लिए 14 दिन पर

  1. चुनौती देने से दो दिन पहले, Caco -2 कोशिकाओं के एक सेल संस्कृति, बोने घनत्व 1x DMEM + 20% FBS के साथ एक टी -75 फ्लास्क में ≈1 x 10 6 कोशिकाओं को शुरू करने और 37 डिग्री सेल्सियस + 5 पर Caco-2 कोशिकाओं सेते % सीओ 2। एल के एक जीवाणु संस्कृति शुरू BHI प्लेट पर monocytogenes और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक जीवाणु इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं।
  2. अगले दिन एक एल लेने कॉलोनी monocytogenes और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर BHI शोरबा के 10 मिलीलीटर में हो जाना। 4 डिग्री सेल्सियस organoid चुनौती से पहले दिन में बर्फ रातोंरात पर प्रोटीन मैट्रिक्स गला लें।
  3. अगले दिन गर्म एक बाँझ 96 अच्छी तरह से काले रंग की दीवारोंकम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए थाली। एन एसिटाइल सिस्टीन कदम 2.2 में वर्णित और उपयोग जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने के बिना organoid विकास मीडिया तैयार करें। इनक्यूबेटर से organoid संस्कृति निकालें और organoids के passaging शुरू।
    नोट: ठेठ organoid आकार व्यास में 300 माइक्रोन से 1000 माइक्रोन से लेकर कर सकते हैं।
  4. 3-4 कुओं से महाप्राण मीडिया और 10 मिलीलीटर pipete में aspirated मीडिया रखने के रूप में इस प्रोटीन मैट्रिक्स बूंद को बेदखल करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। आदेश की थाली से प्रोटीन मैट्रिक्स बूंद को बेदखल करने के लिए एक विंदुक के साथ Resuspend। एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ कोमल scraping प्रोटीन मैट्रिक्स बूंद dislodging में सहायक है। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सामग्री हस्तांतरण।
  5. 10 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूबों सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 125 XG पर अपकेंद्रित्र। शंक्वाकार ट्यूब के नीचे एक सफेद गोली का निरीक्षण करें। धीरे सतह पर तैरनेवाला के पीछे अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला के 100 μl छोड़ने aspirate।
  6. बर्फ के ठंडे की 5ml में organoid गोली Resuspend1x पीबीएस और उनकी गिनती के लिए एक 10 μl विभाज्य को हटा दें। एक hemocytometer के बीच करने के लिए 10 μl विभाज्य जोड़ें और धीरे गिलास coverslip उपरिशायी।
    ध्यान दें: hemocytometer organoids साथ रोकना होगा यदि गिलास स्लाइड पहले हटा नहीं है।
  7. hemocytometer / पूरे चैम्बर के हर ग्रिड में एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के माध्यम से organoids की कुल संख्या की गणना और organoid एकाग्रता का निर्धारण: 10 मिलीलीटर प्रति गिना कुल organoids की संख्या।
  8. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कि organoids की पर्याप्त संख्या परख और सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 125 XG पर इस निलंबन के लिए वरीयता प्राप्त करने की अनुमति देगा से एक उचित मात्रा निकालें।
    नोट: organoids resuspend करने के लिए उपचार की स्थिति और तकनीकी प्रतिकृति की राशि के लिए अलग-अलग होगा इस्तेमाल किया प्रोटीन मैट्रिक्स की राशि। लेखकों पाते हैं कि 40-100 organoids secreted प्रोटीन विश्लेषण के लिए पर्याप्त है।
  9. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पैदा करने के बिना / अच्छी तरह से प्रोटीन मैट्रिक्स के 500 μl में गोली resuspendहवा के बुलबुले।
    नोट: organoids resuspend करने के लिए उपचार की स्थिति और तकनीकी प्रतिकृति की राशि के लिए अलग-अलग होगा इस्तेमाल किया प्रोटीन मैट्रिक्स की राशि।
  10. कम से कम दो कॉलम 96 में अच्छी तरह से काले रंग की दीवारों टिशू कल्चर प्लेट के रूप में के रूप में इन कुओं एक मानक वक्र की पीढ़ी के लिए Caco-2 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त सेवा करेंगे पर खाली छोड़ दें। अच्छी तरह से प्रति एक पूर्व गर्म 96 अच्छी तरह से काले रंग की दीवारों टिशू कल्चर प्लेट के लिए प्रोटीन मैट्रिक्स + organoid निलंबन के 50 μl जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के प्लेट प्रोटीन मैट्रिक्स जमना करने की अनुमति के लिए दुकान।
  11. प्रत्येक अच्छी तरह से (बिना एन एसिटाइल सिस्टीन) organoid विकास मीडिया के 100 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस + 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
  12. PAMPs की 2x सांद्रता को तैयार है और एल रहते हैं monocytogenes। अच्छी तरह से प्रति प्रत्येक दिया उपचार हालत की 100 मिलीलीटर जोड़ें और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
  13. अगले दिन प्लेट Caco -2 मानक वक्र कुओं में कोशिकाओं। बाँझ 1x पीबीएस, 0.25% trypsin और 1x DMEM + 20% FBS टी वार्मिंग से शुरूओ 37 डिग्री सेल्सियस।
  14. Caco -2 कोशिकाओं से युक्त टी -75 फ्लास्क निकालें और सेल संस्कृति मीडिया aspirate। पीबीएस 1x 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें। महाप्राण 1x पीबीएस, 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2 मिलीलीटर 0.25% trypsin और जगह टी -75 फ्लास्क जोड़ें।
  15. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कुप्पी कल्पना सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं तो अलग Caco -2 कोशिकाओं को 1x DMEM + 20% FBS के 8 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित को अलग किया है। एक 10 μl विभाज्य निकालें और एक hemocytometer का उपयोग प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की गिनती।
    नोट: 60,000 कोशिकाओं और dilutions / अच्छी तरह से अच्छी तरह से काम की एक ऊपरी सेल नंबर / अच्छी तरह से 2500 कोशिकाओं के लिए नीचे मानक वक्र की पीढ़ी के लिए आयोजित किया जा सकता है।
  16. प्रोटीन मैट्रिक्स में Caco -2 कोशिकाओं resuspend और उचित कुओं के लिए अच्छी तरह से प्रति 50 μl जोड़ें। प्रोटीन मैट्रिक्स Caco -2 कोशिकाओं के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जमना करने की अनुमति दें।
    नोट: Caco -2 कोशिकाओं के लिए ग्रोथ मीडिया प्रोटीन मैट्रिक्स के solidification निम्नलिखित जोड़े जाने की जरूरत नहीं है।
  17. निम्नलिखितorganoid परख, महाप्राण के लिए 24 घंटा उपचार समय और organoid सेलुलर सतह पर तैरनेवाला मीडिया बचाने के लिए और बर्फ पर रख। कुओं 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। प्रत्येक अच्छी तरह से Caco -2 मानक वक्र कुओं सहित 100% मेथनॉल के 100 μl जोड़ें और 20-30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या बर्फ पर सेते organoids ठीक करने के लिए।
    नोट: यह आवश्यक नहीं है कि Caco -2 मानक वक्र कुओं 1x पीबीएस के साथ धोया जा के रूप में वे मेथनॉल सीधे जोड़ लिया जा सकता है।
  18. मेथनॉल ऊष्मायन के बाद, पीबीएस 1x बर्फ के ठंडे साथ कुओं तीन बार धोएं। 1-2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली स्टोर।
  19. 1 माइक्रोग्राम की एकाग्रता में परमाणु धुंधला डाई जोड़ें / मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली को कवर किया और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  20. परमाणु धुंधला डाई / उत्तेजना उत्सर्जन (350nm / 461nm क्रमशः) को मापने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली पाठक का प्रयोग करें और के मानक के अनुसार प्रत्येक organoid अच्छी तरह Caco-2 कोशिकाओं के मानक वक्र करने के लिए।
  21. ऐसे एलिसा के रूप में नीचे की ओर assays, के लिए आगे बढ़ें

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Representative Results

जब पेट के organoids खेती करने के लिए इस प्रोटोकॉल के बाद, विशेषता क्षेत्र आकार का organoids कटाई के बाद उपस्थित रहेंगे। आर-spondin1 वातानुकूलित मीडिया के अलावा दैनिक विकास और organoids की नवोदित आरंभ हो जाएगा। Organoids के विकास चित्रा 1 ए में दिखाया गया है - एफ, और दिनों के लिए 1, 2, 4, 5, 6 और दिन पर आंतों organoids का प्रतिनिधि है 14. चित्रा 1F 14 दिन पर organoids की गैर सजातीय विकास विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करता है।

एक बार जब organoids एक पर्याप्त संख्या के लिए बड़े हो रहे हैं, वे replated और विभिन्न PAMPs और / या रोगाणुओं के साथ चुनौती दी जा सकती है। अभिव्यक्ति विश्लेषण मानक तकनीक के माध्यम से किया जा सकता है। यह जो भड़काऊ साइटोकिन्स आईएल 18, आईएल -6, और TNFα जो एक के बाद विश्लेषण किया गया की mRNA अभिव्यक्ति से पता चलता चित्रा 2A सी में प्रतिनिधित्व किया हैगर्मी के साथ organoids के 24 घंटा चुनौती एल मारे गए monocytogenes और पीएएमपी flagellin। mRNA अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए तर्क आईएल 18 साइटोकिन्स, आईएल -6, और TNFα कि इन रोगजनक चुनौती के जवाब में उपकला कोशिकाओं द्वारा संग्राहक की जा रही के लिए अच्छा उम्मीदवार थे, और इन भड़काऊ साइटोकिन्स के मॉडुलन तकनीक के प्रभाव को प्रदर्शित होगी।

चित्रा 3 ए - सी परमाणु धुंधला डाई निवासी प्रोटीन मैट्रिक्स में मलबे के कम से कम पृष्ठभूमि धुंधला के साथ निर्धारण निम्नलिखित के साथ आंतों organoids के रिश्तेदार परमाणु धुंधला दर्शाता है। निर्धारण और धुंधला करने का यह तरीका assays, जो अच्छी तरह से प्रत्येक में सेल नंबर भिन्न करने के लिए खाते में जाएगा सामान्य करने के लिए लागू किया जा सकता है। इस चित्रा 4 में स्पष्ट है जब Caco -2 प्रोटीन मैट्रिक्स में चढ़ाया कोशिकाओं के धारावाहिक dilutions का एक मानक वक्र पैदा कर रहा है, तो तय है और परमाणु के साथ दागधुंधला डाई। 0.89 के आर 2 मूल्य सेल संख्या के बीच एक रैखिक संबंध का संकेत है और फ्लोरोसेंट तीव्रता मतलब है, और रेखीय समीकरण सेल नंबर करने के लिए organoids सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मानक वक्र चित्रा 4 में दिखाया गया है अच्छी तरह से प्रति 30,000 कोशिकाओं से परे संतृप्ति सीमा तक पहुंचने के लिए शुरू होता है। अच्छी तरह से प्रति 30,000 कोशिकाओं के ऊपर कोशिकाओं की एक अनुमापन 4 चित्र में दिखाया गया है परमाणु धुंधला डाई की संतृप्ति श्रेणी में शामिल करने के लिए। सामान्य बनाने की वृद्धि की सटीकता कि परमाणु धुंधला डाई के रैखिक सीमा को दर्शाता से पहले संतृप्ति सीमा तक पहुँच जाता है एक सेल नंबर के साथ प्राप्त किया जाएगा।

आकृति 1
चित्रा 1:। अलगाव के बाद murine छोटी आंत निकाली गई organoids के लिए विकास की छोटी आंतों organoid विकास समय पाठ्यक्रम। (ए) दिवस 1. (बी) 2 दिवस (सी) दिवस 4. (डी) दिवस 5. (ई) दिवस 6. (एफ) दिवस 14. छवियों प्रत्येक दिन के लिए दिए गए organoid विकास के प्रतिनिधि हैं। स्केल सलाखों ए के लिए छोड़ दिया छवि में 200 माइक्रोन के बराबर, बी, सी, डी, ई और स्केल सलाखों ए, बी, सी, डी, ई और स्केल सलाखों के लिए सही छवि में बराबर 100 माइक्रोन के बराबर 1,000 मीटर और 200 माइक्रोन एफ के लिए छोड़ दिया और सही छवियों के लिए, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: 24 घंटा PAMP चैलेंज के बाद भड़काऊ साइटोकिन्स के mRNA अभिव्यक्ति PAMPs और गर्मी की मौत हो लिस्टेरिया monocytogenes के साथ 24 घंटे के लिए चुनौती दी प्रकार के जंगली आंतों organoids के सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति (ए - सी) मैं के गुना परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करते हैं।। nflammatory साइटोकिन्स आईएल 18, आईएल -6 और TNFα क्रमशः। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सामान्य बनाने के लिए Organoids के सापेक्ष फ्लोरोसेंट धुंधला निर्धारण निम्नलिखित के साथ organoids के परमाणु धुंधला।। (ए) organoids के उज्ज्वल क्षेत्र। (बी) परमाणु धुंधला डाई के साथ organoids की फ्लोरोसेंट धुंधला। (सी) उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट धुंधला के मर्ज किए गए छवि। स्केल सलाखों सभी छवियों में 400 माइक्रोन के बराबर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"> चित्रा 4
चित्रा 4: मानक Caco -2 कोशिकाओं से उत्पन्न वक्र स्टैंडर्ड तीन प्रतियों कुओं से उत्पन्न वक्र।। सेल बोने अच्छी तरह से प्रति 2,500 कोशिकाओं के लिए नीचे dilutions के साथ अच्छी तरह से प्रति 60,000 कोशिकाओं में शुरू एक सीमा थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। प्रोटोकॉल आरेख का अवलोकन 1-शीर्ष व्यक्ति के पैनल आर-spondin1 वातानुकूलित मीडिया कटाई को दिखाता है। चित्रा के 2-मध्यम पैनल प्रोटोकॉल फसल के लिए और संस्कृति माउस छोटी आंतों organoids के पहलुओं को दिखाता है। चित्रा के 3-नीचे पैनल दिखाता है: (ए) 14 दिन सुसंस्कृत organoids के चढ़ाना। (बी) PAMPs / एल के साथ चैलेंजmonocytogenes, और खाली कुओं को छोड़ने के लिए एक मानक वक्र पहले से खाली कुओं में Caco-2 कोशिकाओं के चढ़ाना उत्पन्न करने के लिए। (सी) पीएएमपी चुनौती के बाद, एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए। (डी) निर्धारण और एक परमाणु धुंधला डाई के अलावा के बाद, कुओं और एक मानक वक्र के खिलाफ सामान्य की उत्तेजना / उत्सर्जन मापने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

संस्कृति और आंतों organoids के रखरखाव के लिए एक प्रक्रिया है कि पर्याप्त मात्रा में टिशू कल्चर तकनीक के साथ किसी भी व्यक्ति द्वारा महारत हासिल किया जा सकता है। वहाँ बारीकियों passaging में जब एक और अधिक परंपरागत monolayer में कोशिकाओं की तुलना में बढ़ रही हैं, लेकिन इन बारीकियों पर काबू पाने के लिए मुश्किल नहीं कर रहे हैं। इस पद्धति का महत्वपूर्ण कदम इष्टतम बोने के लिए एक उच्च पर्याप्त घनत्व के organoids विकसित करने के लिए सक्षम होने के नाते शामिल है। प्रयोगों organoids के साथ नीचे पहुंचा जाना चाहिए के रूप में बड़े बोने घनत्व है कि आमतौर पर सेल लाइनों के साथ प्राप्त किया जा सकता व्यावहारिक नहीं हैं। यह विशेष रूप से स्पष्ट हो जाता है जब वहाँ कई उपचार समूह हैं।

इस प्रोटोकॉल, विभिन्न जीवाणु की एक किस्म के साथ आंतों उपकला के मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक कदम-दर-कदम विधि प्रदान करने का इरादा है वायरल, फंगल और रोगजनकों, साथ ही पता कठिनाइयों सामान्य बनाने के संबंध में इस प्रणाली का उपयोग। रिपोर्ट उपलब्ध हैं कि describई जीवाणु रोगज़नक़ साल्मोनेला के साथ आंतों organoids की बातचीत, फिर भी जब स्रावित साइटोकिन्स 13 मापने सामान्य बनाने के तरीकों का पता नहीं है।

वहाँ कई कठिनाइयों है कि जब विभिन्न तरीकों से organoid संस्कृतियों को सामान्य बनाने का सामना कर रहे हैं। bicinchoninic एसिड परख के माध्यम से स्रावित प्रोटीन सामान्य (बीसीए) एक विकल्प है; हालांकि, विकास घटकों organoid संस्कृति के लिए आवश्यक (एन 2 और / या विटामिन B27) बीसीए परख के साथ हस्तक्षेप सेलुलर व्यवहार्यता के माध्यम से इस तरह के एक संशोधित MTT परख वर्णित किया गया है 14 के रूप में (डेटा) नहीं दिखाया सामान्य,। हालांकि, एक इलाज है कि organoids की mitochondrial चयापचय गतिविधि बदल जाएगा MTT के रूप में इस तकनीक के माध्यम से सामान्य बनाने के लिए एक गलत विधि का परिचय देंगे mitochondrial डीहाइड्रोजनेज 15 की कार्रवाई से कमी पर आधारित है। यह भी मीडिया से एन एसिटाइल सिस्टीन (एनएसी) को हटाने के लिए, पर जरूरी नहीं हैLy यदि MTT तकनीक के माध्यम से सामान्य बनाने की इच्छा है, लेकिन एनएसी के रूप में एक जीवाणु रोगज़नक़ के साथ इलाज बैक्टीरिया विकास 16 को बाधित कर सकते हैं।

इस तकनीक का लाभ कर रहे हैं कि secreted साइटोकिन्स और organoids से प्रोटीन उत्पादों अब Caco-2 कोशिकाओं का एक मानक वक्र के खिलाफ सामान्यीकृत हो सकता है। इस तकनीक की सीमाएं हैं कि सामान्य बनाने correlative है क्योंकि गैर तब्दील प्राथमिक उपकला organoids के परमाणु धुंधला एक पेट के कैंसर कोशिका लाइन के परमाणु धुंधला के खिलाफ सामान्यीकृत कर रहे हैं। लेखकों लगाने के परमाणु साथ मेथनॉल और धुंधला नाभिक के साथ फिक्सिंग कि डाई धुंधला Caco-2 कोशिकाओं का एक मानक वक्र के खिलाफ एक प्रभावी सामान्य बनाने की तकनीक है। इस पेट के कैंसर सेल लाइन के विकास विशेषताओं बिल्कुल आंतों organoids के विकास विशेषताओं की नकल नहीं है, एक परमाणु दाग ​​का उपयोग कर और मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए एक अच्छी रणनीति कुल सेल नंबर के खिलाफ सामान्य करने के लिए है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11050 (Section 1, 3, 6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo (Section 1, 3)
DMEM GE Healthcare Sh30243.01 (Section 1, 6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. 
50 ml conical tube Falcon 352070 (Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask Corning 431079 (Section 1) Or equivalent brand 
Protein Matrix Corning 356231 (Section 2, 3, 4, 5, 6) Matrigel Growth Factor Reduced 
HyClone Dulbecco's (DPBS) GE Healthcare SH30264.01 (Section 2, 3)
DMEM/F12  Life Technologies 12634-010 (Section 2, 3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates Corning 3524 (Section 2)
N2 Supplement 100x  Life Technologies 17502-048 (Section 2)
B27 without vitamin A 50x  Life Technologies 12587-010  (Section 2)
Trizol Life Technologies 15596-026 (Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax) Life Technologies 35050-061 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M) Life Technologies 15630-080 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 
10 ml Serological Pipet Falcon 357551 (Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin Peprotech 250-38 (Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165 (Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF Biolegend 585608 (Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable Bioexpres (Section 3)
dissecting scissors (Section 3)
forceps (Section 3)
glass slides (Section 3)
dissecting tweezers (Section 3)
25 ml Serological Pipet Falcon (Section 3)
EDTA  Sigma-Aldrich SLBB9821 (Section 3) 0.5 M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 (Section 3) Or equal sized TC dish
1 ml Syringe Becton Dickinson 309659 (Section 4)
Precision Glide Needle Becton Dickinson 305120 (Section 4) 23 G x 1 1/4 (0.6 mm x 30 mm)
Flagellin from Bacillus subtilis Invivogen tlrl-bsfla  (Section 5, 6)
Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Section 5, 6) (Murray et al.) 
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA (Section 5, 6) Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar Becton Dickinson 211065 (Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion Becton Dickinson 237500 (Section 5)
Caco-2 ATCC HTB-37 (Section 6)
Trypsin  gibco 25200056 (Section 6)
Methanol Fisher A412-4 (Section 6)
SpectraMax M5 Molecuar Devices (Section 6)
96 Well Assay Plate Corning 3603 (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye Life Technologies H1399 (Section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask Corning 430641 (Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube Falcon 352096 (Section1, 3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube Bioexpress C-3262-1 Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep Zymo Research R1054 Or equivalent brand
TNF-alpha  Applied Biosystems Mm 00443260_g1 Taqman gene expression assay kit
IL-6  Applied Biosystems (Mm 00446190_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-1beta Applied Biosystems Mm 00434228_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-18 Applied Biosystems Mm 00434225_m1 Taqman gene expression assay kit
18s Applied Biosystems Hs 99999901_s1 Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix Life Technologies 4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies/Applied Biosystems 4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml Life Technologies/Applied Biosystems 4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/ml
chloroform Sigma-Aldrich C7559

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References

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