Das
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 3School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Published 5/18/2016
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Immunology and Infection

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Summary

Hier wird ein Protokoll zu ernten, zu pflegen und zu behandeln Maus kleine Darm-Organoide mit pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben, sowie Betonung auf die Genexpression und die richtige Normalisierungstechniken für Protein.

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Rothschild, D. E., Srinivasan, T., Aponte-Santiago, L. A., Shen, X., Allen, I. C. The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (111), e54033, doi:10.3791/54033 (2016).

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Abstract

Primäre Darm-Organoiden sind ein wertvolles Modell-System, das das Potenzial hat, deutlich auf dem Gebiet der Immunologie Schleimhaut auswirken. Allerdings führen die Komplexität der organoiden Wachstumseigenschaften erhebliche Einschränkungen für die Ermittler. Insbesondere sind die Wachstumsmuster der einzelnen organoiden sehr variabel und eine heterogene Population von Epithelzellen in Kultur zu schaffen. Mit einer solchen Einschränkungen können gemeinsame Gewebekulturpraktiken nicht einfach auf den organoiden System angewendet werden, aufgrund der Komplexität der Zellstruktur. Zählen und Plattieren basiert ausschließlich auf Zellzahl, die einzeln getrennten Zellen, wie beispielsweise Zelllinien gemeinsam ist, ist kein zuverlässiges Verfahren zur Organoide wenn nicht ein Normalisierungsverfahren angewendet wird. Normalisieren auf den Gesamtproteingehalt ist komplex aufgrund der Bewohner Proteinmatrix hergestellt. Diese Eigenschaften in Bezug auf die Zellzahl, Form und Zelltyp sollte in Betracht gezogen werden, wenn sekretiertes con AuswertungZelte aus der organoiden Masse. Dieses Protokoll wurde generiert ein einfaches Verfahren zur Kultur zu skizzieren und Dünndarm-Organoide mit mikrobiellen Krankheitserregern und pathogen associated molecular patterns (PAMPs) zu behandeln. Er betont auch die Normalisierungstechniken, die angewendet werden soll, wenn die Proteinanalyse nach einer solchen Herausforderung durchgeführt werden.

Introduction

Die Fähigkeit , zu ernten und Kultur primären Organoide wurden Dünndarm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse, Leber und Gehirn und sind spannende Fortschritte germane zum Verständnis eines physiologisch repräsentativen Phänomene für Gewebe biology 1-5 ​​beschrieben. Die ersten Methoden , um die Kultur und die Wartung von kleinen Darm-Organoiden beschreiben wurde von Sato et al. Aus dem Labor von Hans Clevers 1. Vor dieser Methode, die Ernte und Kultur der primären intestinalen Epithelzellen nachgewiesen begrenzt und ineffektiv bei der Aufrechterhaltung epithelialen Zellwachstums werden. Verfahren enthalten Dissoziation des Gewebes durch Inkubation mit Enzymen wie Kollagenase und Dispase, die letztlich zum Auswachsen von vermischte primären Fibroblastenzellen 6 führen würde. Diese Bedingungen würden auch die epithelialen Zellkultur bei der Aufrechterhaltung Zeit eingeschränkt werden. Minimale bis keine Epithelzelle Nische bilden würde, wie die Epithelzellen Apoptose eintreten würde aufgrunddas Fehlen von geeigneten Wachstumsfaktoren oder Kontaktverlust Integrität, bezeichnet anokis 7. Das Aufkommen der 3D-organoiden Kultursystem hat ein Verfahren zur Kultur primären Darmzellen bereitgestellt 1 ein Spektrum von Darmzelltypen in Kultur anhalt enthält. Diese epithelialen Organoide haben Vorteile gegenüber Zelllinien ist , dass sie aus mehreren differenzierten Zellen zusammengesetzt sind, und imitieren besser das Organ sie in vivo 8 abgeleitet sind. Der Prozess, um schließlich "wachsen, um ein Mini-Darm in einer Schale" ein wertvolles Instrument für die Bewertung der Reaktion von Darmepithel unter verschiedenen Stimuli bewährt hat. Die Untersuchung der Interaktion von primären Darmzellen mit mikrobiellen Pathogen associated molecular patterns (PAMPs) ist auf dem Gebiet der Immunologie relevant , da diese molekularen Muster 9 unterschiedlichen Antworten von sowohl Wirt und Mikrobe regulieren kann. Nicht nur können die Ermittler untersuchen nun diese Interaktionen mit der Maus Organoiden, aber siekann von Menschen als auch 2 kultiviert werden. Diese Technologie hat das Potenzial, dramatisch personalisierte Medizin zu verändern und es ist verlockend, um Fortschritte zu spekulieren, dass diese Technik in naher Zukunft möglich machen wird.

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Protokoll für die Kultur, Expansion und Behandlung von Darm Organoide mit einer Vielzahl von Stimuli bereitzustellen. Solche Reize schließlich kann von Impfstoffen, bakterielle PAMPs reichen, Live-Erreger, gastrointestinale (GI) und Krebstherapeutika. Die Isolierung und Kultur von Maus - Darm-Organoiden wurde von Sato et al angepasst. Zwar gibt es geringfügige Abweichungen von der ursprünglichen Methode der Produktkultur sein Ende organoiden wird noch erreicht , wenn dieses Protokoll folgen. Dieses Verfahren wird auf die Beschreibung eine ausreichende Technik zum korrekten Normalisierung fokussiert, wenn sie mit nicht homogenen Zellstrukturen arbeitet, die berücksichtigt werden müssen, wenn ein Assay basierend auf Zelle n leitendenUmber.

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Protocol

Alle Forschung wurde genehmigt und unter der Virginia Tech IACUC Richtlinien durchgeführt

1. Bereiten Sie R-Spondin1 Medien Anlage Von HEK293T-Rspo1 Zelllinie

  1. Generation of HEK293T-Zellen Rspondin1 wurde zuvor 10 beschrieben. Seed HEK293T-Zellen Rspondin1 bei 5-10% Konfluenz sekretieren, etwa 8 x 10 & sup5 ; -1,7 · 10 & sup6 ; Zellen in einem T-175 - Kolben mit 40 ml 1x Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) + 10% fötalem Rinderserum ( FBS) als Wachstumsmedium und inkubieren bei 37 ° C + 5% CO 2.
    HINWEIS: Das Wachstumsmedium für die HEK293T-Rspondin1 sezernierenden Zellen werden als R-spondin1 konditionierten Medien dienen. R-spondin1 kann alternativ als ein rekombinantes Wachstumsfaktor in einer Endkonzentration von 500 ng / ml verwendet, bezogen werden.
  2. Wachsen die HEK293T-Rspondin1 Zellen für sieben Tage oder bis zum Erreichen von 95% Konfluenz bestimmt durch Hellfeldmikroskopie. Ernten Sie die 40 ml konditioniertes Medium und Transfer zum 50ml konischen Röhrchen. Entsorgen Sie den T-175-Kolben von HEK293T-Rspondin1 sezernierenden Zellen.
  3. Zentrifuge das Rohr konditionierten Medien bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C enthält, um Zelltrümmer zu pelletieren. Die überstehende Flüssigkeit, bezeichnet als R-spondin1 konditionierten Medien und aliquoten in 15-ml-Röhrchen. Shop Aliquots bei -20 ° C für kurzfristige oder -80 ° C für die Langzeitlagerung.
    HINWEIS: Nach dem Auftauen der R-Spondin1 konditionierten Medien zu 1 Woche 4 ° C gelagert werden kann.

2. Herstellung von organoiden Wachstumsmedien und Reagenzien für die Ernten Kleine Darmkrypten  

  1. Ein-Tages vor der Ernte, legen Sie die gefrorene Proteinmatrix auf Eis und Auftauen über Nacht bei 4 ° C. Autoclave Scheren, Zangen und Glasträger sezieren, die für die Krypta der Ernte verwendet wird.
  2. Am folgenden Tag beginnen um 40 ml organoiden Wachstumsmedien vorbereitet Ergänzungen und Wachstumsfaktoren enthält, die durch Zugabe von Stammkonzentrationen zu 40 ml 1x DMEM / F-12. Medienergänzungen enthalten: 10 mM 2- [4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethansulfonsäure (HEPES) , - 400 ul, 1x Glutamin supplement - 400 & mgr; l, 1x B27 ohne Vitamin A - 400 & mgr; l, 1 x N2 - 200 & mgr; l, 1 mM N-Acetyl-Cystein - 40 & mgr; l, 100 ng / ml m-Noggin - 40 & mgr; l, 50 ng / ml m-EGF - 4 ul und in einem 37 ° C Wasserbad bis zur Verwendung. Aufzuwärmen eine 15 ml aliquote Menge von R-spondin1 bis 37 ° C in einem Wasserbad.
  3. Warm drei sterile 24-Well-Platten auf 37 ° C für mindestens 30 min mit dem in einem Inkubator platziert. Bereiten Sie 50 ml pro Maus 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS) + 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Abkühlen auf 4 ° C. Bereiten Sie 100 ml pro Maus 1x PBS 10% FBS und kühl bis 4 ° C enthält.

3. Ernten Mus musculus Kleine Darmkrypten für organoiden Kultur 1

  1. Opfere einen männlichen C57B6 / J-Maus im Alter von 6-12 Wochen alt angehoben auf Standard-Nagetierfutter und Wasser zur Verfügungad libitum gemäß gültiger Richtlinien. Euthanize über CO 2 Erstickung durch zervikale Dislokation gefolgt.
    HINWEIS: Halten Sie Karkasse auf Eis, bis die Gewebe Ernte und führen Sie die Gewebe Ernte in einem biologischen Sicherheitsschrank das Risiko einer Kontamination zu minimieren.
    Hinweis: Eine männliche oder weibliche Maus verwendet werden kann Organoiden zu erzeugen.
  2. (Optional) Rasur mit der Maus das Fell zu entfernen, bevor in 70% Ethanol submersing. Submerse die Maus in 70% Ethanol für 2 min und Gliedmaßen Pin-Board mit der Rückenseite der Maus zu Pinning das Brett berühren.
  3. Verwenden Sie Vorsterilisiert Schere und Pinzette Sezieren an der ventralen Teil der Maus, um eine Mittellinie Schnitt zu machen. Machen Sie den Schnitt an den Genitalien kranial der Basis des Halses verläuft. Öffnen Sie die Hautschnitt seitlich mit einer Pinzette und stecken die Haut an den Pinning Bord des Peritoneum zu belichten.
  4. Machen Sie eine Mittellinie Schnitt im Bauchfell des Bauches mit einer Schere zu sezieren und falten the Peritoneum mit einer Pinzette seitlich und Stift zum Pinning Bord, um die Bauchorgane zu belichten.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, Bauchorgane Schneiden zu vermeiden.
  5. Entfernen der Dünndarm aus der Bauchhöhle mit einer Pinzette und Schere Sezieren von den proximalen Verbindungsstelle des Dünndarms mit dem Magen und dem distalen Verbindungsstelle mit dem Caecum verbunden Schneiden. Platzieren Sie den Dünndarm in eine sterile Petrischale mit 10 ml eiskaltem 1x PBS.
  6. Spülen, den Inhalt in dem Lumen des Dünndarms enthalten mit eiskaltem 1x PBS unter Verwendung einer 1 ml Pipette. Wiederhole diesen Vorgang, bis die Trümmer in dem Lumen des Dünndarms entnommen wird.
  7. Schneiden Sie den Dünndarm mit einer Schere in 3-4 ungefähr gleicher Länge Streifen und legen Sie die Streifen in Längsrichtung auf einer neuen sterilen Petrischale zu sezieren. Für jeden Streifen, legen Sie die Schneidkante der Dissektionsscheren innerhalb des Lumens des Dünndarms, um einen Einschnitt machen die gesamte Länge of den Streifen. Verwenden einer Pinzette, um seitlich Aufklappen den Schnitt, um das Lumen des Dünndarms zu belichten.
  8. Verwenden Sie eine sterile Glasobjektträger vorsichtig auf die Zotten auf der luminalen Oberfläche des Dünndarms abzukratzen. Schneiden Sie den Dünndarm in 1-2 cm Länge Streifen mit Dissektionsscheren und übertragen diese Streifen auf eine 50 ml konischen Röhrchen mit 10 ml eiskaltem 1x PBS.
  9. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch die 50 ml konischen Röhrchen invertiert und ermöglichen die Gewebe Inhalt auf den Boden des 50 ml konischen Röhrchen absetzen. Absaugen 1x PBS und wiederholen Sie dies dreimal durch das Gewebe mit 10 ml eiskaltem 1x PBS waschen. Auf dem letzten Waschen die konische Röhrchen auf Eis für 10 min mit 10 ml 1x PBS und die Dünndarmgewebesegmente lassen.
  10. Absaugen 1x PBS und 25 ml 1x PBS + 2 mM EDTA. Legen Sie auf einem Wippschüttler bei 4 ° C oder in einem Eiskübel für 45 min. Während das Gewebe inkubiert, beschriften sechs 15 ml konische Röhrchen "Fraktion # 1-6."
  11. Ermöglichen die Gewebe Inhalt an den Boden des Röhrchens absetzen. Entfernen und den Überstand auf das Rohr 15 ml konischen Bezeichnung "Fraktion 1". Wiederholen der 1x PBS + 10% FBS Schütteln Schritt (3.11) fünfmal und den Überstand Inhalt, um den entsprechend markierten Fraktion Rohr.
  12. Zentrifuge bei 125 × g für 5 min. Den Überstand aspirieren und resuspendieren Pellets in 5 ml vorgewärmten 1x DMEM / F-12, ohne Wachstumsfaktoren hinzugefügt.
  13. Zentrifuge bei 78 × g für 2 min. Aspirat 4 ml des Überstandes und Resuspendieren jedes Pellet in 1 ml der verbleibenden Medien.
  14. Entfernen Sie 20 ml von jeder Fraktion, und fügen Sie zu einem Glasträger. Visualisieren Krypten und Schmutz unter einem Lichtmikroskop und zu bestimmen, welche Fraktionen zu kombinieren und zu bündeln dementsprechend die größte perce zu erreichenntage von Krypten Schutt Verhältnis.
    HINWEIS: Die Fraktionen 2-6 der größte Prozentsatz der Krypten ergeben plattiert werden. Die Fraktionen zum Pool sind meist Fraktion 3 mit der Fraktion 4 und Fraktion 5 mit der Fraktion 6.
  15. Zentrifuge Fraktionen bei 125 xg für 5 min zu plattierenden. Überstand entfernen verlassen 50-100 ul über dem Pellet verbleiben.
  16. Halten Röhrchen auf Eis und 1 ml Proteinmatrix zu den vereinigten Fraktionen. Pipette langsam auf und ab Zugabe von Luftblasen zu verhindern.
  17. Entfernen Sie vorgewärmte 24-Well-Platten von 37 ° C-Inkubator und 50 & mgr; l Proteinmatrix / Krypta Suspension in der Mitte jeder Vertiefung. Übertragen die seeded-Platte auf eine 37 ° C Inkubator für 10 min die Proteinmatrix Tropfen erstarren zu ermöglichen.
  18. In 450 ul zuvor hergestellten organoiden Wachstumsmedien + 50 & mgr; l R-spondin1 Medien konditioniert pro Vertiefung. Inkubiere Platten bei 37 ° C + 5% CO 2 über Nacht.
  19. In 50 bis 100 & mgr; l R-spondin1 konditioniert mediein gut täglich pro. Jeden 3. Tag gesamte organoiden Nährmedien ersetzen mit frisch organoiden Nährmedien 450 ul vorbereitet / gut beschrieben in Schritt 2.2. Zusätzlich 50-100 ul R-spondin1 konditionierten Medien hinzufügen pro Vertiefung.
    HINWEIS: Die Proteinmatrix Drop behält seine Integrität für eine Woche, aber nach 7 Tagen gehen zu Passagierung Organoiden.

4. Passagierung Organoide Jeder 7. Tag

  1. Auftauen der Proteinmatrix auf Eis über Nacht bei 4 ° C am Tag vor der Passagierung. Warm eine sterile 24-Well-Platte auf 37 ° C für mindestens 30 min. Bereiten Sie organoiden Wachstumsmedien in Schritt 2.2 beschrieben und halten bei 37 ° C bis zur Verwendung.
  2. Entfernen organoiden Platte aus Inkubator und beginnen Passagierung der Platte auf Eis. Aspirat Wachstumsmedium mit einer 10 ml Pipette 3-4 Vertiefungen zu starten.
    HINWEIS: Halten Sie das abgesaugte Medium in der 10-ml-Pipette, da dies verwendet werden, um die Proteinmatrix Abfall in dem nächsten Schritt zu entfernen.
  3. In der alsRaub-Brunnen, einer Pipette auf und ab, um die Proteinmatrix Tropfen von der Platte zu entfernen. Sanfte Schaben mit der Spitze einer 10 ml Pipette ist hilfreich bei der Proteinmatrix Tropfen Verdrängen. Übertragen Sie den Inhalt in ein 15 ml konischen Röhrchen.
  4. Inkubieren Sie die 15 ml konischen Röhrchen auf Eis für 10 min und Zentrifuge bei 125 xg für 5 min bei 4 ° C. Beobachten ein weißes Pellet am Boden des konischen Rohrs. Vorsichtig absaugen und die Mehrheit des Überstandes / alt organoiden Nährmedien über dem organoiden Pellet verlassen 100-200 ul über dem Pellet verwerfen.
  5. Break up die organoiden Krypten unter Verwendung einer 23-Gauge-Nadel an einer 1-ml-Spritze. Ansaugen und ausstoßen 10-15 Mal, um die Krypten zu distanzieren. Minimieren Sie Luftblasenbildung durch übermäßige Pipettieren.
  6. Resuspendieren der Organoide in 500 ul Proteinmatrix und 50 & mgr; l pro Vertiefung in einem neuen vorgewärmte Platte mit 24 Vertiefungen. In 450 ul zuvor hergestellten organoiden Wachstumsmedien + 50 & mgr; l R-spondin1konditionierten Medien pro Vertiefung. Inkubiere Platten bei 37 ° C über Nacht.

5. Überzug Organoide an Tag 14 für Mustererkennung Rezeptorstimulation mit PAMPs und Listeria monocytogenes für die Genexpressionsanalyse

  1. Zwei Tage vor der Herausforderung, Streifen aus L. monocytogenes auf einer BHI - Agar - Platte.
  2. Am darauffolgenden Tag ein L. holen monocytogenes Kolonie und bei 37 ° C Schütteln über Nacht bei 200 rpm in 10 ml BHI broth wachsen.
  3. Auftauen Proteinmatrix auf Eis über Nacht bei 4 ° C am Tag vor organoiden Herausforderung. Warm eine sterile 24-Well-Platte auf 37 ° C für mindestens 30 min. Bereiten Sie organoiden Wachstumsmedien in Schritt 2.2 beschrieben und halten bei 37 ° C bis zur Verwendung.
  4. Entfernen organoiden Kultur aus Inkubator und beginnen Passagierung von Organoiden.
  5. Aspirat Medien 3-4 Vertiefungen und halten das abgesaugte Medium im 10 ml pipete wie dies verwendet werden, um die Proteinmatrix Abfall zu entfernen. Pipette undnach unten, um die Proteinmatrix Abfall von der Platte zu entfernen. Sanfte Schaben mit der Spitze einer 10 ml Pipette ist hilfreich bei der Proteinmatrix Tropfen Verdrängen. Übertragen Sie den Inhalt in ein 15 ml konischen Röhrchen.
  6. Inkubieren Sie die 15 ml konischen Röhrchen auf Eis für 10 min. Zentrifuge bei 125 × g für 10 min bei 4 ° C. Beobachten ein weißes Pellet am Boden des konischen Rohrs. aspirieren vorsichtig den Überstand etwa 100 & mgr; l Restüberstand zurücklassend.
  7. Resuspendieren organoiden Pellet in 5 ml eiskaltem 1x PBS und entfernen Sie zum Zählen einer 10-ul-Aliquot. In den 10-ul-Aliquot in die Mitte eines Hämocytometer ohne Deckglas. Overlay vorsichtig das Deckglas auf der Oberseite des Tropfens.
    HINWEIS: Die Hemocytometer mit Organoiden verstopfen, wenn die Glasobjektträger nicht zuerst entfernt wird.
  8. Zählen Sie die Gesamtzahl der Organoide über ein Lichtmikroskop in jedem Gitter / die gesamte Kammer des Hämozytometer und bestimmen die organoiden Konzentration: number der gesamten Organoide pro 10 ul gezählt.
  9. Entfernen Sie ein geeignetes Volumen von 15 ml konischen Röhrchen, die eine ausreichende Anzahl von Organoiden ermöglichen für den Test und Zentrifuge werden ausgesät diese Suspension bei 125 × g für 10 min.
    HINWEIS: Der Bereich zwischen 40-100 Organoide pro Vertiefung einer 24-Well-Platte für die RNA-Analyse ausreichend ist. Die typische organoiden Größe kann von 300 um bis 1000 um im Durchmesser liegen.
  10. Aspirieren den Überstand und das Pellet in 500 ml der Proteinmatrix ohne Luftblasen zu erzeugen. 50 ml organoiden / Protein-Matrix-Suspension pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte.
    HINWEIS: Die Menge der Proteinmatrix verwendet Organoiden zu resuspendieren für die Anzahl der Behandlungsbedingungen und technischen Replikaten variieren.
  11. In 500 ul organoiden Wachstumsmedien (ohne N-Acetyl-Cystein) in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C + 5% CO 2 für 1 Stunde.
  12. Bereiten Sie 2x Konzentrationen von PAMPs (dh Flagellin,Lipopolysaccharide) und L. leben monocytogenes. Messen Sie die OD von lebenden L. monocytogenes und Steak auf einer BHI Platte zum Zählen. Behandeln Sie Organoiden bei 1 x 10 6 koloniebildenden Einheiten (CFU) / ml.
    HINWEIS: Die OD auf CFU Bestimmung variiert von Bakterien geben und sollte vor beurteilt werden Stimulation zu organoiden. Zum Beispiel kann eine OD von 0,6 ≈ 1 x 10 9 CFU / ml für L. monocytogenes, sollte aber auch unabhängig vor dem Experiment bewertet werden.
  13. Streak aus einer seriellen Verdünnung von der Behandlung Bestand von L. monocytogenes , um genau die Behandlung CFU / ml bestimmen. Die Autoren finden , dass eine 1 x 10 8 Verdünnung von 100 & mgr; l auf einer BHI - Agar - Platte ausreichend ist , um Kolonien zu zählen , eine genaue KBE / ml zu bestimmen.
  14. Bereiten Sie eine Hitze getötet Lösung von L. monocytogenes , indem ein 1 ml Aliquot der lebenden L. Einnahme monocytogenes Lösung und Zentrifuge bei 5000 × g für 10 min. Saugen Sie den Überstand und WaschDas Bakterienpellet mit 1 ml 1x PBS.
    1. Zentrifugieren Sie die L. monocytogenes bei 5.000 xg für 10 min und das Pellet in 1 ml 1x PBS. Erhitzen Sie töten die L. monocytogenes in einem 1,7 ml Polypropylenröhrchen durch Erhitzen auf 80-90 ° C für 1 Stunde. Kultur ein 100 ul Aliquot der Hitze getötet L. monocytogenes auf einer BHI - Agar - Platte keine lebenden Bakterien bleiben zu bestätigen.
    2. Hinzufügen 500 ul des geeigneten 2x PAMP und / oder Mikrobe Behandlung auf 500 & mgr; l Medien resident in dafür vorgesehenen Vertiefungen durch den Benutzer bestimmt. Inkubieren bei 37 ° C + 5% CO 2 für 24 Std.
      HINWEIS: ein 500 ul Aliquot einer 2x PAMP / Mikrobe Behandlung zu 500 ul resident Medien hinzufügen, wird die Behandlungskonzentration bringen in einem Gesamtvolumen von 1 ml auf 1x.
  15. Am folgenden Tag manuell L. zählen monocytogenes - Kolonien für eine genaue Bestimmung der Behandlungs CFU / ml. Absaugen Medien von der Platte der behandelten Organoiden und waschen Brunnen trei mal mit 1x PBS.
  16. Gehen Sie zur RNA - Extraktion über Phenol / Chloroform - 11 oder einem RNA - Extraktions - Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bewerten Sie die Genexpression unter Verwendung von Standard - qRT-PCR 12.

6. Auflage Organoide am Tag 14 für PAMP und L. monocytogenes Herausforderung für die Protein-Analyse in Supernatant

  1. Zwei Tage vor der Herausforderung, starten Sie eine Zellkultur von Caco-2 - Zellen, Aussaatdichte ≈1 x 10 6 Zellen in einem T-75 - Kolben mit 1x DMEM + 20% FBS und brüten die Caco-2 - Zellen bei 37 ° C + 5 % CO 2. Beginnen Sie eine Bakterienkultur von L. monocytogenes auf BHI Platte und inkubieren Platte in einem bakteriellen Inkubator bei 37 ° C.
  2. Am darauffolgenden Tag ein L. holen monocytogenes Kolonie und bei 37 ° C über Nacht in 10 ml BHI - Brühe wachsen. Auftauen Proteinmatrix auf Eis über Nacht bei 4 ° C am Tag vor organoiden Herausforderung.
  3. Am folgenden Tag warme sterile 96-Well-schwarz-walledbis 37 ° C Platte mindestens 30 min für. Bereiten Sie organoiden Nährmedien ohne N-Acetyl-Cystein beschrieben in Schritt 2.2 und halten bei 37 ° C bis zur Verwendung. Entfernen organoiden Kultur aus Inkubator und beginnen Passagierung von Organoiden.
    HINWEIS: Die typische organoiden Größe von 300 um bis 1000 um im Durchmesser reichen.
  4. Aspirat Medien 3-4 Vertiefungen und halten das abgesaugte Medium im 10 ml pipete wie dies verwendet werden, um die Proteinmatrix Abfall zu entfernen. Resuspendieren mit einer Pipette, um die Proteinmatrix Tropfen von der Platte zu entfernen. Sanfte Schaben mit einer 10 ml Pipette ist hilfreich bei der Proteinmatrix Tropfen Verdrängen. Übertragen Sie den Inhalt in ein 15 ml konischen Röhrchen.
  5. Inkubieren Sie die 15 ml konischen Röhrchen auf Eis für 10 min. Zentrifuge bei 125 × g für 10 min bei 4 ° C. Beobachten ein weißes Pellet am Boden des konischen Rohrs. aspirieren vorsichtig den Überstand 100 & mgr; l Restüberstand zurücklassend.
  6. Resuspendieren organoiden Pellet in 5 ml eiskaltem1x PBS und 10 ul-Aliquot zum Zählen entfernen. In den 10-ul-Aliquot in die Mitte eines Hämocytometer und sanft das Deckglas überlagern.
    HINWEIS: Die Hemocytometer mit Organoiden verstopfen, wenn die Glasobjektträger nicht zuerst entfernt wird.
  7. Zählen der Gesamtzahl der Organoide über ein Lichtmikroskop in jedem Raster der Zählkammer / die gesamte Kammer und bestimmen die organoiden Konzentration: Anzahl total Organoide pro 10 ml gezählt.
  8. Entfernen Sie ein geeignetes Volumen von 15 ml konischen Röhrchen, die eine ausreichende Anzahl von Organoiden ermöglichen für den Test und Zentrifuge werden ausgesät diese Suspension bei 125 × g für 10 min.
    HINWEIS: Die Menge der Proteinmatrix verwendet Organoiden zu resuspendieren für die Menge der Behandlungsbedingungen und technischen Replikaten variieren. Die Autoren finden, dass 40-100 Organoiden für sezernierte Proteinanalyse ausreichend ist.
  9. Den Überstand aspirieren und das Pellet in 500 ul Proteinmatrix / Vertiefung ohne ErzeugungLuftblasen.
    HINWEIS: Die Menge der Proteinmatrix verwendet Organoiden zu resuspendieren für die Menge der Behandlungsbedingungen und technischen Replikaten variieren.
  10. Lassen Sie mindestens zwei Spalten leer auf dem 96-Loch-schwarz-walled Gewebekulturplatte, da diese dienen als Brunnen mit Caco-2-Zellen zur Erzeugung einer Standardkurve ausgesät. In 50 ul Proteinmatrix + organoiden Suspension pro Vertiefung auf eine vorgewärmte 96-Well-schwarz-walled Gewebekulturplatte. Lagern Sie die Platte bei 37 ° C für 10 min Proteinmatrix zu ermöglichen, sich zu verfestigen.
  11. 100 l organoiden Wachstumsmedien (ohne N-Acetyl-Cystein) in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C + 5% CO 2 für 1 Stunde.
  12. Bereiten Sie 2x Konzentrationen von PAMPs und leben L. monocytogenes. In 100 ml jeder gegebenen Behandlungsbedingungen pro Vertiefung und für 24 Stunden inkubiert.
  13. Am folgenden Tag Platte Caco-2-Zellen in den Standardkurve Brunnen. Beginnen Sie mit der Erwärmung sterile 1x PBS, 0,25% Trypsin und 1x DMEM + 20% FBS to 37 ° C.
  14. Entfernen der T-75-Kolben Caco-2-Zellen enthält, und die Zellkulturmedium anzusaugen. Waschen Sie die Zellen mit 10 ml 1x PBS. Absaugen 1x PBS, 2 ml 0,25% Trypsin und Platz T-75-Kolben in 37 ° C Inkubator für 15 min.
  15. DMEM + 20% FBS zu den abgelösten Caco-2-Zellen und Überführung in eine 15 ml konischen Röhrchen Visualisieren der Kolben wird unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, wurden die Zellen abgelöst dann 8 ml 1x hinzufügen. Entfernen Sie ein 10-ul-Aliquot und zählen Sie die Zellen durch Lichtmikroskopie eine Zählkammer.
    HINWEIS: Eine obere Zellzahl von 60.000 Zellen / Vertiefung funktioniert gut und Verdünnungen können zur Erzeugung der Standardkurve durchgeführt werden, bis zu 2.500 Zellen / Well.
  16. Resuspendieren der Caco-2-Zellen in Protein-Matrix und 50 & mgr; l pro Vertiefung zu geeigneten Vertiefungen. Lassen Sie die Proteinmatrix bei 37 ° C für Caco-2-Zellen zu verfestigen.
    Anmerkung: Die Wachstumsmedien für die Caco-2-Zellen nicht braucht nach dem Erstarren der Proteinmatrix hinzugefügt werden.
  17. folgendedie 24 Stunden Behandlungszeit für den organoiden Assay, absaugen und die organoide Zellüberstand Medien speichern und auf Eis halten. Waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1x PBS. 100 l 100% Methanol in jede Vertiefung der Caco-2-Standardkurve Brunnen einschließlich und Inkubation bei 4 ° C oder auf Eis für 20 bis 30 min die Organoiden zu beheben.
    HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, dass die Caco-2-Standardkurve Brunnen mit 1x PBS gewaschen werden, da sie Methanol direkt hinzugefügt haben können.
  18. Nach dem Methanol Inkubation waschen Vertiefungen dreimal mit eiskaltem 1x PBS. Lagern Sie die Platte bei 4 ° C für bis zu 1-2 Wochen.
  19. Kernanfärbung Farbstoff hinzufügen bei einer Konzentration von 1 ug / ml pro Vertiefung, die Platte abgedeckt mit Aluminiumfolie und Inkubation bei 4 ° C über Nacht.
  20. Verwenden Sie eine 96-Well-Plattenleser Kernanfärbung Farbstoff Anregung / Emission (350 nm / 461nm beziehungsweise) und normalisieren jede organoiden gut mit der Standardkurve von Caco-2-Zellen zu messen.
  21. Weiter zu Downstream-Assays, wie ELISA

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Representative Results

Wenn dieses Protokoll nach einer Darm Organoiden zu pflegen, charakteristische Kugel geformt Organoiden wird nach der Ernte vorhanden sein. Die Zugabe von R-spondin1 konditionierten Medien täglich wird das Wachstum und die Knospung der Organoide initiieren. Das Wachstum von Organoiden ist in 1A gezeigt - F, und ist repräsentativ für intestinale Organoide an den Tagen 1, 2, 4, 5, 6 und Tag 14. 1F inhomogenen Wachstumseigenschaften von Organoiden am Tag 14 darstellt.

Sobald die Organoiden zu einer ausreichenden Zahl gezüchtet werden, können sie erneut ausplattiert und mit verschiedenen PAMPs und / oder Mikroben in Frage gestellt werden. Expressionsanalyse kann über Standardtechniken durchgeführt werden. Dies ist in Figur 2A-C dargestellt , die die mRNA - Expression von inflammatorischen Zytokinen IL-18 zeigt, IL-6 und TNF & agr; die eine folgende analysiert24 - Stunden - Herausforderung von Organoiden mit durch Hitze abgetöteten L. monocytogenes und die PAMP Flagellin. Die Gründe für die mRNA-Expression Auswertung Zytokine IL-18, IL-6 und TNFa war, dass diese waren gute Kandidaten für die von Epithelzellen in Reaktion auf pathogene Herausforderung moduliert wird, und die Modulation dieser inflammatorischen Zytokinen würde die Wirksamkeit der Technik demonstrieren.

3A - C zeigt die relative Kernfärbung der intestinalen Organoide mit Kernanfärbung Farbstoff folgende Fixierung mit minimalen Hintergrundfärbung von Ablagerungen im residenten Proteinmatrix. Diese Methode der Fixierung und Färbung kann angewendet werden, Assays zu normalisieren, die für unterschiedliche Zellzahlen in jeder Vertiefung ausmachen werden. Dies ergibt sich in Figur 4 , wenn eine Standardkurve von seriellen Verdünnungen von Caco-2 - Zellen ausplattiert in Proteinmatrix zu erzeugen, dann fixiert und gefärbt mit KernFärbung Farbstoff. Der R 2 -Wert von 0,89 zeigt eine lineare Beziehung zwischen der Zellzahl und die mittlere Fluoreszenzintensität und die lineare Gleichung verwendet werden kann Organoide auf die Zellzahl zu normieren. Die Standardkurve in Abbildung 4 beginnt die Sättigungsgrenze über 30.000 Zellen pro Vertiefung zu erreichen. Eine Titration von Zellen über 30.000 Zellen pro Vertiefung wurde in 4 umfassen die Sättigungsbereich der Kernfärbung Farbstoff gezeigt. Erhöhte Genauigkeit der Normalisierung wird mit einer Zellzahl erhalten werden, die den linearen Bereich der Kernfärbung Farbstoff reflektiert, bevor die Sättigungsgrenze erreicht ist.

Abbildung 1
Abb . 1: Kleine Intestinale organoiden Wachstum Zeit Wachstumskurs für Maus - Dünndarm abgeleitet Organoiden nach der Isolierung. (A) 1. Tag (B) 2. Tag (C) 4. Tag (D) 5. Tag (E) 6. Tag (F) 14. Tag : Bilder repräsentativ für jeden bestimmten Tag von organoiden Wachstum. Maßstabsbalken gleich 200 & mgr; m im linken Bild für A, B, C, D und E. Maßstabsbalken gleich 100 & mgr; m im rechten Bild für A, B, C, D und E. Maßstabsbalken gleich 1000 um und 200 um für linke und rechte Bilder für F sind. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: mRNA Expression von inflammatorischen Zytokinen Nach 24 Stunden PAMP Herausforderung Relative mRNA - Expression von Wildtyp - Darm-Organoiden für 24 Stunden in Frage gestellt mit PAMPs und Hitze getötet Listeria monocytogenes (A - C) darstellen fache Änderung des i.. nflammatory Zytokine IL-18, IL-6 und TNF & agr; sind. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichung (SD) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Relative Fluorescent Anfärbung von Organoide für Normalisierungskernfärbung von Organoiden mit Fixierung folgen.. (A) Hellfeld von Organoiden. (B) Fluoreszenzfärbung von Organoiden mit Kernfärbung Farbstoff. (C) zusammengefügte Bild von Hellfeld und Fluoreszenzfärbung. Maßstabsbalken gleich 400 & mgr; m in allen Bildern. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

"> Abbildung 4
Abbildung 4: Standardkurve erzeugt von Caco-2 - Zellen Standardkurve aus drei Vertiefungen erzeugt.. Zellaussaat hatte eine Reichweite bei 60.000 Zellen pro Vertiefung beginnend mit Verdünnungen bis zu 2500 Zellen pro Vertiefung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5:. Übersicht des Protokolls Diagramm 1-Top Panel der Figur zeigt die R-spondin1 konditionierten Medien Ernte. 2-mittlere Platte der Figur zeigt Aspekte des Protokolls zu ernten und Kultur Maus kleine Darm-Organoiden. 3-Unterseite der Figur zeigt: (A) Die Plattierung einer 14 Tage kultiviert Organoiden. (B) Herausforderung mit PAMPs / L.monocytogenes und verlassen unbesetztes Vertiefungen einer Standardkurve. (C) Nach der PAMP Herausforderung, das Plattieren von Caco-2 - Zellen in den vorher unbesetztes Vertiefungen zu erzeugen , um eine Standardkurve zu erzeugen. (D) Nach der Fixierung und Zugabe eines Kernfärbung Farbstoff, Messung der Anregung / Emission der Vertiefungen und Normalisierung gegen eine Standardkurve. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Kultur und die Wartung der intestinalen Organoide ist eine Prozedur, die von jedem einzelnen mit ausreichender Gewebekultur Technik beherrscht werden kann. Es gibt Feinheiten in Passagierung im Vergleich zu Zellen in einer konventionelleren Monoschicht wachsen, aber diese Feinheiten sind nicht schwierig zu überwinden. Die kritischen Schritte dieses Verfahrens beinhalten die Organoide auf eine ausreichend hohe Dichte für optimale seeding wachsen zu können. Die Versuche müssen nach unten mit Organoiden skaliert werden als große Einsaatdichten, die häufig im Zusammenhang mit Zelllinien erreicht werden kann, nicht praktikabel sind. Dies wird besonders deutlich, wenn mehrere Behandlungsgruppen sind.

Dieses Protokoll soll eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zu schaffen, Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen des Darmepithels mit einer Vielzahl von verschiedenen Bakterien zu untersuchen, viral, und fungale Pathogene, sowie Adress Schwierigkeiten dieses Systems in Bezug auf die Normalisierung verwendet wird. Berichte werden, dass describ verfügbare die Wechselwirkungen von Darm Organoide mit dem bakteriellen Erreger Salmonellen, noch adressieren Methoden Normalisierung nicht , wenn Zytokine 13 zu messen.

Es gibt mehrere Probleme, die auftreten, wenn organoiden Kulturen mit verschiedenen Methoden zu normalisieren. Normalisieren sezerniertes Protein über Bicinchoninsäure (BCA) ist eine Option; jedoch erforderlich , die Wachstumskomponenten für organoiden Kultur (N2 und / oder Vitamin B27) interferieren mit dem BCA - Assay (Daten nicht gezeigt) Normalisieren über zelluläre Lebensfähigkeit, wie beispielsweise eine modifizierte MTT - Assay wurde 14 beschrieben worden ist . jedoch eine Behandlung, die die mitochondriale Stoffwechselaktivität der Organoide verändern wird , wird eine ungenaue Methode zur Normalisierung über diese Technik als MTT einzuführen basiert auf Reduktion durch Einwirkung von mitochondrialen Dehydrogenasen 15. Es ist auch notwendig, N-Acetyl-Cystein (NAC) von den Medien, nicht zu entfernen,ly wenn Technik Normalisierung über die MTT erwünscht ist, aber mit einem bakteriellen Krankheitserreger , wie NAC 16 kann das Bakterienwachstum hemmen , wenn die Behandlung.

Vorteile dieser Technik sind, dass sekretierte Zytokine und Proteinprodukte von Organoiden jetzt normalisierten gegen eine Standardkurve von Caco-2-Zellen sein kann. Einschränkungen dieser Technik sind, daß die Normalisierung, weil korrelativen ist eine Kernfärbung der nicht transformierten primären epithelialen Organoide werden normalisiert gegen die Kernfärbung eines Kolonkarzinom-Zelllinie. Die Autoren finden, dass mit Kern mit Methanol und Färbung Kerne Befestigung Farbstoff-Anfärben ist eine wirksame Normierungstechnik gegen eine Standardkurve von Caco-2-Zellen. Obwohl die Wachstumseigenschaften dieser Krebszelllinie Kolon nicht genau die Wachstumseigenschaften der intestinalen Organoiden nachahmen, eine Kernfärbung mit und mittlere Fluoreszenzintensität messen, ist eine gute Strategie gegen Gesamtzellzahl zu normalisieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11050 (Section 1, 3, 6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo (Section 1, 3)
DMEM GE Healthcare Sh30243.01 (Section 1, 6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. 
50 ml conical tube Falcon 352070 (Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask Corning 431079 (Section 1) Or equivalent brand 
Protein Matrix Corning 356231 (Section 2, 3, 4, 5, 6) Matrigel Growth Factor Reduced 
HyClone Dulbecco's (DPBS) GE Healthcare SH30264.01 (Section 2, 3)
DMEM/F12  Life Technologies 12634-010 (Section 2, 3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates Corning 3524 (Section 2)
N2 Supplement 100x  Life Technologies 17502-048 (Section 2)
B27 without vitamin A 50x  Life Technologies 12587-010  (Section 2)
Trizol Life Technologies 15596-026 (Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax) Life Technologies 35050-061 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M) Life Technologies 15630-080 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 
10 ml Serological Pipet Falcon 357551 (Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin Peprotech 250-38 (Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165 (Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF Biolegend 585608 (Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable Bioexpres (Section 3)
dissecting scissors (Section 3)
forceps (Section 3)
glass slides (Section 3)
dissecting tweezers (Section 3)
25 ml Serological Pipet Falcon (Section 3)
EDTA  Sigma-Aldrich SLBB9821 (Section 3) 0.5 M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 (Section 3) Or equal sized TC dish
1 ml Syringe Becton Dickinson 309659 (Section 4)
Precision Glide Needle Becton Dickinson 305120 (Section 4) 23 G x 1 1/4 (0.6 mm x 30 mm)
Flagellin from Bacillus subtilis Invivogen tlrl-bsfla  (Section 5, 6)
Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Section 5, 6) (Murray et al.) 
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA (Section 5, 6) Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar Becton Dickinson 211065 (Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion Becton Dickinson 237500 (Section 5)
Caco-2 ATCC HTB-37 (Section 6)
Trypsin  gibco 25200056 (Section 6)
Methanol Fisher A412-4 (Section 6)
SpectraMax M5 Molecuar Devices (Section 6)
96 Well Assay Plate Corning 3603 (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye Life Technologies H1399 (Section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask Corning 430641 (Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube Falcon 352096 (Section1, 3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube Bioexpress C-3262-1 Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep Zymo Research R1054 Or equivalent brand
TNF-alpha  Applied Biosystems Mm 00443260_g1 Taqman gene expression assay kit
IL-6  Applied Biosystems (Mm 00446190_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-1beta Applied Biosystems Mm 00434228_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-18 Applied Biosystems Mm 00434225_m1 Taqman gene expression assay kit
18s Applied Biosystems Hs 99999901_s1 Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix Life Technologies 4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies/Applied Biosystems 4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml Life Technologies/Applied Biosystems 4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/ml
chloroform Sigma-Aldrich C7559

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References

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