그만큼
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 3School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Published 5/18/2016
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Immunology and Infection

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Summary

여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.

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Rothschild, D. E., Srinivasan, T., Aponte-Santiago, L. A., Shen, X., Allen, I. C. The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (111), e54033, doi:10.3791/54033 (2016).

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Abstract

기본 장 organoids 크게 점막 면역학 분야에 영향을 미칠 수있는 유용한 모델 시스템이다. 그러나, organoid 성장 특성의 복잡성은 연구자에 대한 상당한주의를 실시하고 있습니다. 특히, 각각의 organoid의 성장 패턴은 매우 다양하며, 문화 상피 세포의 이종 인구를 만듭니다. 이러한주의 사항과 함께, 일반 조직 배양 방법은 단순히 의한 세포 구조의 복잡성으로 organoid 시스템에 적용 할 수 없다. 일부 정규화 기술을 적용하지 않는 계산 및 세포주 개별적으로 분리 된 셀에 대해 공통 셀 번호만을 기준 도금 organoids위한 신뢰할 수있는 방법이 아니다. 총 단백질 함량 정규화 때문에 거주자 단백질 매트릭스 복합체 이루어진다. 분비 된 콘을 평가할 때 세포 수, 형상 및 세포 형태 측면에서 이러한 특성은 고려되어야organoid 질량에서 텐트. 이 프로토콜은 문화 간단한 절차를 간략하게 설명하고 미생물 병원체 및 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가)에 소장 organoids을 치료하기 위해 생성되었습니다. 또한 단백질 분석은 이러한 공격 후 수행 할 때 적용해야 정규화 기술을 강조한다.

Introduction

능력은 수확과 문화 차 organoids 조직 생물학 1-5에 대한보다 생리 학적으로 대표 현상을 이해하는 데 밀접한 흥미로운 발전 소장, 대장, 췌장, 간, 뇌에 대해 설명하고 있습니다되었습니다. 소장 organoids의 문화 및 유지 보수를 설명하는 첫 번째 방법은 사토 등의 알에 의해보고되었다. 한스 Clevers 1의 실험실에서. 이 방법, 수확 및 입증 차 장 상피 세포의 배양에 앞서 제한 상피 세포 성장 유지에 효과가있다. 방법은 궁극적으로 혼합 차 섬유 아세포 (6)의 부산물로 이어질 것 같은 콜라게나 제와 디스 파제 등의 효소와 함께 배양을 통해 조직의 분리를 포함했다. 이러한 조건은 또한 시간은 상피 세포 배양을 지속 제한 될 것이다. 상피 세포로 인해 세포 사멸을 입력으로 더 상피 세포 틈새에 최소가 형성 것적절한 성장 인자 또는 접촉 무결성 손실의 부족 anokis 7 불린다. 입체 · organoid 배양 시스템의 출현은 지속적인 배양 장내 세포 유형의 스펙트럼을 포함하는 일차 배양 장 세포에 대한 방법을 제공했다. 이러한 상피 organoids들은 여러 분화 세포로 구성되어 있음되는 세포주에 비해 많은 장점을 가지고, 그들이보다 생체 8로부터 유도 된 기관을 모방. 과정은 결국 다른 자극 하에서 장내 상피 세포의 반응을 평가하기위한 가치있는 도구임이 입증되었다 "접시 미니 창자 성장"한다. 이러한 고분자 패턴은 호스트와 미생물 9 모두에서 다양한 반응을 조절할 수있는 미생물 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가)와 기본 장 세포의 상호 작용을 조사하는 면역학 분야에 적합하다. 뿐만 아니라 연구자들은 이제 마우스 organoids 이러한 상호 작용을 탐구하지만, 수물론이 같은 사람에서 배양 할 수있다. 이 기술은 극적 맞춤 의약품을 변경할 가능성을 가지고 있으며,이 기술은 가까운 미래에 가능하게하는 것으로 추측 발전 유혹된다.

이 방법의 전체 목표는 다양한 자극과 함께 배양 확장을위한 프로토콜 및 장내 organoids의 치료를 제공하는 것이다. 이러한 자극은 백신, 세균 PAMPs가, 살아있는 병원균, 위장관 (GI) 및 암 치료제에서 궁극적으로 범위 수 있습니다. 마우스 장 organoids의 분리 및 배양 사토 등의 알에서 적응하고있다.이 프로토콜을 다음과 같은 경우, 최종 제품은 문화 organoid되는 것은 여전히 달성 원래의 방법에서 약간의 편차가 있지만. 이 방법은 세포, N에 기초하여 분석을 수행 할 때 고려되어야 비 균일 한 셀 구조, 작업시 적절한 정규화를위한 적절한 기술을 설명하기에 집중엄버.

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Protocol

모든 연구는 승인 버지니아 공대 IACUC 지침에 따라 수행 하였다

1. R-Spondin1이 HEK293T-Rspo1 세포주에서 미디어 금연실 준비

  1. HEK293T-Rspondin1 세포의 생성 이전에 10을 설명 하였다. 시드 HEK293T-Rspondin1은 1X 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM), 40 mL의 + 10 % 태아 소 혈청 (와 T-175 플라스크에서, 약 5-10 %의 컨 플루 언시에 8 × 105 -1.7 × 106 세포를 세포 분비 성장 매체와 같은 FBS), 37 ° C + 5 % CO 2 부화.
    참고 : R-spondin1 에어컨 미디어의 역할을 할 HEK293T-Rspondin1 분비 세포의 성장 미디어. R-spondin1 대안 ng를 500 / ml의 최종 농도로 사용하는 재조합 성장 인자로 구입할 수있다.
  2. 이레 동안 또는 시야 현미경으로 결정된 95 % 포화 상태에 도달 할 때까지 - Rspondin1 HEK293T 세포 성장. 50에 컨디셔닝 미디어 및 전송의 40 ml의 수확ML 원뿔 튜브. HEK293T-Rspondin1 분비 세포의 T-175 플라스크를 폐기하십시오.
  3. 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 에어컨 매체를 포함하는 튜브는 세포 파편 펠렛합니다. 상층 액을 수집, 15 ml의 튜브에 R-spondin1 에어컨 미디어, 나누어지는 불린다. 단기 또는 장기 기억 -80 ° C에 대한 -20 ℃에서 보관 분취.
    참고 : 일단 해동의 R-Spondin1은 에어컨 미디어 1 주에 4 ℃로까지 저장할 수 있습니다.

2. Organoid 성장 미디어의 준비 및 수확 소장 납골당 용 시약  

  1. 한 - 일 이전에 수확에, 얼음에 얼어 붙은 단백질 행렬을 배치하고 4 ℃에서 밤새 해동. 토굴 수확에 사용됩니다 가위, 집게, 유리 슬라이드를 해부 압력솥.
  2. 다음 날, 1X DM 40 ml의 스톡 농도를 첨가하여 보충과 성장 인자를 함유 organoid 성장 배지 40 mL로 제조함으로써 시작EM / F-12. 미디어 보조제가 포함 된 10 mM 2- [4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 일] - 에탄 설 폰산 (HEPES) - 400 μL, 1X 글루타민 보충제 - 400 μL를 1X B27 비타민 A없이 - 400 μL, 1X N2 - 200 μL, 1 mM의 N- 아세틸 시스테인 - 40 μL, 100 NG / ㎖ m-소량 - 40 μL, 50 ng를 / ㎖의 m-EGF - 사용까지 37 O C의 물을 욕조에 4 μl의 장소. 수조에서 37 ° C에 R-spondin1의 15 ML의 나누어지는을 따뜻하게.
  3. 인큐베이터에 배치하여 적어도 30 분 동안 37 ° C에 따뜻한 세 멸균 24 웰 플레이트. 4 ° C에 마우스 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) + 2 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 멋진 당 50 ㎖를 준비합니다. PBS는 10 % FBS, 4 ℃로 냉각을 포함 1X 마우스 당 100 ㎖를 준비합니다.

Organoid 문화 1 3. 수확 뮤스의 musculus 소장 납골당

  1. 나이 6-12 주 표준 쥐 차우 가능한 물에 제기 남성 C57B6 / J 마우스의 나이를 희생광고 무제한 기관의 지침에 따라. CO를 통해 자궁 경부 전위 다음 2 질식을 안락사.
    참고 : 조직 수확 때까지 얼음에 시체를 유지하고 오염의 위험을 최소화하기 위해 생물 안전 캐비닛에 조직 수확을 수행합니다.
    주 : 수컷 또는 암컷 마우스 organoids을 생성하기 위해 사용될 수있다.
  2. (선택 사항) 70 % 에탄올에 담근다 전에 털을 제거하기 위해 마우스를 면도. 2 분 동안 70 % 에탄올에 마우스를 담그지 보드를 터치 마우스의 등쪽면 보드를 고정에 사지를 고정.
  3. 미리 멸균 사용하여 마우스의 복부 부분에 중심선을 절개하기 위해 가위 집게를 해부. 목의 기지로 두개골을 진행 생식기의 절개를합니다. 핀셋으로 옆으로 피부 절개를 열고 복막을 노출 피닝 보드에 피부를 핀.
  4. 가위를 해부와 복부의 복막에 중간 선 절개를하고 일 배복부 장기를 노출하기 위해 피닝 보드 옆 집게 핀으로 전자 복막.
    주 : 복부 장기를 절단하지 않도록주의하십시오.
  5. 위장과 맹장에 연결된 말단 접합에 연결된 소장의 근위 접합을 절단 집게와 가위를 해부하여 복강에서 소장을 제거합니다. PBS 1X 얼음 차가운 10 ㎖를 포함하는 멸균 페트리 접시에 소장을 배치합니다.
  6. 1 ml의 피펫을 사용하여 PBS 1X 빙냉와 소장의 루멘 내에 포함 된 내용을 플러시. 소장의 루멘 내에 이물질이 제거 될 때까지이 단계를 반복합니다.
  7. 3-4 거의 동일한 길이 스트립으로 가위를 해부와 소장을 잘라 길이 방향으로 새로운 멸균 페트리 접시에 스트립을 배치합니다. 각 스트립, 절개 전체 길이 O하도록 소장의 루멘 내부 해부 위의 절삭 날을 삽입스트립 바. 측면 소장의 루멘을 폭로하기 위해 절개를 오픈 접어 집게를 사용합니다.
  8. 부드럽게 소장의 내강 표면에 융모를 멀리 긁어 멸균 유리 슬라이드를 사용합니다. 해부 가위 1-2cm 길이 스트립에 소장을 잘라 PBS 1X 10 ml의 얼음 추위를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에이 스트립을 전송합니다.
  9. 50 ml의 원추형 튜브 반전 부드럽게 내용을 혼합하고 조직 함량은 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 바닥에 정착 할 수있다. 1 배 PBS를 기음과 PBS 1X 얼음 차가운 10 ㎖로 조직을 세척하여이 세 번 반복한다. 최종 세척 1X PBS 10 ㎖의 소장 조직 세그먼트를 포함하는 10 분 동안 얼음에 원추형 튜브를 떠난다.
  10. 1 배 PBS를 기음과 1X PBS + 2 mM의 EDTA의 25 ㎖를 추가합니다. 4 ° C에서 45 분 동안 얼음 양동이에 락을 플랫폼에 놓습니다. 조직이 배양되는 동안, 여섯 15 ML 원뿔 튜브 라벨 "분수 # 1-6."
  11. 티슈 내용이 튜브 바닥에 침전 할 수있다. 제거 "부분 1"로 표시된 튜브 15 ML 원뿔에 뜨는을 전송합니다. 단계 (3.11)를 다섯 번 흔들리는 1X PBS + 10 % FBS를 반복하고 적절하게 레이블 - 분수 관을 위해 뜨는 내용을 전송합니다.
  12. 5 분 동안 125 XG에 원심 분리기. 5 ml의 상층 액과에 resuspend 펠렛을 대기음 미리 예열 1 배 DMEM / F-12, 아니 성장 인자와는 덧붙였다.
  13. 2 분 78 XG에 원심 분리기. 대기음 4 상청액 ㎖의 나머지 미디어 1ml의 각 펠렛을 재현 탁.
  14. 각 분획으로부터 20 ㎖를 제거하고 유리 슬라이드에 추가 할 수 있습니다. 광학 현미경 아래 지하실과 파편을 시각화하고 결합하는 분획을 확인하고 큰 아버님을 달성하기 위해 따라 풀파편 비율의 지하실 ntage.
    참고 : 분수 2-6 지하실의 가장 큰 비율이 도금 될 얻을. 풀 분획 대부분 분획 6 분획 4 및 분획 5 분획 3이다.
  15. 원심 분획을 5 분 동안 125 XG에 도금된다. 대기음이 뜨는 펠렛 위에 나머지 50 ~ 100 μl를 떠나.
  16. 얼음에 튜브를 유지하고 풀링 분수에 단백질 매트릭스 1 ㎖를 추가합니다. 피펫 상하 천천히 기포의 첨가를 방지 할 수있다.
  17. 37 ° C 배양기에서 미리 예열 24 웰 플레이트를 제거하고 각 웰의 중간에 단백질 매트릭스 / 토굴 서스펜션의 50 μl를 추가합니다. 단백질 매트릭스 드롭이 응고 할 수 있도록 10 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에 시드 판을 전송합니다.
  18. 이전에 준비 organoid 성장 미디어 + 잘 당 미디어를 조절 R-spondin1의 50 μl를 450 μl를 추가합니다. 37 ° C + 5 % CO 2 하룻밤에 번호판을 품어.
  19. R-spondin1 조건 메디칼의 50 ~ 100 μl를 추가물론 매일마다. 모든 제 3의 일이 잘 단계 2.2에서 설명한 갓 준비 organoid 성장 미디어 450 μL /로 전체 organoid 성장 미디어를 교체합니다. 또한 R-spondin1 에어컨 미디어의 50 ~ 100 μl를 추가 당 잘.
    참고 : 단백질 매트릭스 강하는 일주일 동안 무결성을 유지하지만 7 일 후 계대 organoids를 진행합니다.

4.과 Passaging Organoids 모든 일곱 번째

  1. 4 ° C 계대 전날에 얼음 하룻밤에 단백질 매트릭스를 녹여. 적어도 30 분 동안 37 ° C로 예열 한 멸균 24 웰 플레이트. 단계 2.2에서 설명 organoid 성장 미디어를 준비하고 사용까지 37 ° C로 유지합니다.
  2. 인큐베이터에서 organoid 플레이트를 제거하고 얼음에 플레이트의 계대을 시작. 3-4 우물에서 10 ml를 피펫으로 흡인 성장 미디어를 시작합니다.
    주 : 이것은 다음 단계에서 단백질 매트릭스 방울을 제거하는 데 사용되는 바와 같이, 10 ㎖ 피펫으로 흡입 된 미디어를 유지.
  3. 로불법 복제 웰, 피펫 상하 판에서 단백질 매트릭스 드롭을 제거하기 위해서입니다. 10 ML의 피펫의 끝이 부드러운 스크래핑 단백질 매트릭스 드롭 빠지에 도움이됩니다. 15 ML 원뿔 튜브에 내용을 전송합니다.
  4. 4 ℃에서 5 분 동안 125 XG에 10 분 원심 분리기의 15 ml의에게 얼음에 원뿔 튜브를 품어. 원뿔 튜브의 바닥에 흰색 펠렛을 관찰한다. 온화하게 흡인하고 펠렛 위 100-200 μL 떠나는 organoid 펠렛 위에 뜨는 / 이전 organoid 성장 배지의 대부분을 버린다.
  5. 1 mL의 주사기에 부착 된 23 게이지 바늘을 사용하여 organoid 소낭을 휴식. 대기음은 지하실을 해리하기 위해 10 ~ 15 번 배출합니다. 공기 방울 형성​​ 과도한 피펫을 최소화.
  6. 단백질 행렬의 500 μL에 organoids를 재현 탁하고 새 미리 예열 24 웰 플레이트에 웰 당 50 μl를 추가합니다. R-spondin1의 + 50 μl를 미리 준비 organoid 성장 매체의 450 μl를 추가물론 당 조절 미디어. 하룻밤 37 ° C에서 접시를 품어.

5. 도금 Organoids 유전자 발현 분석을위한 PAMPs가 및 리스테리아 모노 사이토와 패턴 인식 수용체 자극에 대한 일 14

  1. L. 밖으로 행진에 도전 이틀 전에 BHI 한천 플레이트에 모노 사이토 겐.
  2. 다음 날은 L.를 선택 콜로니 모노 사이토 겐, 200 rpm으로 흔들면서 37 ℃에서 하룻밤 BHI 배지 10 ㎖에서 성장한다.
  3. 4 ° C organoid 도전 전날에 얼음 하룻밤에 단백질 매트릭스를 녹여. 적어도 30 분 동안 37 ° C로 예열 한 멸균 24 웰 플레이트. 단계 2.2에서 설명 organoid 성장 미디어를 준비하고 사용까지 37 ° C로 유지합니다.
  4. 인큐베이터에서 organoid 문화를 제거하고 organoids의 계대을 시작.
  5. 이것은 단백질 매트릭스 드롭을 제거하는 데 사용됩니다로 3-4 우물에서 대기음 매체와는 10 ml의 pipete에 흡입 된 미디어를 유지합니다. 최대 피펫 및플레이트로부터 단백질 매트릭스 방울을 제거하기 위해 다운. 10 ML의 피펫의 끝이 부드러운 스크래핑 단백질 매트릭스 드롭 빠지에 도움이됩니다. 15 ML 원뿔 튜브에 내용을 전송합니다.
  6. 10 분 동안 15 ml의에게 얼음에 원뿔 튜브를 품어. 4 ℃에서 10 분 동안 125 XG에 원심 분리기. 원뿔 튜브의 바닥에 흰색 펠렛을 관찰한다. 부드럽게 뒤에 잔여 상층 액의 약 100 μl를 떠나 뜨는을 대기음.
  7. PBS 1X 얼음 차가운 5 ㎖의 organoid 펠렛을 재현 탁하고 계산을 위해 10 μL 나누어지는을 제거합니다. 유리 커버 슬립없이 혈구의 중간에 10 μL 나누어지는을 추가합니다. 부드럽게 드롭의 상단에 유리 커버 슬립을 오버레이.
    주 : 유리 슬라이드가 먼저 제거되지 않은 경우 혈구가 organoids으로 방해 할 것입니다.
  8. / 모든 그리드 광학 현미경을 통하여 혈구의 전체 챔버 organoids의 총 수를 계산하며 organoid 농도를 측정하여 num총 organoids의 BER은 10 μL 당었다.
  9. organoids의 적절한 숫자 분석 및 원심 분리기 10 분 동안 125 XG에이 서스펜션에 대한 시드 할 수 있습니다 15 ML 원뿔 관에서 적절한 볼륨을 제거합니다.
    참고 : 24 웰 플레이트의 웰 당 40-100 organoids 사이의 범위는 RNA 분석을위한 충분하다. 전형적인 organoid 크기는 직경 300 μm의 1,000 μm의 범위 수 있습니다.
  10. 상등액을 흡인하고 기포를 발생시키지 않고 단백질 매트릭스 500ml에 펠렛을 재현 탁. 24 웰 플레이트에 웰 당 organoid / 단백질 매트릭스 서스펜션의 50 ML을 추가합니다.
    주 : 처리 조건 및 기술 복제 수에 따라 달라질 것이다 organoids를 재현 탁하는 데 사용 된 단백질 기질의 양.
  11. 각 웰 (N- 아세틸 시스테인없이) organoid 성장 배지 500 μl를 추가하고 1 시간 동안 37 ° C + 5 % CO 2에서 배양한다.
  12. 즉, 플라 젤린 (PAMPs가의 2 배 농도를 준비,리포 폴리 사카 라이드)와 L. 라이브 모노 사이토. 라이브 L.의 OD를 측정 계산을위한 BHI 판에 모노 사이토와 스테이크. 1 × 10 6 콜로니 형성 단위 (CFU) / ㎖에서 organoids을 취급합니다.
    참고 : 박테리아를 입력하고 자극을 organoid하기 전에 평가해야한다에 의해 CFU 결정에 OD가 달라질 수 있습니다. L. 0.6 ≈ 1 × 109 CFU / ㎖, 예를 들면, OD 모노 사이토 겐은 또한 실험 독립적 전에 평가되어야한다.
  13. L.의 치료 stock에서 일련의 희석 밖으로 행진 모노 사이토 겐을 정확히 처리 CFU / ㎖를 결정한다. 저자는 BHI 한천 플레이트에 100 μL의 1 × 8 희석 정확한 CFU / ㎖를 결정하는 식민지를 계산하기에 충분한 것을 찾을 수 있습니다.
  14. L.의 열 살해 솔루션을 준비 라이브 L.의 1 ML의 분취 량을 취함으로써 모노 사이토 10 분 동안 5,000 XG에서 솔루션 및 원심 분리기 모노 사이토 겐. 상층 액과 세척을 기음1X PBS 1 ㎖와 박테리아 펠릿.
    1. L.를 원심 분리기 10 분 동안 5,000 XG에 모노 사이토 겐 및 1X PBS 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. L. 죽일 가열 1 시간 동안 80 ~ 90 ℃로 가열하여 1.7 ml의 폴리 프로필렌 튜브 모노 사이토. 문화 열의 100 ㎕를 분취는 L. 사망 BHI 한천 플레이트에 모노 사이토은 살아있는 박테리아가 남아 있지 확인합니다.
    2. 사용자에 의해 결정 지정된 웰에 500 ㎕의 거주자 미디어에 적합한 2 배 PAMP 및 / 또는 미생물 처리의 500 μl를 추가합니다. 24 시간 동안 37 ° C + 5 % CO 2에서 품어.
      주 : 거주자 매체 500 μL에 배 PAMP / 미생물 치료의 500 μL 분취 추가 1 ml의 총 부피에 배일 치료 농도를 가져올 것이다.
  15. 다음 날, 수동 L.를 계산 치료 CFU / ㎖의 정확한 결정을 위해 콜로니 모노 사이토 겐. 처리 organoids의 접시에서 대기음 미디어와 우물의 t을 씻어1X PBS와 HREE 시간.
  16. 페놀 / 클로로포름 11 제조자 지시에 따라 RNA 추출 키트를 통해 RNA 추출을 진행. 표준 QRT-PCR (12) 사용하여 유전자 발현을 평가합니다.

6. 도금 Organoids 상층 액의 단백질 분석을위한 PAMP 및 리스테리아 모노 사이토 겐 도전에 대한 일 14

  1. 도전하기 전에 이틀, 카코이 세포의 세포 배양, 1 배 DMEM + 20 % FBS와 T-75 플라스크에 ≈1 × 10 6 세포 파종 밀도를 시작하고 37 ° C + 5에서 카코-2 세포를 배양 %의 CO 2. L.의 세균 배양을 시작합니다 BHI 판에 모노 사이토와 37 ° C에서 세균 배양기에서 접시를 품어.
  2. 다음 날은 L.를 선택 식민지 모노 사이토 겐 밤새 37 ° C에서 BHI 배지 10ml에 성장합니다. 4 ° C organoid 도전 전날에 얼음 하룻밤에 단백질 매트릭스를 녹여.
  3. 따뜻한 다음날 한 멸균 96 웰 검은 벽적어도 30 분 동안 37 ° C로 판. N 아세틸 시스테인 단계 2.2에서 설명 및 사용 때까지 37 ° C로 유지하지 않고 organoid 성장 미디어를 준비합니다. 인큐베이터에서 organoid 문화를 제거하고 organoids의 계대을 시작.
    참고 : 일반적인 organoid 크기는 직경 300 μm의 μm의 1,000에 이르기까지 다양 할 수 있습니다.
  4. 이것은 단백질 매트릭스 드롭을 제거하는 데 사용됩니다로 3-4 우물에서 대기음 매체와는 10 ml의 pipete에 흡입 된 미디어를 유지합니다. 플레이트로부터 단백질 매트릭스 방울을 제거하기 위하여 피펫 재현 탁. 10 ML의 피펫과 부드러운 스크래핑 단백질 매트릭스 드롭 빠지에 도움이됩니다. 15 ML 원뿔 튜브에 내용을 전송합니다.
  5. 10 분 동안 15 ml의에게 얼음에 원뿔 튜브를 품어. 4 ℃에서 10 분 동안 125 XG에 원심 분리기. 원뿔 튜브의 바닥에 흰색 펠렛을 관찰한다. 부드럽게 뒤에 잔여 상층 액 100 μl를 떠나 뜨는을 대기음.
  6. 얼음 감기 5 ㎖의 organoid 펠렛을 재현 탁1X PBS는 계산을 위해 10 μL 나누어지는을 제거합니다. 혈구의 중간에 10 μL 나누어지는을 추가하고 부드럽게 유리 coverslip에 오버레이.
    주 : 유리 슬라이드가 먼저 제거되지 않은 경우 혈구가 organoids으로 방해 할 것입니다.
  7. 혈구 / 전체 챔버의 모든 그리드에서 광학 현미경을 통해 organoids의 총 수를 계산하고 organoid 농도를 측정 : 10 ml의 당 계산 총 organoids의 수입니다.
  8. organoids의 적절한 숫자 분석 및 원심 분리기 10 분 동안 125 XG에이 서스펜션에 대한 시드 할 수 있습니다 15 ML 원뿔 관에서 적절한 볼륨을 제거합니다.
    주 : 처리 조건 및 기술 복제의 양에 따라 달라질 것이다 organoids를 재현 탁하는 데 사용 된 단백질 기질의 양. 저자는 40-100 organoids이 분비 단백질 분석을위한 충분한 것을 찾을 수 있습니다.
  9. 뜨는을 기음과 생성하지 않고 단백질 행렬의 500 μL에 펠렛을 / 잘 재현 탁공기 방울.
    주 : 처리 조건 및 기술 복제의 양에 따라 달라질 것이다 organoids를 재현 탁하는 데 사용 된 단백질 기질의 양.
  10. 우물은 표준 곡선의 생성을위한 카코 2 세포와 시드 이러한이 될 것 같은 96 웰 검은 벽의 조직 배양 접시에 빈 두 개 이상의 열을 둡니다. 당 잘 미리 예열 96 웰 검은 벽의 조직 배양 접시에 단백질 매트릭스 + organoid 현탁액의 50 μl를 추가합니다. 10 분 단백질 행렬이 응고 할 수 있도록 37 ° C에서 접시를 저장합니다.
  11. 각 웰 (N- 아세틸 시스테인없이) organoid 성장 배지 100 μl를 추가하고 1 시간 동안 37 ° C + 5 % CO 2에서 배양한다.
  12. PAMPs가의 2 배 농도를 준비하고 L. 라이브 모노 사이토는. 잘마다 각각의 주어진 처리 조건의 100 ㎖를 추가하고 24 시간 동안 배양한다.
  13. 표준 곡선 웰의 다음 날 판은 카코 2 세포. 멸균 1X PBS, 0.25 % 트립신과 1 배 DMEM + 20 % FBS의 t 온난화에 의해 시작O를 37 ℃로.
  14. 카코 -2 세포를 포함하는 T-75 플라스크를 제거하고 세포 배양 배지를 흡인. PBS 1X 10 ml의 세포를 씻으십시오. 대기음 1X PBS는 15 분 동안 37 ° C 배양기에서 2 ml의 0.25 % 트립신과 장소 T-75 플라스크를 추가합니다.
  15. 세포가 다음 분리 카코 2 셀에 1 배 DMEM + 20 % FBS 8 ml에 추가하고 15 ML 원뿔 튜브에 넣고 분리을 보장하기 위하여 광학 현미경 하에서 플라스크를 시각화합니다. 10 μL 나누어지는을 제거하고 혈구를 사용하여 광학 현미경으로 세포를 계산합니다.
    주 : 60,000 / 웰이 잘 작동 세포 희석액의 상부 세포 수 / 웰의 세포를 2,500까지 표준 곡선의 생성을 행할 수있다.
  16. 단백질 매트릭스에서 카코-2 세포를 재현 탁하고 적절한 우물에 잘 당 50 μl를 추가합니다. 단백질 매트릭스 카코 2 세포를 37 ℃에서 응고 할 수 있습니다.
    주 : 카코 -2 세포 성장 배지는 단백질의 응고 매트릭스 아래 첨가 할 필요가 없다.
  17. 수행원organoid 분석, 흡인에 대한 24 시간의 처리 시간과는 organoid 세포 상층 액 미디어를 저장하고 얼음에 보관하십시오. 1X PBS로 우물을 세 번 씻으십시오. 각각의 잘 카코 (2) 표준 곡선의 우물을 포함하여 100 % 메탄올 100 μl를 추가하고 organoids를 해결하기 위해 20 ~ 30 분 동안 4 ° C 또는 얼음에 품어.
    주 : 메탄올을 직접 추가 할 수 있습니다 그것은이의 카코 2 표준 곡선 웰 1X PBS로 세척 할 필요는 없다.
  18. 메탄올 배양 한 후, PBS 1X 얼음 감기 우물을 세 번 씻는다. 최대 1 ~ 2 주 동안 4 ° C에서 접시를 저장합니다.
  19. 1 μg의 농도로 핵 염색 염료를 추가하면 / ㎖ 당은 물론, 알루미늄 호일로 접시를 커버하고 밤새 4 ° C에서 품어.
  20. 핵 염색 염료 여기 / 방출 (350nm / 461nm 각각)을 측정하기 위해 96 웰 플레이트 리더를 사용하여 정상화 각 organoid 잘 카코이 세포의 표준 곡선.
  21. 이러한 ELISA와 같은 다운 스트림 분석에 진행

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Representative Results

장 organoids을 육성하기 위해이 프로토콜을 다음과 같은 경우, 특성 구 모양의 organoids는 수확 후 존재합니다. R-spondin1 에어컨 미디어의 추가는 매일 organoids의 성장과 신진를 시작합니다. organoids의 성장은도 1a에 도시되어있다 - F, 및 일 1, 2, 4, 5, 6 일에 장내 organoids 대표 인 14도 1F는 14 일째 organoids의 비 균일 한 성장 특성을 나타낸다.

organoids는 적절한 수의 성장되면, 그들은 플레이 팅과 다양한 PAMPs가 및 / 또는 미생물에 도전 할 수있다. 발현 분석은 표준 기술을 통해 수행 될 수있다. 이는 다음 분석 하였다 염증성 사이토 카인 IL-18, IL-6, TNFα의 mRNA 발현을 도시하는도 2A-C에 나타내열을 organoids의 24 시간의 문제는 L. 사망 모노 사이토와 PAMP의 플라 젤린. mRNA의 발현을 평가하기위한 이론적 근거는, IL-18 사이토 카인 IL-6 및 TNFα 이러한 병원성 챌린지에 응답하여 상피 세포에 의해 변조되는 좋은 후보라고이고,이 염증​​성 사이토 카인의 조절은이 기술의 효과를 보여주는 것이다.

도 3a는 - C는 상주 단백질 매트릭스 파편의 최소한의 배경 염색과 고정 다음 핵 염색 염료와 장 organoids의 상대적 핵 염색을 보여줍니다. 고정 및 염색하는이 방법은 각 웰에있는 세포 수를 상이한 차지할 분석법을 표준화에 적용될 수있다. 단백질 매트릭스에 도금 카코이 세포의 시리얼 희석의 표준 곡선을 생성 할 때, 다음 고정 핵 염색을 그림 4에서 알 수있다염색 염료. 0.89의 R이 값은 세포 수 사이의 선형 관계를 나타내고, 형광 세기를 의미하고, 상기 선형 방정식은 셀 번호 organoids를 정규화하는데 사용될 수있다. 도 4에 도시 된 표준 곡선 웰 당 30,000 세포 넘어 포화 한도에 도달하기 시작한다. 웰 당 30,000 세포를 상기 세포의 적정 핵 염색 염료의 포화 영역을 포함하는도 4에 도시되었다. 정규화 향상된 정확도가 포화 한도에 도달하기 전에 핵 염색 염료의 선형 범위를 반영하는 셀 번호를 획득한다.

그림 1
그림 1 :. 격리 다음 쥐의 소장 파생 organoids 성장의 소장 Organoid 성장 시간 코스. (A) 주 1 (B)의 날 (2) (C) 일 4. (D)의 날 (5) (E)의 날 (14) 이미지가 각각의 주어진 일에 대한 organoid 성장의 대표 6. (F)의 날. 스케일 바는 1,000 ㎛ 내지 200 ㎛의 동일, B, C, D, 및 E. 스케일 막대는 A, B, C, D, 및 E. 스케일 바 적합한 화상 100 μm의 동일한위한 왼쪽 이미지 200㎛ 인 동일 F에 대한 왼쪽과 오른쪽 이미지를 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 24 시간 PAMP의 반칙으로 염증성 사이토 카인의 mRNA의 발현 PAMPs가 열 살해 리스테리아 균 24 시간 동안 도전 야생형 장 organoids의 상대 mRNA 발현 (A - C)의 I의 대표 배 변경.. 각각 nflammatory 사이토 카인 IL-18, IL-6 및 TNFα. 오차 막대는 표준 편차 (SD) 표현 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

그림 3
그림 3 : 정규화에 대한 Organoids의 상대 형광 염색 고정을 다음과 organoids의 핵 염색.. (A) organoids의 밝은 필드. (B) 핵 염색 염료와 organoids의 형광 염색. (C) 밝은 필드 및 형광 염색의 병합 된 이미지입니다. 스케일 바는 모든 이미지에 400 μm의 동일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

"> 그림 4
그림 4 : 카코 2 세포에서 생성 된 표준 곡선 세중의 우물에서 생성 된 표준 곡선.. 셀 시드가 아니라 당 2,500 세포에 이르기까지 희석 잘 당 60,000 세포에서 시작 범위를했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 :. 프로토콜 다이어그램 개요 그림 1 탑 패널은 R-spondin1 에어컨 미디어를 수확 보여줍니다. 그림 2 - 중간 패널 수확하는 프로토콜과 문화 마우스 소장 organoids의 측면을 보여줍니다. 그림의 3 하단 패널을 보여줍니다 (A) 십사일 배양 organoids의 도금. PAMPs가 / L.와 (B)의 도전모노 사이토 겐 및 이탈 점유 웰 표준 곡선을 생성한다. (C)를 ​​PAMP 도전에 따라, 이전에 점유 웰 카코 -2 세포 도금 표준 곡선을 생성한다. 고정 및 핵 염색 염료를 첨가 한 다음에 (D), 표준 곡선에 대한 우물과 정상화의 여기 / 방출을 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

장 organoids의 문화 및 유지 보수 적절한 조직 배양 기술로 개별 마스터 할 수있는 절차입니다. 이보다 기존의 단일 층의 세포 성장에 비해 계대에 미묘한가 있지만, 이러한 미묘한 차이는 극복하기 어려운되지 않습니다. 이 방법의 중요한 단계는 최적의 파종을 위해 충분히 높은 밀도로 organoids 성장을 할 수있는 포함한다. 통상적으로 세포주를 달성 할 수있다 큰 파종 밀도가 실질적으로없는 실험 organoids으로 축소되어야한다. 여러 처치 군이 존재하는 경우에 특히 분명해진다.

이 프로토콜은 다양한 박테리아의 다양한 장내 상피 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 단계별 방식을 제공하기위한 것이다 정규화에 대해이 시스템을 사용하여 바이러스, 진균 병원체뿐만 아니라 어드레스 어려움. 보고서는 describ 사용할 수 있습니다전자 세균성 병원체 살모넬라 균과 장 organoids의 상호 작용, 아직 분비되는 사이토 카인 (13)을 측정 때 정규화 방법을 제시하지 않습니다.

다른 방법으로 organoid 문화를 정상화 할 때 발생하는 여러 가지 문제가 있습니다. bicinchoninic 산 분석을 통해 분비 단백질을 정규화 (BCA)는 옵션입니다; 그러나, 성장 성분 organoid 배양에 필요한 (N2 및 / 또는 비타민 B27)이 BCA 분석을 방해 (데이터는 도시하지 않음)을 정규화를 세포 생존력을 통해 이러한 변형 MTT 분석 14에 설명되어있다.; 그러나, MTT으로이 기술을 통해 정상화를위한 부정확 한 방법을 소개합니다 organoids의 미토콘드리아 대사 활동을 변경하는 처리는 미토콘드리아 탈수소 효소 (15)의 작용에 의해 감소를 기반으로합니다. 안, 미디어에서 N- 아세틸 시스테인 (NAC)를 제거 할 필요가있다MTT 법을 통해 정규화 원하는 경우 LY는하지만, NAC와 같은 박테리아 병원체로 처리하는 것은 박테리아의 성장을 억제 (16) 할 수있는 경우.

이 기술의 장점 organoids 사이토 카인 분비 단백질 제품은 지금 카코 -2 세포를 표준 곡선에 대해 정규화 될 수있다. 이 기술의 한계는 비 형질 전환 주 organoids 상피의 핵 염색이 대장 암 세포주의 핵 염색에 대해 정규화 때문에 정규화 상관이라고한다. 저자는 핵 메탄올 및 염색 핵으로 고정 찾기 염료를 염색하는 카코 -2 세포를 표준 곡선에 대한 효과적인 표준화 기술이다. 이 대장 암 세포주의 성장 특성을 정확하게 핵 염색을 이용하여 평균 형광 강도를 측정 장내 organoids의 성장 특성을 모방하지 않지만 전체 세포 수에 대해 정상화 좋은 전략이다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11050 (Section 1, 3, 6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo (Section 1, 3)
DMEM GE Healthcare Sh30243.01 (Section 1, 6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. 
50 ml conical tube Falcon 352070 (Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask Corning 431079 (Section 1) Or equivalent brand 
Protein Matrix Corning 356231 (Section 2, 3, 4, 5, 6) Matrigel Growth Factor Reduced 
HyClone Dulbecco's (DPBS) GE Healthcare SH30264.01 (Section 2, 3)
DMEM/F12  Life Technologies 12634-010 (Section 2, 3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates Corning 3524 (Section 2)
N2 Supplement 100x  Life Technologies 17502-048 (Section 2)
B27 without vitamin A 50x  Life Technologies 12587-010  (Section 2)
Trizol Life Technologies 15596-026 (Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax) Life Technologies 35050-061 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M) Life Technologies 15630-080 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 
10 ml Serological Pipet Falcon 357551 (Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin Peprotech 250-38 (Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165 (Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF Biolegend 585608 (Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable Bioexpres (Section 3)
dissecting scissors (Section 3)
forceps (Section 3)
glass slides (Section 3)
dissecting tweezers (Section 3)
25 ml Serological Pipet Falcon (Section 3)
EDTA  Sigma-Aldrich SLBB9821 (Section 3) 0.5 M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 (Section 3) Or equal sized TC dish
1 ml Syringe Becton Dickinson 309659 (Section 4)
Precision Glide Needle Becton Dickinson 305120 (Section 4) 23 G x 1 1/4 (0.6 mm x 30 mm)
Flagellin from Bacillus subtilis Invivogen tlrl-bsfla  (Section 5, 6)
Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Section 5, 6) (Murray et al.) 
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA (Section 5, 6) Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar Becton Dickinson 211065 (Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion Becton Dickinson 237500 (Section 5)
Caco-2 ATCC HTB-37 (Section 6)
Trypsin  gibco 25200056 (Section 6)
Methanol Fisher A412-4 (Section 6)
SpectraMax M5 Molecuar Devices (Section 6)
96 Well Assay Plate Corning 3603 (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye Life Technologies H1399 (Section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask Corning 430641 (Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube Falcon 352096 (Section1, 3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube Bioexpress C-3262-1 Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep Zymo Research R1054 Or equivalent brand
TNF-alpha  Applied Biosystems Mm 00443260_g1 Taqman gene expression assay kit
IL-6  Applied Biosystems (Mm 00446190_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-1beta Applied Biosystems Mm 00434228_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-18 Applied Biosystems Mm 00434225_m1 Taqman gene expression assay kit
18s Applied Biosystems Hs 99999901_s1 Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix Life Technologies 4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies/Applied Biosystems 4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml Life Technologies/Applied Biosystems 4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/ml
chloroform Sigma-Aldrich C7559

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References

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