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1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 3School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Published 5/18/2016
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Immunology and Infection

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Summary

Aquí, se describe un protocolo para la cosecha, mantener y tratar de ratón pequeñas organoides intestinales con patrones patógenos asociados moleculares (PAMPs) y Listeria monocytogenes, así como énfasis en la expresión génica y las técnicas de normalización adecuados para las proteínas.

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Rothschild, D. E., Srinivasan, T., Aponte-Santiago, L. A., Shen, X., Allen, I. C. The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (111), e54033, doi:10.3791/54033 (2016).

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Abstract

organoides intestinales primarias son un sistema modelo valioso que tiene el potencial de impactar significativamente el campo de la inmunología de la mucosa. Sin embargo, la complejidad de las características de crecimiento de organoides llevan advertencias importantes para el investigador. En concreto, los patrones de crecimiento de cada individuo organoide son muy variables y crear una población heterogénea de células epiteliales en cultivo. Con tales advertencias, las prácticas de cultivo de tejidos comunes no pueden ser simplemente aplican al sistema organoide debido a la complejidad de la estructura celular. Contando y enchapado basándose únicamente en el número de células, que es común para las células separadas individualmente, tales como líneas celulares, no es un método fiable para organoides menos que se aplique alguna técnica de normalización. La normalización de contenido total de proteínas se hace compleja debido a la proteína de la matriz residente. Estas características en términos de número de células, forma y tipo de célula deben tenerse en cuenta al evaluar con secretadatiendas de campaña de los medios de organoid. Este protocolo se ha generado para establecer un procedimiento sencillo para la cultura y tratar pequeños organoides intestinales con patógenos microbianos y patógenos asociados a patrones moleculares (PAMPs). También hace hincapié en las técnicas de normalización que se deben aplicar al análisis de proteínas se llevan a cabo después de un desafío.

Introduction

La capacidad de la cosecha y organoides cultivo primario se han descrito para el intestino delgado, colon, páncreas, el hígado y el cerebro y son emocionantes avances pertinentes a la comprensión de un fenómeno más fisiológicamente representante para la biología del tejido 1-5. Los primeros métodos que describen la cultura y el mantenimiento de pequeñas organoides intestinales se informó por Sato et al. Fuera del laboratorio de Hans Clevers 1. Con anterioridad a este método, la recolección y cultivo de células epiteliales intestinales primarias demostró ser limitado e ineficaz para sostener el crecimiento de las células epiteliales. Los métodos incluyen la disociación del tejido por medio de incubación con enzimas, como la colagenasa y dispasa, lo que en última instancia conducir a la derivación de células de fibroblastos primarios mezclados 6. Estas condiciones también podrían tener duración limitada en el mantenimiento del cultivo de células epiteliales. Un mínimo o ningún nicho de células epiteliales formarían, como las células epiteliales entrarían en la apoptosis debido a lala falta de factores de crecimiento apropiados o pérdida de la integridad de contacto, denominado anokis 7. El advenimiento del sistema de cultivo 3D-organoide ha proporcionado un método para las células intestinales primarias de cultivo que contenían un espectro de tipos de células intestinales en cultivo sostenido 1. Estos organoides epiteliales tienen ventajas sobre las líneas de células es que son compuestos de varias células diferenciadas, y imitan mejor el órgano que se derivan de 8 in vivo. El proceso para en última instancia "crecer un mini intestinal en un plato" ha demostrado ser una herramienta valiosa para la evaluación de la respuesta del epitelio intestinal bajo diferentes estímulos. La investigación de la interacción de las células intestinales primarias con patrones moleculares asociados a patógenos microbianos (PAMPs) es relevante para el campo de la inmunología como estos patrones moleculares pueden regular diversas respuestas de tanto el anfitrión como microbio 9. No sólo pueden ahora los investigadores explorar estas interacciones con los organoides ratón, peropuede cultivarse a partir de los seres humanos, así como 2. Esta tecnología tiene el potencial de alterar drásticamente la medicina personalizada y es tentador especular acerca de los avances que esta técnica hará posible en un futuro próximo.

El objetivo general de este método es el de proporcionar un protocolo para el cultivo, la expansión, y el tratamiento de organoides intestinales con una variedad de estímulos. Tales estímulos en última instancia, pueden variar de vacunas, PAMPs bacterianas, patógenos vivos, gastrointestinal (GI) y la terapéutica del cáncer. El aislamiento y la cultura de organoides intestinales de ratón ha sido adaptado de Sato et al. Aunque hay ligeras desviaciones del método original, el producto final es organoid cultura aún se logra cuando se sigue este protocolo. Este método se centra en la descripción de una técnica adecuada para la normalización adecuada cuando se trabaja con las estructuras celulares no homogéneos, que deben tenerse en cuenta cuando se realiza un ensayo basado en células nocre oscuro.

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Protocol

Toda la investigación fue aprobado y lleva a cabo bajo las directrices de Virginia Tech IACUC

1. Prepare R-Spondin1 medios condicionados de la línea celular HEK293T-Rspo1

  1. Generación de células HEK293T-Rspondin1 se ha descrito previamente 10. HEK293T-Rspondin1 Seed células secretoras en 5-10% de confluencia, aproximadamente 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 células, en un matraz T-175 con 40 ml de 1x de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de suero bovino fetal ( FBS) como el medio de crecimiento, y se incuba a 37 ° C + 5% de CO 2.
    NOTA: Los medios de crecimiento para las células secretoras de HEK293T-Rspondin1 servirán como medio acondicionado R-spondin1. R-spondin1 puede ser alternativamente comprar como un factor de crecimiento recombinante utilizado a una concentración final de 500 ng / ml.
  2. Cultivar las células HEK293T-Rspondin1 durante siete días o hasta alcanzar 95% de confluencia se determinó por microscopía de campo brillante. Recoger los 40 ml de medio condicionado y la transferencia a un 50tubo cónico ml. Desechar el matraz T-175 de células secretoras de HEK293T-Rspondin1.
  3. Centrifugar el tubo que contiene medio acondicionado a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar los restos celulares. Recoger el sobrenadante, denominado R-spondin1 medio condicionado, y alícuota en tubos de 15 ml. alícuotas almacenar a -20 ° C para el corto plazo o -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: los medios de comunicación Una vez descongelado, el R-Spondin1 acondicionado se pueden almacenar hasta 1 semana a 4 ° C.

2. Preparación de organoides Crecimiento Medios y Reactivos para la cosecha del Intestino Delgado Criptas  

  1. Un día antes de la cosecha, colocar la matriz proteica congelada en el hielo y el deshielo durante la noche a 4 ° C. Autoclave tijeras de disección, fórceps y portaobjetos de vidrio que serán usados ​​para la cosecha cripta.
  2. El día siguiente, comienza por preparar 40 ml de medio de crecimiento que contiene suplementos organoide y factores de crecimiento mediante la adición de concentraciones madre de 40 ml de 1x DMEM / F-12. Suplementos de medios contienen: mM 2- [4- (2-hidroxietil) piperazin-1-il] ácido etanosulfónico 10 (HEPES) - 400 l, 1x glutamina suplemento - 400 l, 1x B27 sin vitamina A - 400 l, 1x N2 - 200 l, 1 mM de N-acetil-cisteína - 40 l, 100 ng / ml de m-Noggin - 40 l, 50 ng / ml de m-EGF - 4 l y colocar en un baño de agua 37 ° C hasta su uso. Calentar una alícuota de 15 ml de R-spondin1 a 37 ° C en un baño de agua.
  3. tres platos calientes estériles de 24 pocillos a 37 ° C durante al menos 30 minutos, colocando en una incubadora. Preparar 50 ml por ácido ratón 1x Tampón fosfato salino (PBS) + 2 mM de etilendiamina (EDTA) y enfriar a 4 ° C. Preparar 100 ml por ratón 1x PBS que contenía FBS al 10% y se enfría a 4 ° C.

3. La recolección de Mus musculus del Intestino Delgado Criptas de organoides Cultura 1

  1. Sacrificar una edad de sexo masculino de ratón C57B6 / J 6-12 semanas de edad criados en alimento estándar para roedores y agua disponiblesad libitum de acuerdo con las directrices institucionales. La eutanasia a través de asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical.
    NOTA: Mantenga la canal en hielo hasta la cosecha de tejidos y llevar a cabo la cosecha de tejidos en una cabina de seguridad biológica para reducir al mínimo el riesgo de contaminación.
    Nota: un ratón macho o hembra puede ser usada para generar organoides.
  2. (Opcional) Afeitarse el ratón para eliminar el pelo antes de sumergir en el 70% de etanol. Sumergir el ratón en etanol al 70% durante 2 min y el pin extremidades a bordo de la fijación con la cara dorsal del ratón para tocar la placa.
  3. Utilice pre-esterilizados disección tijeras y pinzas para hacer una incisión en la línea media en la parte ventral del ratón. Hacer la incisión en los genitales procedentes craneal a la base del cuello. Abrir la incisión de la piel lateralmente con unas pinzas y el pin de la piel a la junta fijar a exponer el peritoneo.
  4. Hacer una incisión en la línea media en el peritoneo del abdomen con tijeras de disección y doblar THe peritoneo con una pinza lateral y pines a la placa de colocación de clavos con el fin de exponer los órganos abdominales.
    NOTA: Tenga cuidado de no cortar los órganos abdominales.
  5. Retire el intestino delgado de la cavidad abdominal con pinzas de disección y tijeras cortando la unión proximal del intestino delgado conectado al estómago y la unión distal conectado al ciego. Coloque el intestino delgado en una placa petri estéril que contiene 10 ml de hielo frío 1x PBS.
  6. Vaciar los contenidos contenidos dentro del lumen del intestino delgado con hielo frío 1x PBS usando una pipeta de 1 ml. Repita este paso hasta que se elimina los restos dentro de la luz del intestino delgado.
  7. Cortar el intestino delgado con tijeras de disección en 3-4 tiras de longitud aproximadamente igual y sentar las tiras longitudinalmente sobre una nueva placa de Petri estéril. Para cada tira, inserte el borde de corte de las tijeras de disección en el interior del lumen del intestino delgado para hacer una incisión de toda la longitud of la tira. El uso de fórceps para doblar lateralmente abierta la incisión con el fin de exponer el lumen del intestino delgado.
  8. Utilice un portaobjetos de vidrio estéril para raspar suavemente las vellosidades en la superficie luminal del intestino delgado. Cortar el intestino delgado en tiras de longitud de 1-2 cm con tijeras de disección y la transferencia de estas tiras a un tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de hielo frío PBS 1x.
  9. Mezclar el contenido suavemente invirtiendo el tubo cónico de 50 ml y permiten que el contenido de tejido para asientan en el fondo del tubo cónico de 50 ml. Aspirar el PBS 1x y repetir esto tres veces lavando el tejido con 10 ml de hielo frío 1x PBS. En el lavado final dejar el tubo cónico en hielo durante 10 min que contiene 10 ml de 1x PBS y los pequeños segmentos de tejido delgado.
  10. Aspirar el PBS 1x y añadir 25 ml de PBS 1x + 2 mM EDTA. Colocar en una plataforma oscilante a 4 ° C o en un cubo de hielo durante 45 minutos. Mientras que el tejido está incubando, etiquetar seis tubos de 15 ml cónicos "fracción nº 1-6."
  11. Permitir que el contenido de tejido para asientan en el fondo del tubo. Retirar y transferir el sobrenadante al tubo de 15 ml cónico etiqueta "fracción 1". Repetir el 1x PBS + FBS al 10% agitando paso (3.11) cinco veces y transferir el contenido de sobrenadante con el fin de el tubo de fracción etiquetado adecuadamente.
  12. Centrifugar a 125 g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las bolitas en 5 ml previamente calentada 1x DMEM / F-12, sin factores de crecimiento añadidos.
  13. Centrifugar a 78 xg durante 2 min. Aspirar 4 ml del sobrenadante y resuspender cada pellet en 1 ml de medio restantes.
  14. Eliminar 20 ml de cada fracción y añadir a un portaobjetos de vidrio. Visualizar criptas y escombros bajo un microscopio de luz y determinación de las fracciones de combinar y agrupar en consecuencia para lograr el mayor percentage de las criptas a relación de escombros.
    NOTA: Las fracciones 2-6 produzca el mayor porcentaje de criptas a ser plateado. Las fracciones a la piscina son lo más a menudo fracción 3 con la fracción 4, 5 y la fracción con la fracción 6.
  15. fracciones de centrífuga que se colocaron en placas a 125 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante dejando 50-100 l restante por encima de la pastilla.
  16. Mantener los tubos en hielo y se añade 1 ml de matriz de proteína a las fracciones reunidas. Pipetear hacia arriba y hacia abajo lentamente para evitar la incorporación de burbujas de aire.
  17. Eliminar placas de 24 pocillos pre-calentado desde 37 ° C incubadora y añadir 50 l de matriz de proteína suspensión / cripta en el medio de cada pocillo. La transferencia de la placa de cabeza de serie a una incubadora a 37 ° durante 10 min para permitir la caída de matriz de proteína que se solidifique.
  18. Añadir 450 l de medio de cultivo previamente preparadas organoides + 50 l de R-spondin1 medios condicionados por pocillo. Incubar las placas a 37 ° C + 5% de CO 2 durante la noche.
  19. Añadir 50-100 l de acondicionado R-spondin1 mediuna por pocillo diariamente. Todos los días reemplazar todo medio de crecimiento recién preparado organoid con medios de cultivo organoid 450 l / pocillo descrito en el paso 2.2. Además añadir 50-100 l de medio acondicionado R-spondin1 por pocillo.
    NOTA: La caída de matriz de proteína mantiene su integridad durante una semana, pero después de 7 días proceda a organoides pases.

4. Cada pases organoides Día

  1. Descongelar la matriz de proteína durante la noche en hielo a 4 ° C el día antes de los pases. Cálido una placa de 24 pocillos estériles a 37 ° C durante al menos 30 minutos. Preparar los medios de crecimiento organoides descritos en el paso 2.2 y mantenerse a 37 ° C hasta su uso.
  2. Retire la placa de organoid de la incubadora y comenzar pases de la placa de hielo. Aspirar el medio de cultivo con una pipeta 10 ml de 3-4 pozos para empezar.
    NOTA: Mantenga los medios de comunicación aspirado en la pipeta de 10 ml, ya que este será utilizado para desalojar la caída de matriz de proteína en la siguiente etapa.
  3. En el quepirateados pozos, pipeta arriba y abajo con el fin de desalojar a la caída de matriz de proteína de la placa. raspado suave con la punta de una pipeta de 10 ml es útil para desalojar la caída de matriz de proteína. Transferir el contenido a un tubo cónico de 15 ml.
  4. Incubar los tubos de 15 ml cónicos en hielo durante 10 min y se centrifuga a 125 xg durante 5 min a 4 ° C. Observar un pellet blanco en la parte inferior del tubo cónico. aspirar suavemente y desechar la mayoría de la / medio de crecimiento organoide viejo sobrenadante por encima del sedimento organoide dejando 100-200 l por encima de la pastilla.
  5. Romper las criptas organoides mediante el uso de una aguja de calibre 23 unida a una jeringa de 1 ml. Aspirar y expulsar 10-15 veces con el fin de disociar las criptas. Minimizar la formación de burbujas de aire debido a la excesiva pipeteo.
  6. Resuspender las organoides en 500 l de matriz de proteína y añadir 50 l por pocillo en una nueva placa de pre-calentado 24. Añadir 450 l de medio de crecimiento organoides previamente preparados + 50 l de R-spondin1medio acondicionado por pocillo. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche.

5. Revestimiento organoides el día 14 de Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación con PAMP y de Listeria monocytogenes para análisis de expresión génica

  1. Dos días antes de la exposición, consecutivas a cabo L. monocytogenes en una placa de agar BHI.
  2. Al día siguiente, elija un L. monocytogenes colonia y crecer en 10 ml de caldo BHI a 37 ° C durante la noche con agitación a 200 rpm.
  3. Descongelar la matriz de proteína durante la noche en hielo a 4 ° C el día antes de la exposición organoid. Cálido una placa de 24 pocillos estériles a 37 ° C durante al menos 30 minutos. Preparar los medios de crecimiento organoides descritos en el paso 2.2 y mantenerse a 37 ° C hasta su uso.
  4. Retire la cultura organoide de incubadora y comenzar pases de organoides.
  5. Aspirar los medios de 3-4 pozos y mantiene los soportes en el aspirado 10 ml pipeta de que esto va a ser utilizado para desalojar la caída de matriz proteica. Pipeta yabajo con el fin de desalojar a la caída de matriz de proteína de la placa. raspado suave con la punta de una pipeta de 10 ml es útil para desalojar la caída de matriz de proteína. Transferir el contenido a un tubo cónico de 15 ml.
  6. Incubar los tubos de 15 ml cónicos en hielo durante 10 min. Centrifugar a 125 xg durante 10 min a 4 ° C. Observar un pellet blanco en la parte inferior del tubo cónico. Se aspira suavemente el sobrenadante dejando aproximadamente 100 l de sobrenadante residual atrás.
  7. Resuspender el precipitado organoide en 5 ml de hielo frío 1x PBS y retirar una parte alícuota de 10 l para el recuento. Añadir la alícuota de 10 l de medio de un hemocitómetro sin la hoja de la cubierta de vidrio. superponer con cuidado el cubreobjetos de vidrio en la parte superior de la gota.
    NOTA: El hemocitómetro va a tapar con organoides si no se retira primero el portaobjetos de vidrio.
  8. Contar el número total de organoides a través de un microscopio de luz en cada cuadrícula / totalidad de la cámara del hemocitómetro y determinar la concentración organoid: numBER de organoides totales contadas por 10 l.
  9. Retirar un volumen apropiado del tubo cónico ml 15 que permitirá que un número adecuado de organoides que se sembraron para el ensayo y se centrifuga esta suspensión a 125 xg durante 10 min.
    NOTA: El rango entre 40-100 organoides por pocillo de una placa de 24 pocillos es suficiente para el análisis de ARN. El tamaño típico organoide puede variar desde 300 micras a 1000 micras de diámetro.
  10. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 ml de matriz de proteína sin la generación de burbujas de aire. Añadir 50 ml de / proteína de la matriz suspensión organoide por pocillo en una placa de 24 pocillos.
    NOTA: La cantidad de proteína de la matriz utilizada para volver a suspender organoides variará para el número de condiciones de tratamiento y técnicos repeticiones.
  11. Añadir 500 l de medio de crecimiento organoide (sin N-acetil-cisteína) a cada pocillo y se incuba a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 1 hora.
  12. Preparar las concentraciones 2x de PAMP (es decir, flagelina,lipopolisacárido) y vivir L. monocytogenes. Mida el diámetro exterior de L. vivo monocytogenes y carne en una placa BHI para el recuento. Tratar organoides a 1 x 10 6 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml.
    NOTA: El diámetro exterior de la determinación de CFU variará según el tipo y las bacterias deben ser evaluados antes de la estimulación de organoides. Por ejemplo, un diámetro exterior de 0,6 ≈ 1 x 10 9 UFC / ml para L. monocytogenes, sino que también deben ser evaluados de forma independiente antes del experimento.
  13. Consecutivas a cabo una dilución en serie del tratamiento stock de L. monocytogenes para determinar con precisión el tratamiento CFU / ml. Los autores encuentran que una dilución de 1 x 10 8 de 100 l en una placa de agar BHI es suficiente para contar las colonias para determinar una precisa CFU / ml.
  14. Preparar una solución de muertos por calor de L. monocytogenes mediante la adopción de una alícuota de 1 ml de la L. vivo monocytogenes solución y centrifugar a 5000 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y lavarel sedimento bacteriano con 1 ml de 1x PBS.
    1. Centrifugar la L. monocytogenes a 5.000 xg durante 10 minutos y volver a suspender el sedimento en 1 ml de PBS 1x. Calentar matar a la L. monocytogenes en un tubo de polipropileno de 1,7 ml por calentamiento a 80-90 ° C durante 1 hora. Cultura una alícuota de 100 l de calor mató a L. monocytogenes en una placa de agar BHI para confirmar que no queden bacterias vivas.
    2. Añadir 500 l de la PAMP 2x apropiado y / o el tratamiento de microbios a 500 l medios residentes en pocillos designados determinados por el usuario. Se incuba a 37 ° C + 5% de CO2 durante 24 horas.
      NOTA: La adición de una alícuota de 500 l de un tratamiento / microbio 2x PAMP a 500 l de los medios de comunicación residentes traerá la concentración de tratamiento a 1x en un volumen total de 1 ml.
  15. Al día siguiente, contar manualmente L. monocytogenes colonias para una determinación precisa de tratamiento CFU / ml. Aspirar los medios de comunicación de la placa de organoides tratados y lavar los pocillos tres veces con PBS 1x.
  16. Proceder a la extracción de RNA a través de fenol / cloroformo 11 o un kit de extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Evaluar la expresión génica mediante qRT-PCR estándar 12.

6. Revestimiento organoides el día 14 para PAMP y L. monocytogenes desafío para el análisis de proteínas en el sobrenadante

  1. Dos días antes de la exposición, iniciar un cultivo celular de células Caco-2, densidad de siembra ≈1 x 10 6 células en un matraz T-75 con 1x DMEM + 20% FBS y se incuban las células Caco-2 a 37 ° C + 5 % de CO 2. Iniciar un cultivo de bacterias de L. monocytogenes en la placa BHI y se incuban placa bacteriana en una incubadora a 37 ° C.
  2. Al día siguiente, elija un L. monocytogenes colonia y crecer en 10 ml de caldo BHI a 37 ° C durante la noche. Descongelar la matriz de proteína durante la noche en hielo a 4 ° C el día antes de la exposición organoid.
  3. Al día siguiente, uno cálido estériles de 96 pocillos negro de paredesplaca a 37 ° C durante al menos 30 min. Preparar el medio de crecimiento sin organoid N-acetil-cisteína se describe en el paso 2.2 y mantenerse a 37 ° C hasta su uso. Retire la cultura organoide de incubadora y comenzar pases de organoides.
    NOTA: El tamaño típico organoide puede variar desde 300 micras a 1000 micras de diámetro.
  4. Aspirar los medios de 3-4 pozos y mantiene los soportes en el aspirado 10 ml pipeta de que esto va a ser utilizado para desalojar la caída de matriz proteica. Resuspender con una pipeta a fin de desalojar la caída de matriz de proteína de la placa. raspando suavemente con una pipeta de 10 ml es de gran ayuda para desalojar la caída de matriz proteica. Transferir el contenido a un tubo cónico de 15 ml.
  5. Incubar los tubos de 15 ml cónicos en hielo durante 10 min. Centrifugar a 125 xg durante 10 min a 4 ° C. Observar un pellet blanco en la parte inferior del tubo cónico. Se aspira suavemente el sobrenadante dejando 100 l de sobrenadante residual atrás.
  6. Resuspender el precipitado organoid en 5 ml de hielo frío1x PBS y extraer una alícuota de 10 l para el recuento. Añadir la alícuota de 10 l de medio de un hemocitómetro y superponer suavemente el cubreobjetos de vidrio.
    NOTA: El hemocitómetro va a tapar con organoides si no se retira primero el portaobjetos de vidrio.
  7. Contar el número total de organoides a través de un microscopio de luz en cada cuadrícula de la hemocitómetro / toda la cámara y determinar la concentración organoide: número de organoides totales contados por cada 10 ml.
  8. Retirar un volumen apropiado del tubo cónico ml 15 que permitirá que un número adecuado de organoides que se sembraron para el ensayo y se centrifuga esta suspensión a 125 xg durante 10 min.
    NOTA: La cantidad de proteína de la matriz utilizada para volver a suspender organoides variará por el importe de las condiciones de tratamiento y técnicos repeticiones. Los autores encuentran que organoides 40-100 es suficiente para el análisis proteína secretada.
  9. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 l de matriz de proteína / pocillo sin generarburbujas de aire.
    NOTA: La cantidad de proteína de la matriz utilizada para volver a suspender organoides variará por el importe de las condiciones de tratamiento y técnicos repeticiones.
  10. Deja al menos dos columnas vacío en la placa de cultivo de tejidos bien negro de pared 96 ya que estos servirán como pozos sembraron con células Caco-2 para la generación de una curva estándar. Añadir 50 l de matriz proteica + organoid suspensión por pocillo de una placa de cultivo de tejidos negro de paredes pre-calentado 96. Almacenar la placa a 37 ° C durante 10 minutos para permitir la matriz de proteína que se solidifique.
  11. Añadir 100 l de medio de crecimiento organoide (sin N-acetil-cisteína) a cada pocillo y se incuba a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 1 hora.
  12. Preparar las concentraciones de PAMP 2x y vivir L. monocytogenes. Añadir 100 ml de cada condición de tratamiento dado por pocillo y se incuban durante 24 horas.
  13. La siguiente placa días células Caco-2 en los pocillos de la curva estándar. Comience por el calentamiento estéril 1x PBS, 0,25% de tripsina y 1x DMEM + 20% FBS to 37 ° C.
  14. Retirar el matraz T-75 que contienen células Caco-2 y aspirar el medio de cultivo celular. Se lavan las células con 10 ml de PBS 1x. Aspirar el PBS 1x, añadir 2 ml de tripsina 0,25% y el lugar matraz T-75 en la incubadora a 37ºC durante 15 min.
  15. Visualizar el matraz bajo un microscopio de luz para asegurar que las células han separado luego añadir 8 ml de 1x DMEM + 20% FBS a las células Caco-2 unifamiliares y transferir a un tubo cónico de 15 ml. Retirar una alícuota de 10 l y contar las células mediante microscopía óptica usando un hemocitómetro.
    NOTA: Un número superior de células de 60.000 células / pocillo funciona bien y diluciones puede llevarse a cabo para la generación de la curva estándar hasta 2.500 células / pocillo.
  16. Resuspender las células Caco-2 en la matriz de proteína y añadir 50 l por pocillo a los pocillos apropiados. Deje que la matriz de proteína se solidifique a 37 ° C durante células Caco-2.
    NOTA: Los medios de crecimiento para las células Caco-2 no tiene que ser añadido después de la solidificación de la matriz proteica.
  17. Siguiendoel tiempo de tratamiento de 24 horas para el ensayo organoid, aspirar y guardar los organoides medio sobrenadante celular y mantener en hielo. Lavar los pocillos tres veces con PBS 1x. Añadir 100 l de metanol al 100% a cada pocillo incluyendo los Caco-2 pozos curva estándar y se incuba a 4 ° C o en hielo durante 20 a 30 min para fijar los organoides.
    NOTA: No es necesario que las células Caco-2 pozos de la curva estándar se lavaron con PBS 1x, ya que pueden tener metanol añadido directamente.
  18. Después de la incubación metanol, se lavan los pocillos tres veces con PBS frío hielo 1x. Guarde la placa a 4 ° C durante un máximo de 1-2 semanas.
  19. Añadir colorante de tinción nuclear a una concentración de 1 mg / ml por pocillo, cubrir la placa con papel de aluminio y se incuba a 4 ° C durante la noche.
  20. Utilice un lector de placa de 96 pocillos para medir colorante de tinción nuclear de excitación / emisión (350 nm / 461nm respectivamente) y normalizar cada organoides bien a la curva estándar de células Caco-2.
  21. Proceder a ensayos posteriores, como la ELISA

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Representative Results

Cuando se sigue este protocolo para cultivar organoides intestinales, característicos organoides en forma de esfera estarán presentes después de la cosecha. La adición de R-spondin1 medio condicionado diaria iniciará el crecimiento y el florecimiento de los organoides. El crecimiento de organoides se muestra en la Figura 1A - F, y es representativa de organoides intestinales en los días 1, 2, 4, 5, 6 y el día 14. Figura 1F representa las características de crecimiento no homogéneos de organoides en día 14.

Una vez que los organoides se cultivan a un número adecuado, se pueden replated y desafiados con diversos PAMPs y / o microbios. El análisis de expresión se puede realizar a través de técnicas estándar. Esto se representa en la figura 2A-C que muestra la expresión de ARNm de citoquinas inflamatorias IL-18, IL-6, y TNF que se analizaron después de una24 h de organoides desafío con el calor mató a L. monocytogenes y la flagelina PAMP. La razón fundamental para la evaluación de la expresión de ARNm de citocinas IL-18, IL-6, y TNF era que estos eran buenos candidatos para ser modulada por las células epiteliales en respuesta al desafío patogénico, y la modulación de estas citoquinas inflamatorias demostraría la eficacia de la técnica.

Figura 3A - C demuestra la tinción nuclear relativa de organoides intestinal con colorante de tinción nuclear después de la fijación con una mínima tinción de fondo de escombros en la matriz de proteína residente. Este método de fijación y la tinción se puede aplicar a normalizar los ensayos, lo que dar cuenta de diferentes números de células en cada pocillo. Esto es evidente en la Figura 4 cuando se genera una curva patrón de diluciones en serie de células Caco-2 en placas en matriz de proteína, a continuación, fijaron y tiñeron con nuclearcolorante de tinción. El valor de R 2 de 0,89 indica una relación lineal entre el número de células y la media de intensidad de fluorescencia, y la ecuación lineal se puede utilizar para normalizar organoides a número de células. La curva estándar se representa en la figura 4 comienza a llegar al límite de saturación más allá de 30.000 células por pocillo. Una titulación de células anteriores 30.000 células por pocillo se ha demostrado en la Figura 4 para incluir el rango de saturación de colorante de tinción nuclear. se obtendrá una mayor precisión de la normalización con un número de células que refleja el rango lineal del colorante de tinción nuclear antes de que se alcance el límite de saturación.

Figura 1
Figura 1: Curso de Intestino Delgado organoid Crecimiento Tiempo de crecimiento para organoides derivados intestino delgado murino siguientes aislamiento.. (A) Día 1. (B) Día 2. (C) Día 4. (C) Día 5. (E) Día 6. (F Día) 14. Las imágenes son representativas de crecimiento organoid para cada día determinado. Las barras de escala son iguales a 200 micras de la imagen de la izquierda de A, B, C, D, y E. Escala bares igualan 100 micras en la imagen de la derecha para A, B, C, D y E. Escala bares igual a 1.000 micras y 200 micras para las imágenes izquierda y derecha para F, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Expresión de ARNm de citoquinas inflamatorias después de la exposición PAMP 24 hr expresión del ARNm relativa de tipo salvaje organoides intestinales desafiado durante 24 horas con PAMP y muertas por calor Listeria monocytogenes (A - C) representan factor de cambio de la i.. citoquinas nflammatory IL-18, IL-6 y TNF, respectivamente. Las barras de error representan la desviación estándar (SD) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: La tinción fluorescente relativa de organoides de Normalización tinción nuclear de organoides con posterioridad a la fijación.. (A) de campo claro de organoides. (B) tinción fluorescente de organoides con tinte de tinción nuclear. (C) imagen combinada de campo brillante y tinción fluorescente. Las barras de escala son iguales a 400 micras en todas las imágenes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

"> Figura 4
Figura 4: curva estándar generada a partir de células Caco-2 curva estándar generada a partir de pocillos por triplicado.. La siembra de células tenía una gama que va de 60.000 células por pocillo con diluciones abajo a 2.500 células por pocillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. Visión general del Protocolo Diagrama 1-Panel superior de la figura ilustra la cosecha de los medios de comunicación I-spondin1 acondicionado. Panel 2-Medio de la figura ilustra los aspectos de protocolo para la cosecha y el ratón cultura pequeñas organoides intestinales. Panel 3-Parte inferior de la figura ilustra: (A) El chapado de organoides cultivadas 14 días. (B) Desafío con PAMP / L.monocytogenes, y dejando pozos vacíos para generar una curva estándar. (C) Tras el reto PAMP, el forro de las células Caco-2 en los pozos previamente desocupadas para generar una curva estándar. (D) Después de la fijación y la adición de un colorante de tinción nuclear, la medición de la excitación / emisión de los pozos y la normalización frente a una curva estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La cultura y el mantenimiento de organoides intestinal es un procedimiento que puede ser dominado por cualquier persona con la técnica de cultivo de tejidos adecuados. Hay sutilezas en pases en comparación con las células que crece en una monocapa más convencional, pero estas sutilezas no son difíciles de superar. Los pasos críticos de este método implican ser capaz de cultivar las organoides a una densidad suficientemente alta para la siembra óptima. Los experimentos deben ser escalados hacia abajo con organoides como grandes densidades de siembra que comúnmente se pueden conseguir con las líneas celulares no son prácticos. Esto se hace especialmente evidente cuando hay múltiples grupos de tratamiento.

Este protocolo tiene por objeto proporcionar un método paso a paso para estudiar las interacciones huésped-patógeno del epitelio intestinal con una gran variedad de bacterias, patógenos virales, micóticas y, así como abordar las dificultades que utilizan este sistema con respecto a la normalización. Los informes están disponibles que describe interacciones de los organoides intestinales con el patógeno bacteriano Salmonella, sin embargo, no se refieren a los métodos de normalización en la medición de las citoquinas secretadas 13.

Hay varias dificultades que se encuentran cuando la normalización de las culturas organoides por diferentes métodos. La normalización de la proteína secretada a través de ensayo del ácido bicinconınico (BCA) es una opción; sin embargo, los componentes de crecimiento necesarios para el cultivo de organoide (N2 y / o vitamina B27) interfiere con el ensayo de BCA (datos no mostrados) a través de normalización de la viabilidad celular, tal como un ensayo de MTT modificado se ha descrito. 14; sin embargo, un tratamiento que va a alterar la actividad metabólica mitocondrial de los organoides introducirá un método incorrecto para la normalización por medio de esta técnica como MTT se basa en la reducción por la acción de deshidrogenasas mitocondriales 15. También es necesario para eliminar N-acetil-cisteína (NAC) de los medios de comunicación, no enLy si se desea normalización a través de la técnica de MTT, pero si el tratamiento con un patógeno bacteriano como NAC puede inhibir el crecimiento de bacterias 16.

Las ventajas de esta técnica son que las citoquinas secretadas y los productos de proteína de organoides ahora puede normalizarse contra una curva estándar de células Caco-2. Las limitaciones de esta técnica son que la normalización es correlativo porque tinción nuclear de organoides epiteliales primarias no transformadas se normalizan contra la tinción nuclear de una línea celular de cáncer de colon. Los autores encuentran que la fijación con metanol y tinción nuclear con núcleos la tinción de colorante es una técnica de normalización eficaz contra una curva estándar de células Caco-2. Aunque las características de crecimiento de esta línea celular de cáncer de colon no imitan exactamente las características de crecimiento de organoides intestinales, utilizando una tinción nuclear y la medición de intensidad de fluorescencia media es una buena estrategia para normalizar contra el número total de células.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11050 (Section 1, 3, 6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo (Section 1, 3)
DMEM GE Healthcare Sh30243.01 (Section 1, 6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. 
50 ml conical tube Falcon 352070 (Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask Corning 431079 (Section 1) Or equivalent brand 
Protein Matrix Corning 356231 (Section 2, 3, 4, 5, 6) Matrigel Growth Factor Reduced 
HyClone Dulbecco's (DPBS) GE Healthcare SH30264.01 (Section 2, 3)
DMEM/F12  Life Technologies 12634-010 (Section 2, 3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates Corning 3524 (Section 2)
N2 Supplement 100x  Life Technologies 17502-048 (Section 2)
B27 without vitamin A 50x  Life Technologies 12587-010  (Section 2)
Trizol Life Technologies 15596-026 (Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax) Life Technologies 35050-061 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M) Life Technologies 15630-080 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 
10 ml Serological Pipet Falcon 357551 (Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin Peprotech 250-38 (Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165 (Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF Biolegend 585608 (Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable Bioexpres (Section 3)
dissecting scissors (Section 3)
forceps (Section 3)
glass slides (Section 3)
dissecting tweezers (Section 3)
25 ml Serological Pipet Falcon (Section 3)
EDTA  Sigma-Aldrich SLBB9821 (Section 3) 0.5 M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 (Section 3) Or equal sized TC dish
1 ml Syringe Becton Dickinson 309659 (Section 4)
Precision Glide Needle Becton Dickinson 305120 (Section 4) 23 G x 1 1/4 (0.6 mm x 30 mm)
Flagellin from Bacillus subtilis Invivogen tlrl-bsfla  (Section 5, 6)
Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Section 5, 6) (Murray et al.) 
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA (Section 5, 6) Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar Becton Dickinson 211065 (Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion Becton Dickinson 237500 (Section 5)
Caco-2 ATCC HTB-37 (Section 6)
Trypsin  gibco 25200056 (Section 6)
Methanol Fisher A412-4 (Section 6)
SpectraMax M5 Molecuar Devices (Section 6)
96 Well Assay Plate Corning 3603 (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye Life Technologies H1399 (Section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask Corning 430641 (Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube Falcon 352096 (Section1, 3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube Bioexpress C-3262-1 Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep Zymo Research R1054 Or equivalent brand
TNF-alpha  Applied Biosystems Mm 00443260_g1 Taqman gene expression assay kit
IL-6  Applied Biosystems (Mm 00446190_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-1beta Applied Biosystems Mm 00434228_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-18 Applied Biosystems Mm 00434225_m1 Taqman gene expression assay kit
18s Applied Biosystems Hs 99999901_s1 Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix Life Technologies 4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies/Applied Biosystems 4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml Life Technologies/Applied Biosystems 4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/ml
chloroform Sigma-Aldrich C7559

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References

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