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1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 3School of Electrical and Computer Engineering, Cornell University, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

Published 5/18/2016
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Immunology and Infection

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Summary

Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.

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Rothschild, D. E., Srinivasan, T., Aponte-Santiago, L. A., Shen, X., Allen, I. C. The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (111), e54033, doi:10.3791/54033 (2016).

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Abstract

Organóides intestinais primárias são um sistema modelo valioso que tem o potencial para impactar significativamente o campo da imunologia da mucosa. No entanto, as complexidades das características de crescimento organ�de realizar ressalvas significativas para o investigador. Especificamente, os padrões de crescimento de cada organ�de indivíduo são altamente variáveis ​​e criar uma população heterogénea de células epiteliais em cultura. Com estas advertências, práticas de cultura de tecido comum não pode ser simplesmente aplicada ao sistema organ�de devido à complexidade da estrutura celular. Contando e revestimento com base exclusivamente no número de células, o que é comum para as células separadas individualmente, como as linhas de células, não é um método fiável para Organóides a menos que alguma técnica de normalização é aplicada. Normalizando para o conteúdo de proteína total é feita complexa devido à matriz proteica residente. Essas características, em termos de número de células, forma e tipo de célula devem ser levados em consideração ao avaliar con secretadatendas de massa organ�de. Este protocolo foi gerado para delinear um procedimento simples para a cultura e tratar pequenos Organóides intestinais com patógenos microbianos e padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Ele também enfatiza as técnicas de normalização que deve ser aplicado quando a análise de proteínas são conduzidas depois de um tal desafio.

Introduction

A capacidade de colher e Organóides cultura primária foram descritas para intestino delgado, cólon, pâncreas, fígado e cérebro e são avanços excitantes germano para entender um fenômeno mais fisiologicamente representante para a biologia do tecido 1-5. Os primeiros métodos que descrevem a cultura e manutenção de pequenas Organóides intestinal foi relatado por Sato et al. Para fora do laboratório de Hans Clevers 1. Antes deste método, e a colheita da cultura de células epiteliais intestinais primários mostrou-se limitado e ineficaz na sustentação do crescimento de células epiteliais. Os métodos incluíram dissociação de tecido através da incubação com enzimas, tais como a colagenase e dispase, o que em última instância conduzem à excrescência de células de fibroblastos primárias misturadas 6. Estas condições também ser limitada no tempo na manutenção da cultura de células epiteliais. Mínima para nenhum nicho de células epiteliais que formam, como as células epiteliais entraria apoptose devido àa falta de factores de crescimento adequados ou perda de integridade de contacto, denominado anokis 7. O advento do sistema de cultura 3D-organ�de tem proporcionado um método para células intestinais primárias de cultura contendo um espectro de tipos de células intestinais em cultura sustentada 1. Estes Organóides epiteliais tem vantagens em relação a linhas de células, sendo que elas são compostas por várias células diferenciadas, e melhor imitar o órgão de que são derivados a partir de 8 in vivo. O processo para, finalmente, "crescer um mini intestino em um prato de" provou ser uma ferramenta valiosa para a avaliação da resposta do epitélio intestinal, sob diferentes estímulos. Investigar a interacção de células intestinais primárias com padrões moleculares de agentes patogénicos microbianos associados (PAMPs) é relevante para o campo da imunologia como estes padrões moleculares pode regular diversas respostas de cada máquina e micróbio 9. Não só pode investigadores agora explorar estas interações com Organóides rato, mas elespodem ser cultivadas a partir de seres humanos bem como dois. Esta tecnologia tem o potencial de alterar drasticamente a medicina personalizada e é tentador especular sobre os avanços que esta técnica vai tornar possível no futuro próximo.

O objectivo geral do presente método é o de proporcionar um protocolo para a cultura, a expansão, e no tratamento de Organóides intestinais com uma variedade de estímulos. Tais estímulos podem, em última análise variam de vacinas, PAMPs bacterianos, patógenos vivos, gastrintestinal (GI) e cancro terapêutica. O isolamento e cultura de rato Organóides intestinais foi adaptado de Sato et al. Embora existam pequenos desvios do método original, o produto final sendo organ�de cultura ainda é alcançada quando seguindo este protocolo. Este método é focado em descrever uma técnica adequada para a normalização adequada quando se trabalha com estruturas celulares não homogéneos, que devem ser levados em consideração na condução de um ensaio baseado em células number.

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Protocol

Toda a investigação foi aprovado e conduzido sob diretrizes Virginia Tech IACUC

1. Prepare R-Spondin1 condicionado de mídia da linha de células HEK293T-Rspo1

  1. Geração de células HEK293T-Rspondin1 foi anteriormente descrito 10. HEK293T-Rspondin1 Semente células secretoras em 5-10% de confluência, aproximadamente 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 células, num frasco T-175 com 40 mL de 1x de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) + 10% de Soro Fetal Bovino ( FBS) como o meio de crescimento e incubar a 37 ° C + 5% de CO 2.
    NOTA: O meio de crescimento para as células secretoras HEK293T-Rspondin1 servirão como R-spondin1 condicionado mídia. R-spondin1 pode ser alternativamente adquirido como um factor de crescimento recombinante usada a uma concentração final de 500 ng / ml.
  2. Crescer as células HEK293T-Rspondin1 durante sete dias ou até atingir 95% de confluência determinado por microscopia de campo brilhante. Colheita das 40 ml de meios condicionados e transferência para um 50tubo cônico ml. Descarte o frasco T-175 de células secretoras de HEK293T-Rspondin1.
  3. Centrifugar o tubo contendo meio condicionado a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares. Recolhe-se o sobrenadante, denominado R-spondin1 meio condicionado, e alíquota para tubos de 15 ml. alíquotas armazenar a -20 ° C durante a curto prazo ou -80 ° C para armazenamento a longo prazo.
    NOTA: A mídia Uma vez descongelado, o R-Spondin1 condicionado pode ser armazenado por até 1 semana a 4 ° C.

2. Preparação de organ�de meio de crescimento e Reagentes para colheita pequeno Intestinal Crypts  

  1. Um dia antes da colheita, coloque a matriz proteica congelados no gelo e descongelar durante a noite a 4 ° C. Autoclave dissecando tesoura, pinça e lâminas de vidro que serão utilizados para a colheita cripta.
  2. No dia seguinte, começar por preparar 40 ml de meio de crescimento contendo suplementos organ�de e factores de crescimento por adição de concentrações estoque a 40 ml de 1x DMEM / F-12. Suplementos de meios contêm: mM de 2- [4- (2-hidroxietil) piperazin-1-il] ácido 10 etanossulfónico (HEPES) - 400 ul, glutamina 1x suplemento - 400 ul, 1x B27, sem vitamina A - 400 ul, 1x N2 - 200 ul, 1 mM de N-acetil-cisteína - 40 ul, 100 ng / ml de m-Noggin - 40 ul, 50 ng / mL de m-EGF - 4 ul e colocar num banho de água a 37 ° C, até utilização. Aquecer-se uma alíquota de 15 ml de R-spondin1 a 37 ° C num banho de água.
  3. Aquecer três placas de 24 poços estéreis a 37 ° C durante pelo menos 30 min por colocação dentro de uma incubadora. Preparar 50 ml por ratinho 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) + 2 mM de ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA) e arrefecer a 4 ° C. Preparação de 100 ml por rato 1x de PBS contendo 10% de FBS e arrefecer a 4 ° C.

3. Colheita Mus musculus pequeno Intestinal Crypts para organ�de Cultura 1

  1. Sacrificar uma idade rato C57B6 / J masculino 6-12 semanas de idade criados em ração padrão para roedores e água disponíveisad libitum de acordo com as diretrizes institucionais. Eutanásia através de asfixia com CO 2, seguida por deslocação cervical.
    Nota: Mantenha carcaça no gelo até a colheita de tecidos e realizar a colheita de tecidos em uma cabine de segurança biológica para minimizar o risco de contaminação.
    Nota: Um rato do sexo masculino ou do sexo feminino pode ser usado para gerar Organóides.
  2. (Opcional) Raspar o mouse para remover a pele antes de submergir em 70% de etanol. Mergulhe o rato em etanol 70% por 2 min e fixá-membros para fixar placa com o lado dorsal do mouse tocar na placa.
  3. Use pré-esterilizado dissecando tesouras e pinças para fazer uma incisão na linha média da porção ventral do rato. Adicione a incisão na genitália provenientes craniana à base do pescoço. Abra a incisão na pele lateralmente com uma pinça e pin a pele para a placa de fixação para expor o peritônio.
  4. Faça uma incisão na linha média no peritônio do abdômen com dissecando tesoura e dobre the peritônio com uma pinça lateral e pino para a placa de fixação, a fim de expor os órgãos abdominais.
    NOTA: Tenha cuidado para evitar o corte órgãos abdominais.
  5. Remover o intestino delgado a partir da cavidade abdominal com fórceps e tesouras de dissecação por corte a junção proximal do intestino delgado ligado ao estômago e a junção distai conectado ao ceco. Colocar o intestino delgado em uma placa de Petri estéril contendo 10 ml de gelo frio PBS 1x.
  6. Lavar o conteúdo contido no interior do lúmen do intestino delgado com gelo frio PBS 1x usando uma pipeta de 1 ml. Repetir este passo até que os detritos no interior do lúmen do intestino delgado é removido.
  7. Cortar o intestino delgado, com dissecando tesoura em 3-4 tiras de comprimento aproximadamente iguais e coloque as tiras longitudinalmente sobre uma nova placa de Petri estéril. Para cada tira, inserir a extremidade de corte da tesoura de dissecação no interior do lúmen do intestino delgado para fazer uma incisão de todo o comprimento óf tira. Use uma pinça para dobrar lateralmente a incisão aberta, de modo a expor o lúmen do intestino delgado.
  8. Usar uma lâmina de vidro estéril para raspar suavemente para longe da vilosidade na superfície luminal do intestino delgado. Cortar o intestino delgado em tiras de comprimento de 1-2 cm de altura com tesouras de dissecação e transferir estas tiras para um tubo cónico de 50 ml contendo 10 ml de gelo frio PBS 1x.
  9. Misturar suavemente o conteúdo invertendo o tubo cónico de 50 ml e permitir que o conteúdo do tecido para assentar no fundo do tubo de 50 ml. Aspirar o 1x PBS e repetir esta três vezes por lavagem do tecido com 10 mL de gelo frio PBS 1x. Na lavagem final sair do tubo cónico em gelo durante 10 min com 10 ml de PBS 1X e os pequenos segmentos de tecido intestinal.
  10. Aspirar o 1x PBS e adicionar 25 ml de 1x PBS + 2 mM de EDTA. Colocar numa plataforma de agitação a 4 ° C ou em um balde de gelo durante 45 min. Enquanto o tecido está incubando, rotular seis tubos de 15 ml cônico "fração # 1-6."
  11. Deixar o conteúdo do tecido para assentar no fundo do tubo. Remover o sobrenadante e transferir para o tubo de 15 mL cónico marcado "fracção 1". Repetir o 1x PBS + 10% de FBS agitação passo (3.11) cinco vezes e transferir o conteúdo de sobrenadante, a fim de o tubo de fracção rotulado de forma adequada.
  12. Centrifugar a 125 xg durante 5 min. Aspirar as pelotas sobrenadante e ressuspender em 5 mL de pré-aquecido 1x DMEM / F-12, sem factores de crescimento adicionados.
  13. Centrifugar a 78 g durante 2 min. Aspirar 4 ml do sobrenadante e ressuspender cada pellet em 1 ml de meio restantes.
  14. Retirar 20 ml de cada fracção e adicionar a uma lâmina de vidro. Visualize criptas e detritos sob um microscópio de luz e determinar quais as fracções de combinar e piscina de acordo para alcançar o maior percentage de criptas a relação de detritos.
    NOTA: rendimento Frações 2-6 o maior percentual de criptas a ser revestida. As frações de piscina são na maioria das vezes fracção 3 com valor correspondente a 4, e fração de 5 com fração de 6.
  15. fracções centrífuga para ser colocadas em placas a 125 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante deixando 50-100 ul permanecendo acima do pellet.
  16. Manter tubos em gelo e adiciona-se 1 ml de matriz de proteína para as fracções reunidas. Pipeta-se para baixo e lentamente para evitar a adição de bolhas de ar.
  17. Remover placas de 24 poços pré-aquecido de 37 ° C incubadora e adicionar 50 ul de suspensão de proteínas de matriz / cripta no meio de cada poço. Transferir a semeado-placa para uma incubadora a 37 ° C durante 10 min para permitir a queda de matriz de proteína para solidificar.
  18. Adicionar 450 uL de meio de crescimento organ�de previamente preparadas + 50 ul de R-spondin1 meio condicionado por poço. Incubar as placas a 37 ° C + 5% de CO 2 durante a noite.
  19. Adicionar 50-100 ul de R-spondin1 condicionado mediuma por poço diariamente. Todos os dias 3 a substituição de todo o meio de crescimento com organ�de recentemente preparada organ�de meio de crescimento 450 ul / poço descrito no passo 2.2. Além disso adicionar 50-100 ul de R-spondin1 meio condicionado por poço.
    NOTA: A queda de matriz de proteína mantém a sua integridade durante uma semana, mas após 7 dias para proceder Organóides Passaging.

4. Passaging Organóides Cada Dia

  1. Descongelar a matriz proteica durante a noite em gelo a 4 ° C no dia anterior Passaging. Quente estéril uma placa de 24 poços a 37 ° C durante pelo menos 30 min. Prepare meios de crescimento organ�de descritas na etapa 2.2 e manter a 37 ° C, até utilização.
  2. Retire a placa organ�de da incubadora e começar passaging de placa no gelo. Aspirar o meio de crescimento com uma pipeta de 10 ml de 3-4 poços para iniciar.
    NOTA: manter a mídia aspirado na pipeta de 10 ml, como este será utilizado para desalojar a gota matriz de proteína no passo seguinte.
  3. No quantopirateados poços, pipeta para cima e para baixo, a fim de desalojar a gota matriz proteica do prato. raspagem suave com a ponta de uma pipeta de 10 ml é útil para desalojar a gota matriz proteica. Transferir o conteúdo para um tubo cônico de 15 ml.
  4. Incubar os tubos cónicos de 15 ml em gelo durante 10 minutos e centrifugar a 125 xg durante 5 min a 4 ° C. Observar um sedimento branco no fundo do tubo cónico. Aspirar cuidadosamente e descartar a maior parte do / meio de crescimento organ�de idade sobrenadante acima da pelete organ�de deixando 100-200 ul acima do sedimento.
  5. Quebra-se as criptas organ�de usando uma agulha de calibre 23 ligada a uma seringa de 1 ml. Aspirar e ejectar 10-15 vezes de modo a dissociar as criptas. Minimizar a formação de bolhas de ar devido à pipetagem excessiva.
  6. Ressuspender as Organóides em 500 ul de matriz de proteína e adicionar 50 uL por poço de uma nova placa de 24 poços pré-aquecido. Adicionar 450 uL de meio de crescimento organ�de previamente preparadas + 50 ul de R-spondin1meio condicionado por poço. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite.

5. Organóides chapeamento no dia 14 de Reconhecimento de Padrões Receptor A estimulação com PAMPs e Listeria monocytogenes para Análise de Expressão Gênica

  1. Dois dias antes do desafio, raia fora L. monocytogenes em uma placa de ágar BHI.
  2. No dia seguinte escolher um L. monocytogenes colónia e crescer em 10 ml de caldo de BHI a 37 ° C durante a noite com agitação a 200 rpm.
  3. Descongelar a matriz proteica durante a noite em gelo a 4 ° C no dia antes do desafio organ�de. Quente estéril uma placa de 24 poços a 37 ° C durante pelo menos 30 min. Prepare meios de crescimento organ�de descritas na etapa 2.2 e manter a 37 ° C, até utilização.
  4. Remover cultura organ�de da incubadora e começar passaging de Organóides.
  5. media aspirado de 3-4 poços e manter a mídia aspirado na 10 ml pipete como isso vai ser usado para desalojar a queda matriz proteica. Pipeta cima epara baixo, a fim de desalojar a gota matriz de proteína a partir da placa. raspagem suave com a ponta de uma pipeta de 10 ml é útil para desalojar a gota matriz proteica. Transferir o conteúdo para um tubo cônico de 15 ml.
  6. Incubar os tubos cónicos de 15 ml em gelo durante 10 min. Centrifuga-se a 125 xg durante 10 min a 4 ° C. Observar um sedimento branco no fundo do tubo cónico. Com cuidado, aspirar o sobrenadante deixando cerca de 100 ul de sobrenadante residual atrás.
  7. Ressuspender o sedimento em 5 ml organ�de de gelo frio 1x PBS e remover uma alíquota de 10 uL para a contagem. Adicionar a alíquota de 10 ul para o meio de um hemocitômetro sem a lamela de vidro. Suavemente sobrepor a lamela de vidro na parte superior da gota.
    NOTA: O hemocit�etro vai entupir com Organóides se a lâmina de vidro não é removido em primeiro lugar.
  8. Contar o número total de Organóides através de um microscópio de luz em cada grid / toda a câmara do hemocitômetro e determinar a concentração organ�de: number de Organóides totais contabilizadas por 10 ml.
  9. Retirar um volume apropriado a partir do tubo cónico de 15 ml, que irá permitir que um número adequado de Organóides a ser semeado para o ensaio de centrifugação e esta suspensão a 125 xg durante 10 min.
    NOTA: O intervalo entre 40-100 Organóides por poço de uma placa de 24 poços é suficiente para a análise do ARN. O tamanho típico organ�de pode variar desde 300 um a 1000 um de diâmetro.
  10. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ml de matriz de proteína sem gerar bolhas de ar. Adicionar 50 ml de suspensão de matriz / proteína organ�de por poço numa placa de 24 poços.
    NOTA: A quantidade de matriz de proteína usada para voltar a suspender Organóides irá variar para o número de condições de tratamento e repetições técnicas.
  11. Adicionar 500 ul de meio de crescimento organ�de (sem N-acetil-cisteína) a cada poço e incubar a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 1 h.
  12. Prepare concentrações 2x de MMAPs (isto é, flagelina,lipopolissacarídeo) e viver L. monocytogenes. Medir a OD de L. ao vivo monocytogenes e bife em uma placa BHI para contagem. Trate Organóides a 1 x 10 6 unidades formadoras de colónias (UFC) / ml.
    NOTA: O OD à determinação CFU irá variar por bactérias tipo e devem ser avaliados antes do organ�de estimulação. Por exemplo, uma DO de 0,6 ≈ 1 x 10 9 CFU / ml para L. monocytogenes, mas também deve ser avaliado de forma independente antes da experiência.
  13. Streak uma diluição em série a partir do estoque tratamento de L. monocytogenes para determinar com precisão o tratamento CFU / ml. Os autores constatam que a uma diluição de 1 x 10 8 de 100 ul numa placa de agar BHI é suficiente para contagem das colónias para determinar uma precisas CFU / ml.
  14. Preparar uma solução de calor matou de L. monocytogenes, tomando uma alíquota de 1 ml da L. ao vivo monocytogenes solução e centrifugar a 5000 xg durante 10 min. Aspirar o sobrenadante e lavaro sedimento de bactérias com 1 ml de PBS 1x.
    1. Centrifugar a L. monocytogenes a 5000 xg durante 10 min e ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS 1x. Aqueça matar o L. monocytogenes em um tubo de 1,7 ml de polipropileno por meio de aquecimento a 80-90 ° C durante 1 h. A cultura de uma alíquota de 100 ul do calor matou L. monocytogenes em uma placa de ágar BHI para confirmar há bactérias vivas permanecem.
    2. Adicionar 500 ul da PAMP 2x apropriado e / ou tratamento de micróbio para 500 ul de meios residente em poços designados determinados pelo utilizador. Incubar a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 24 horas.
      NOTA: Adição de uma alíquota de 500 ul de um tratamento / micróbio 2x PAMP para 500 ul de meios residentes vai trazer a concentração de tratamento de 1x em um volume total de 1 ml.
  15. No dia seguinte, a contagem manualmente L. monocytogenes colônias para uma determinação precisa do tratamento UFC / ml. media aspirado da placa de Organóides tratados e lavar poços tvezes rês com 1x PBS.
  16. Prossiga para a extração de RNA através de fenol / clorofórmio 11 ou um kit de extração de RNA de acordo com instruções do fabricante. Avaliar a expressão gênica usando o padrão qRT-PCR 12.

6. Organóides chapeamento no dia 14 para PAMP e L. monocytogenes desafio para a análise de proteínas no sobrenadante

  1. Dois dias antes do desafio, iniciar uma cultura de células de células Caco-2, densidade de sementeira ≈1 x 10 6 células num frasco T-75 com 1x DMEM + 20% de FBS e incubar as células Caco-2 a 37 ° C + 5 % de CO 2. Comece uma cultura bacteriana de L. monocytogenes na placa BHI e Incubar a placa num incubador bacteriano a 37 ° C.
  2. No dia seguinte escolher um L. monocytogenes colónia e crescer em 10 ml de caldo de BHI a 37 ° C durante a noite. Descongelar a matriz proteica durante a noite em gelo a 4 ° C no dia antes do desafio organ�de.
  3. No dia seguinte morna um estéreis de 96 poços preto-walledplaca a 37 ° C durante pelo menos 30 min. Prepare meio de crescimento sem organ�de N-acetil-cisteína descrito na etapa 2.2 e manter a 37 ° C, até utilização. Remover cultura organ�de da incubadora e começar passaging de Organóides.
    NOTA: O tamanho típico organ�de pode variar desde 300 um a 1000 um de diâmetro.
  4. media aspirado de 3-4 poços e manter a mídia aspirado na 10 ml pipete como isso vai ser usado para desalojar a queda matriz proteica. Ressuspender com uma pipeta, de modo a desalojar a gota matriz de proteína a partir de chapa. raspagem suave com uma pipeta de 10 ml é útil para desalojar a queda matriz proteica. Transferir o conteúdo para um tubo cônico de 15 ml.
  5. Incubar os tubos cónicos de 15 ml em gelo durante 10 min. Centrifuga-se a 125 xg durante 10 min a 4 ° C. Observar um sedimento branco no fundo do tubo cónico. Com cuidado, aspirar o sobrenadante deixando 100 l de sobrenadante residual atrás.
  6. Ressuspender o sedimento organ�de em 5 ml de gelo frio1x PBS e remover uma alíquota de 10 uL para a contagem. Adicionar a alíquota de 10 ul para o meio de um hemocitômetro e gentilmente sobrepor a lamela de vidro.
    NOTA: O hemocit�etro vai entupir com Organóides se a lâmina de vidro não é removido em primeiro lugar.
  7. Contar o número total de Organóides através de um microscópio de luz em cada grade do hemocitómetro / o inteiro câmara e determinar a concentração organ�de: número total de Organóides contados por 10 ml.
  8. Retirar um volume apropriado a partir do tubo cónico de 15 ml, que irá permitir que um número adequado de Organóides a ser semeado para o ensaio de centrifugação e esta suspensão a 125 xg durante 10 min.
    NOTA: A quantidade de matriz de proteína usada para voltar a suspender Organóides variará para a quantidade de condições de tratamento e repetições técnicas. Os autores acham que 40-100 Organóides é suficiente para a análise proteína secretada.
  9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de matriz de proteína / poço sem gerarbolhas de ar.
    NOTA: A quantidade de matriz de proteína usada para voltar a suspender Organóides variará para a quantidade de condições de tratamento e repetições técnicas.
  10. Deixar pelo menos duas colunas vazias 96 sobre a placa de cultura de tecidos bem como preto de parede estes irão servir como poços semeados com células Caco-2 para a geração de uma curva padrão. Adicionar 50 ul de suspensão de matriz de proteína + organ�de por poço para uma placa de cultura de tecidos bem preto de parede pré-aquecido 96. Armazenar a placa a 37 ° C durante 10 min para permitir a matriz de proteína para solidificar.
  11. Adicionar 100 ul de meio de crescimento organ�de (sem N-acetil-cisteína) a cada poço e incubar a 37 ° C + 5% de CO 2 durante 1 h.
  12. Prepare concentrações 2x de PAMPs e viver L. monocytogenes. Adiciona-se 100 ml de cada condição de tratamento dada por poço e incubar durante 24 horas.
  13. A placa seguinte dia Caco-2 As células nos poços curva padrão. Começar por aquecimento estéril 1x PBS, 0,25% de tripsina e 1x DMEM + FBS a 20% tO 37 ° C.
  14. Retire os T-75 frasco contendo células Caco-2 e aspirar o meio de cultura celular. Lavam-se as células com 10 ml de PBS 1X. Aspirar o 1x PBS, adicionar 2 ml de 0,25% de tripsina e local T-75 balão em 37 ° C incubadora por 15 min.
  15. Visualizar o balão sob um microscópio de luz para garantir que as células têm destacado em seguida, adicionar 8 mL de 1x de DMEM + FBS a 20% para as células Caco-2 isoladas e transferir para um tubo de 15 ml. Remove-se uma alíquota de 10 ul e contar as células por microscopia de luz usando um hemocitómetro.
    NOTA: Um número superior de células de 60.000 células / poço diluições funciona bem e pode ser conduzido para a geração da curva padrão para baixo a 2.500 células / poço.
  16. Ressuspender as células Caco-2 em matriz de proteína e adicionar 50 uL por poço aos poços apropriados. Permitir que a matriz de proteína para solidificar a 37 ° C para as células Caco-2.
    NOTA: O meio de crescimento para as células Caco-2 não precisam ser adicionados seguinte solidificação da matriz proteica.
  17. Segueo tempo de tratamento de 24 horas para o ensaio organ�de, aspirado e salvar os media sobrenadante celulares organ�de e manter em gelo. Lavar os poços três vezes com PBS 1x. Adicionar 100 uL de metanol a 100% a cada cavidade incluindo as células Caco-2 poços curva padrão e incubar a 4 ° C ou sobre gelo durante 20-30 minutos para fixar as Organóides.
    NOTA: não é necessário que as células Caco-2 poços da curva padrão ser lavadas com 1x PBS, uma vez que podem ter metanol adicionado directamente.
  18. Após a incubação metanol, lavar os poços três vezes com PBS 1x frio de gelo. Armazenar a placa a 4 ° C durante até 1-2 semanas.
  19. Adicionar corante coloração nuclear a uma concentração de 1 ug / ml por poço, cobrir a placa com folha de alumínio e incuba-se a 4 ° C durante a noite.
  20. Usar um leitor de placas de 96 poços para medir corante coloração nuclear de excitação / emissão (350nm / 461nm, respectivamente) e normalizar cada organ�de bem com a curva padrão de células Caco-2.
  21. Proceder a ensaios a jusante, tais como ELISA

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Representative Results

Ao seguir este protocolo para cultivar Organóides intestinais, em forma de esfera Organóides características estarão presentes após a colheita. A adição dos meios de comunicação R-spondin1 condicionado diária irá iniciar o crescimento e brotação das Organóides. O crescimento de Organóides é mostrado na Figura 1A - F, e é representante de Organóides intestinais nos dias 1, 2, 4, 5, 6 e dia 14. A Figura 1F representa as características de crescimento não-homogéneas de Organóides no dia 14.

Uma vez que os Organóides são cultivadas até um número apropriado, eles podem ser novamente plaqueadas e desafiadas com vários MMAPs e / ou micróbios. Análise da expressão pode ser realizada por meio de técnicas padrão. Isto é representado na Figura 2A-C, o que mostra a expressão de mRNA de citocinas inflamatórias de IL-18, IL-6, TNFa e que foram analisados ​​após um24 desafio hr de Organóides com o calor matou L. monocytogenes e a flagelina PAMP. A base racional para a avaliação da expressão de mRNA de citocinas IL-18, IL-6 e TNFa foi que estes eram bons candidatos para serem modulados por células epiteliais em resposta ao desafio patogénico, e modulação destas citocinas inflamatórias que demonstram a eficácia da técnica.

Figura 3A - C demonstra a coloração nuclear relativa de Organóides intestinais com corante de coloração nuclear seguinte fixação com fundo mínima coloração de detritos na matriz proteica residente. Este método de fixação e coloração pode ser aplicado para normalizar os ensaios, os quais serão responsáveis ​​por diferentes números de células em cada poço. Isto é evidente na Figura 4, quando a geração de uma curva padrão de diluições em série de 2-Caco células plaqueadas na matriz de proteína, em seguida, fixadas e coradas com nuclearcorante de coloração. O valor de R 2 de 0,89 indica uma relação linear entre o número de células e intensidade média de fluorescência, e a equação linear pode ser usada para normalizar Organóides ao número de células. A curva padrão ilustrado na Figura 4 começa a chegar ao limite de saturação para além de 30.000 células por poço. Uma titulação de células acima de 30.000 células por poço foi mostrado na Figura 4 a incluir a gama de saturação de corante coloração nuclear. O aumento da precisão da normalização vai ser obtida com um número de células que reflecte o intervalo linear do corante coloração nuclear antes do limite de saturação é atingida.

figura 1
Figura 1: curso de Intestino Delgado organ�de Crescimento Tempo de crescimento para Organóides derivados intestino delgado murino seguintes isolamento.. (A) Dia 1. (B) Dia 2. (C) Dia 4. (D) Dia 5. (E) Dia 6.) Dia (F 14. As imagens são representativas do crescimento organ�de para cada dia dado. As barras de escala igual a 200 mm na imagem da esquerda para A, barras B, C, D, e E. escala igual a 100 mm na imagem da direita para barras de A, B, C, D, e E. escala igual 1,000 uM e 200 uM para imagens esquerda e direita para F, respectivamente. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Expressão de ARNm de citocinas inflamatórias Após 24 h PAMP Desafio expressão de ARNm relativa do tipo selvagem Organóides intestinais desafiados durante 24 h com MMAPs e mortas por calor Listeria monocytogenes (A - C) representam a mudança de dobragem do i.. nflammatory citocinas IL-18, IL-6 e TNFa, respectivamente. As barras de erro representam o desvio padrão (SD) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: coloração fluorescente relativa de Organóides para a normalização coloração nuclear de Organóides com seguinte fixação.. (A) Campo brilhante de Organóides. (B) coloração fluorescente de corante Organóides com coloração nuclear. (C) imagem mesclada de campo brilhante e coloração fluorescente. Barras de escala igual a 400 mm em todas as imagens. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"> Figura 4
Figura 4: curva padrão gerada a partir de células Caco-2 As células curva padrão gerada a partir de poços em triplicado.. Semeadura de células tinha uma gama a partir de 60.000 células por poço com diluições para baixo para 2.500 células por poço. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5:. Visão geral do Diagrama Protocolo 1-Top Painel da figura ilustra a colheita da media R-spondin1 condicionado. Painel 2-meio da figura ilustra aspectos do protocolo de colheita e rato cultura pequenas Organóides intestinais. Painel 3-parte inferior da figura ilustra: (A) O chapeamento de 14 dias Organóides cultivadas. (B) Desafio com PAMPs / L.monocytogenes, e deixando poços não ocupados para gerar uma curva padrão. (C) Seguindo o desafio PAMP, o plaqueamento de células Caco-2 nas cavidades previamente desocupado para gerar uma curva padrão. (D) Após a fixação e adição de um corante coloração nuclear, medindo a excitação / emissão dos poços e normalizando contra uma curva padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A cultura e manutenção de Organóides intestinais é um procedimento que pode ser dominada por qualquer indivíduo com a técnica de cultura de tecidos adequados. Existem subtilezas em Passaging quando comparadas com células em crescimento em monocamada de um mais convencional, mas estes subtilezas não são difíceis de ultrapassar. Os passos críticos deste método envolvem ser capaz de crescer as Organóides a uma densidade suficientemente elevada para propagação óptima. As experiências devem ser escalados para baixo com Organóides como grandes densidades de semeadura que podem normalmente ser obtidos com linhagens de células não são práticos. Isto torna-se especialmente evidente quando existem vários grupos de tratamento.

Este protocolo destina-se a proporcionar um método passo-a-passo para estudar interacções hospedeiro-patogénio do epitélio intestinal com uma variedade de bactérias diferentes, virais, fúngicas e agentes patogénicos, bem como dificuldades de endereço que utilizam este sistema no que diz respeito à normalização. Os relatórios estão disponíveis que describe as interações de Organóides intestinais com a bacteriana patógeno Salmonella, ainda não abordam métodos de normalização ao medir citocinas secretadas 13.

Existem várias dificuldades que são encontradas quando se normalizar culturas organ�de por diferentes métodos. Normalizando proteína secretada através de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) é uma opção; No entanto, os componentes de crescimento necessário para a cultura organ�de (N2 e / ou vitamina B27) interferir com o ensaio BCA (dados não mostrados) através Normalizando viabilidade celular, tal como um ensaio de MTT modificado foi descrito. 14; No entanto, um tratamento que irá alterar a actividade metabólica mitocondrial das Organóides introduzirá um método impreciso para normalização através desta técnica como MTT baseia-se na redução pela acção de desidrogenases mitocondriais 15. Também é necessário eliminar a N-acetil-cisteína (NAC) a partir do suporte, e não sobreLY se normalização através da técnica MTT é desejado, mas se o tratamento com um agente patogénico bacteriano como NAC pode inibir o crescimento bacteriano 16.

As vantagens desta técnica são que citocinas secretadas e produtos proteicos de Organóides pode agora ser normalizado contra uma curva padrão de células Caco-2. Limitações desta técnica são que a normalização é correlativo porque coloração nuclear de Organóides epiteliais primárias não transformadas são normalizados contra a coloração nuclear de uma linha de células de cancro do cólon. Os autores descobriram que a fixação com metanol e coloração núcleos com nuclear a coloração do corante é uma técnica de normalização eficaz contra uma curva padrão de células Caco-2. Embora as características de crescimento desta linha celular de cancro do cólon não exactamente imitar as características de crescimento de Organóides intestinais, utilizando um corante nuclear e medindo a intensidade de fluorescência média é uma boa estratégia para normalizar contra o número total de células.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11050 (Section 1, 3, 6) Or equivalent brand
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo (Section 1, 3)
DMEM GE Healthcare Sh30243.01 (Section 1, 6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells
HEK293T-Rspondin1 secreting cell line (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. 
50 ml conical tube Falcon 352070 (Section 1) Or equivalent brand
T-175 Flask Corning 431079 (Section 1) Or equivalent brand 
Protein Matrix Corning 356231 (Section 2, 3, 4, 5, 6) Matrigel Growth Factor Reduced 
HyClone Dulbecco's (DPBS) GE Healthcare SH30264.01 (Section 2, 3)
DMEM/F12  Life Technologies 12634-010 (Section 2, 3) Advanced DMEM/F12
Corning 24 Well TC Plates Corning 3524 (Section 2)
N2 Supplement 100x  Life Technologies 17502-048 (Section 2)
B27 without vitamin A 50x  Life Technologies 12587-010  (Section 2)
Trizol Life Technologies 15596-026 (Section 2)
Glutamine Supplement (Glutamax) Life Technologies 35050-061 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12
HEPES (1 M) Life Technologies 15630-080 (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 
10 ml Serological Pipet Falcon 357551 (Section 2) Or equivalent brand
Murine Noggin Peprotech 250-38 (Section 2) Stock = 100 mg/ml
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165 (Section 2) Stock = 1M
Recombinant Mouse EGF Biolegend 585608 (Section 2) Stock = 500 mg/ml
Rocker Variable Bioexpres (Section 3)
dissecting scissors (Section 3)
forceps (Section 3)
glass slides (Section 3)
dissecting tweezers (Section 3)
25 ml Serological Pipet Falcon (Section 3)
EDTA  Sigma-Aldrich SLBB9821 (Section 3) 0.5 M or alternative TC grade EDTA
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 (Section 3) Or equal sized TC dish
1 ml Syringe Becton Dickinson 309659 (Section 4)
Precision Glide Needle Becton Dickinson 305120 (Section 4) 23 G x 1 1/4 (0.6 mm x 30 mm)
Flagellin from Bacillus subtilis Invivogen tlrl-bsfla  (Section 5, 6)
Listeria monocytogenes ATCC 19115 (Section 5, 6) (Murray et al.) 
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA (Section 5, 6) Or equivalent brand
BBL Brain Heart Infusion Agar Becton Dickinson 211065 (Section 5)
Bacto Brain Heart Infusion Becton Dickinson 237500 (Section 5)
Caco-2 ATCC HTB-37 (Section 6)
Trypsin  gibco 25200056 (Section 6)
Methanol Fisher A412-4 (Section 6)
SpectraMax M5 Molecuar Devices (Section 6)
96 Well Assay Plate Corning 3603 (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated
Nuclear Staining Dye Life Technologies H1399 (Section 6) Hoechst 33342
T-75 Flask Corning 430641 (Section 6) Or equivalent brand
15 ml conical tube Falcon 352096 (Section1, 3) Or equivalent brand
1.7 ml polypropylene tube Bioexpress C-3262-1 Or equivalent brand
Quick-RNA MiniPrep Zymo Research R1054 Or equivalent brand
TNF-alpha  Applied Biosystems Mm 00443260_g1 Taqman gene expression assay kit
IL-6  Applied Biosystems (Mm 00446190_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-1beta Applied Biosystems Mm 00434228_m1 Taqman gene expression assay kit
IL-18 Applied Biosystems Mm 00434225_m1 Taqman gene expression assay kit
18s Applied Biosystems Hs 99999901_s1 Taqman gene expression assay kit
7500 Fast Real Time PCR System Applied Biosystems
Nexus gradient Mastercycler Eppendorf
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix Life Technologies 4352042
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies/Applied Biosystems 4368814
Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 ml Life Technologies/Applied Biosystems 4346907
Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein R&D Systems 3474-RS-050 500 ng/ml
chloroform Sigma-Aldrich C7559

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References

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