Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos

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Summary

En este protocolo, se presentan los procedimientos para establecer modelos de distrofia miotónica de mioblastos 1, incluyendo el mantenimiento optimizado C2C12 celular, transfección de genes / transducción, y la diferenciación de los miocitos.

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Liang, R., Dong, W., Shen, X., Peng, X., Aceves, A. G., Liu, Y. Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells. J. Vis. Exp. (113), e54078, doi:10.3791/54078 (2016).

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Abstract

La distrofia miotónica 1 (DM1) es una forma común de distrofia muscular. Aunque se han establecido varios modelos animales para DM1, modelos celulares de mioblastos son todavía importantes debido a que ofrecen una alternativa eficiente celular para el estudio de eventos celulares y moleculares. Aunque las células de mioblastos C2C12 se han utilizado ampliamente para estudiar la miogénesis, resistencia a la transfección de genes, o transducción viral, obstaculiza la investigación en las células C2C12. A continuación, describimos un protocolo optimizado que incluye procedimientos de mantenimiento diario, transfección y transducción para introducir genes en mioblastos C2C12 y la inducción de la diferenciación de los miocitos. Colectivamente, estos procedimientos permiten mejores eficacias de transfección / transducción, así como los resultados de diferenciación consistentes. El protocolo descrito en el establecimiento de modelos celulares de mioblastos DM1 beneficiaría al estudio de la distrofia miotónica, así como otras enfermedades musculares.

Introduction

La distrofia miotónica (DM) es una enfermedad autosómica dominante que afecta a múltiples sistemas, más notablemente los músculos cardíaco y esquelético 1. Hay dos subtipos de esta enfermedad, DM1 y DM2. DM1 es más común y tiene una manifestación más grave que DM2 2. La mutación genética subyacente DM1 es una expansión de repeticiones de tripletes CUG ubicadas en la región no traducida 3 '(UTR) del gen de la proteína quinasa DM (DMPK) 3. El número de repetición CUG en individuos no afectados varía de 5 a 37. Por el contrario, aumenta a más de 50, y a veces hasta miles de personas en los pacientes con DM1 4. Como resultado, las proteínas de unión a ARN, como muscleblind tipo 1 (MBNL1), CUGBP, y Elav-1 como de la familia (Celf1), son misregulated. Debido a la secuestro en las repeticiones CUG expandido, MBNL1 pierde su capacidad para regular splicing alternativo 5. Celf1, por el contrario, está regulado hasta 6,7. La sobreexpresión de Celf1 se asocia con la pérdida de músculoy debilidad, que no se atribuye a la pérdida de la función MBNL1. Los modelos animales que simulan alteraciones relacionadas-DM1, incluyendo DMPK 3'-UTR de expansión CUG, pérdida de MBNL1, y la sobreexpresión de Celf1, se han establecido. Sin embargo, el modelado de la DM1 en mioblastos ofrece una alternativa eficiente, especialmente para la disección de eventos celulares y moleculares relacionados con DM1.

C2C12 línea celular de mioblastos fue aislado por primera vez a partir de músculo de ratón C3H heridos y ampliamente utilizado para estudiar la diferenciación miogénica 8,9. células C2C12 proliferan rápidamente en el suero bovino fetal (FBS) que contienen los medios de comunicación y fácilmente experimentan diferenciación cuando se agote el FBS. Sin embargo, el uso de este modelo de diferenciación de mioblastos presenta dos retos: las células C2C12 son a menudo resistente a la transfección de genes / transducción viral; y ligeras variaciones en el manejo celular y la diferenciación procedimiento pueden conducir a cambios marcados en la formación de miotubos.

Nuestro laboratorio utiliza rutinariamente mioblastos C2C12 como acell modelo y ha desarrollado protocolos que transmitan efectivamente los genes de plásmido transfección, transducción retroviral, y la transducción lentiviral en la línea celular C2C12 10. En el video, que demuestran los procedimientos optimizados para la transfección / transducción de células C2C12 y el mantenimiento de la coherencia de diferenciación en el establecimiento de modelos de mioblastos DM1.

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Protocol

1. Cultivo de células C2C12

  1. Mantener C2C12 mioblastos de ratón en una placa de 100 mm en medio de crecimiento (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)) suplementado con suero bovino fetal 20%, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina. Permitir que las células a pases C2C12 se conviertan en aproximadamente 50 - 60% de confluencia.
  2. Descartar el medio de cultivo y lavar las células C2C12 con solución salina tamponada con fosfato 3 ml temperatura ambiente (PBS). Retire el PBS y añadir 500 l 0,25% de tripsina-EDTA para desprender las células. Colocar la placa en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 - 5 min.
  3. Neutralizar la tripsina mediante la adición de 3 ml de medio de crecimiento. Pipetear 6 - 8 veces para suspender las células. Añadir 1 ml de células en suspensión a una nueva placa 100 mm y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2.

2. C2C12 Cell transfección / transducción y selección

  1. C2C12 plásmido transfección
    1. 24 h antes de la transfección, pfinales de 7,0 x 10 5 C2C12 células en un pocillo de una placa de seis pocillos para cada transfección.
      Nota: Esto lleva a 50 - 60% de confluencia en el momento de la transfección.
    2. Permitir que el reactivo de transfección a la temperatura ambiente antes de su uso.
    3. Añadir 2 g de ADN plásmido (GFP-CUG5 o GFP-CUG200) en 200 l pre-calentado medio libre de suero y de vórtice brevemente. Añadir el reactivo de transfección 6 l al medio y mezclar inmediatamente durante 30 segundos usando un vórtice. Incubar la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente.
    4. Cambiar el medio de células C2C12 a 2,5 ml de medio de crecimiento libre de suero. Añadir la mezcla de transfección a las células después de la incubación. Volver las placas a un 5% de CO 2, 37 ° C incubadora.
    5. Mantener las células en la mezcla de transfección el medio de crecimiento / libre de suero durante 4 horas o hasta durante la noche. Cambio de medio de nuevo a los medios de cultivo al día siguiente o cuando la citotoxicidad es evidente.
      Nota: La citotoxicidad se evaluó mediante la inspección microscópica de la ceLLS. Observar los cambios en la morfología celular y la retirada de las células. Mientras no hay citotoxicidad manifiesta, incubación durante la noche en medio de crecimiento libre de suero aumenta la transfección.
    6. Seleccionar las células 48 horas después de la transfección mediante la adición de 01.02 a 01.06 mg / ml de G418 durante unos 10 días hasta que el cultivo de control (sin transfectadas los plásmidos) no tiene células vivas. Cambiar el soporte de cada dos días con medio de cultivo suplementado con G418.
    7. Mantener las células resistentes a G418 en medio de crecimiento y 5% de CO2 a 37 ° C para los experimentos posteriores.
  2. preparación de retrovirus y C2C12 transducción retroviral
    1. Preparar HEK 293 medio de cultivo por DMEM que complementa alta glucosa con 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina.
      1. Aproximadamente 24 horas antes de la transfección, la placa de 4,0 x 10 células HEK 293 de embalaje a base de 6 ecotropic en una placa de 100 mm (confluencia del 80% en la transfección) cmedio de cultivo celular ontaining.
    2. Permitir que el reactivo de transfección a la temperatura ambiente antes de su uso.
    3. Mezclar 15 g de ADN plásmido (pMSCV-Puro o pMSCV-Celf1Flag-Puro) en 1 ml de medio de crecimiento libre de suero. brevemente Vortex. Añadir 30 l reactivo de transfección de la etapa 2.2.2 en el tubo de medio de crecimiento de ADN / libre de suero, y se mezcla bien con vórtice. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Añadir transfección mezcla gota a gota a las células de empaquetamiento ecotrópico HEK 293 basados ​​en. Hacer girar suavemente las placas y devolverlos de nuevo al 5% de CO2, a 37ºC. Después de 24 horas, cambiar el soporte de medio de cultivo fresco 10 ml previamente calentada.
    5. Se recoge el sobrenadante (que contiene retrovirus) 48 h después de la transfección usando una pipeta y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 50 ml. Añadir 10 ml de nuevos medios cálidos a la placa y devolverlo a la incubadora. Mantenga el sobrenadante a 4 ° C.
      Nota: Los medios de comunicación se añade suavemente a tél lado del pozo a fin de no perturbar la monocapa de células.
    6. Se recoge el segundo lote de sobrenadante 60 horas después de la transfección y mezclarla con el sobrenadante de 2.2.5. Centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 min para eliminar restos celulares.
    7. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Utilice retrovirus para transducir células C2C12 en este punto por continuar con el paso 2.2.9 o alícuota y almacenar el sobrenadante a -20 ° C para uso futuro.
    8. Descongelar el retrovirus de 2.2.7 a temperatura ambiente, si se usa una solución madre congelada aquí.
      Nota: Evite múltiples ciclos de congelación-descongelación.
    9. Placa células C2C12 en el mismo día de la transducción con el objetivo de 30 - 40% de confluencia.
      1. Descartar el medio de cultivo y lavar las células C2C12 con 3 ml de PBS temperatura ambiente. Retire la PBS, añadir 500 l 0,25% de tripsina-EDTA, e incubar la placa en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 - 5 min.
      2. Neutralizar la tripsina mediante la adición de 3 ml med crecimientoio. Pipetear 6 - 8 veces para suspender las células. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y añadir 8,0 x 10 5 células C2C12 a una placa de 60 mm.
    10. Añadir 0,5 ml de retrovirus para infectar una placa de 60 mm de células en 3 ml de medio de crecimiento. Devolver la placa a la incubadora.
    11. Reemplazar con 3 ml de medio fresco suplementado con antibiótico de selección (puromicina 1-3 g / ml) 48 h después de la infección. Reemplazar 3 ml de medio con antibióticos para todos los días a 5 días hasta que el cultivo de control C2C12 transducido se extingue.
  3. preparación lentivirus y C2C12 transducción lentiviral
    Nota: Realizar todos los procedimientos relacionados con lentivirus de Bioseguridad Nivel 2 del gabinete y seguir las directrices de seguridad biológica. Los residuos líquidos que contiene el virus debe ser desinfectada antes de su eliminación.
    1. Placa 4.0 x 10 6 células 293T en una placa de 100 mm (~ 80% de confluencia en el día de la transfección) con HEK 293 medio de cultivo celular (DMEM alto contenido en glucosa, suplementado con 10% fetalde suero bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina) 24 h antes de la transfección.
    2. Calentar el reactivo de transfección a temperatura ambiente. Mezclar los vectores de empaquetamiento lentiviral (4 g pMD2.G y 6 g psPAX2) junto con vector de transferencia lentiviral 8 g (Celf1 shRNA o revueltos de control shRNA) en 1 ml de medio de cultivo celular libre de suero. brevemente Vortex.
    3. Añadir 36 l de reactivo de transfección pre-calentado en el tubo de ADN / DMEM y se mezcla bien por vórtice. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Retire las células 293T de la incubadora y añadir la mezcla de transfección a la placa. Hacer girar suavemente la placa y volver de nuevo a 5% de CO2, a 37ºC. Después de 24 hr, reemplace la mezcla de transfección con 10 ml de medio de cultivo fresco.
    5. Recoger el sobrenadante que contiene lentivirus 48 hr después de la transfección y la transfiere en un tubo de centrífuga de 50 ml. Añadir 10 ml nuevos medios cálidos a la placa y volverlaa la incubadora. Almacenar el sobrenadante a 4 ° C.
    6. Recoger el sobrenadante segundo lote de 60 horas después de la transfección y combinarlo con el sobrenadante de 2.3.5. brevemente centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 minutos.
    7. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Si se utiliza el virus fresca, continúe en el paso 2.3.9. Para uso futuro, tienda de virus que contienen sobrenadante a -20 ° C en alícuotas de 10 ml.
    8. Descongelar el virus de 2.3.7 a temperatura ambiente antes de su uso, si se usa una solución madre congelada.
      Nota: Evite múltiples ciclos de congelación-descongelación.
    9. células de la placa C2C12-CUG200 (obtenido en la Sección 2.1) como se describe en 2.2.9 en el mismo día de la transducción.
      Nota: Trate de 30 - 40% de confluencia.
    10. Añadir 0,5 ml de virus para infectar una placa de 60 mm de C2C12-CUG200 y devolver la placa a la incubadora.
    11. Sustituir el medio de cultivo con medio fresco suplementado con el antibiótico de selección (puromicina 1-3 g / ml) 72 horas después de la transducción.Refrescar los medios de cultivo todos los días con el antibiótico de selección para ~ 5 días hasta que todo el cultivo de control C2C12-CUG200 transducido se extingue.
    12. Utilice Western blot para verificar caída Celf1 en las células transfectadas GFP-CUG200.

3. Diferenciación celular C2C12

  1. Plate 2 x 10 6 células en un pocillo de una placa de 6 pocillos en 2,5 ml de medio de crecimiento 24 horas antes de la iniciación de la diferenciación.
    Nota: La densidad de placas se puede ajustar de modo que la confluencia completa se alcanza en 24 hr.
    1. Enjuagar las células confluentes con PBS y añadir 2,5 ml de medio de diferenciación bajo en suero (medio modificado de Eagle suplementado con suero equino al 2%, 100 U / ml de penicilina de Dulbecco, 100 mg / ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, y 1 mM de insulina) . Reemplazar el medio cada dos días.
      Nota: guardar la acción de la insulina congelada y añadirlo a los medios de comunicación en cada cambio de medio.
  2. Durante la diferenciación de C2C12, recoger muestras para quancuanti- RT-PCR (ver sección 4) en los siguientes puntos de tiempo: Day0, 1, 2, 4 y 6. Proceso de la cultura para la inmunotinción en el día 6 - 8 (véase la sección 5).

4. Aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa

  1. Utilice el protocolo del fabricante para el aislamiento de ARN. Después del aislamiento, resuspender el pellet de ARN en 30 l de agua libre de RNasa y pipetear arriba y abajo varias veces.
    Nota: Las muestras pueden proceder a RT-PCR cuantitativa o pueden ser almacenadas a -80 ° C.
  2. Utilice un kit de RT PCR cuantitativa para la RT-PCR cuantitativa 10 y siga las instrucciones del fabricante. Preparar la mezcla de reacción de acuerdo con la Tabla 1.
Componente Volumen (l) concentración final
tampón de reacción 2x 10 1x
cebador directo 0,5 200 nM
cebador inverso 0,5 200 nM
Sonda 0,5 200 nM
La transcriptasa reversa y RNasa Inhibidor 0,1 0,25 U / ml
Modelo 1 100 ng de ARN total
RNasa libre de agua 7.4 N / A
mezcla total 20

Tabla 1. Quantitative RT-PCR Master Mix Preparación

  1. Ejecutar un 20 l de reacción RT-qPCR utilizando perfil térmico Tabla 2.
paso de transcripción inversa 30 min, 48 ° C
polímero de ADNactivación ase / inactivación de la transcriptasa inversa 10 min, 95 ° C
40 ciclos 15 seg, 95 ° C
1 min, 60 ° C

Tabla perfil térmico 2. RT-PCR cuantitativa

5. La inmunotinción

  1. Fijar el cultivo en monocapa en 2,5 ml recién preparada de paraformaldehído al 4% / PBS a temperatura ambiente durante 10 min.
  2. Permeabilizar las muestras en 2,5 ml 0,1% de Triton X-100 / PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
  3. Transferir las muestras a una cámara humidificada. Bloquear las muestras en 2,5 ml de tampón (tensioactivo no iónico 0,1% / PBS, 10% de suero normal de cabra) de bloqueo durante 30 min a 37 ° C.
  4. Desechar el tampón de bloqueo y aplicar 800 l de anticuerpo primario contra la miosina de cadena pesada diluido en tampón de bloqueo (1: 100). Incubar durante la noche en una cámara humidificada a temperatura ambiente.
  5. Lavar la placa 3 timES (10 min cada una) con 2,5 ml de tampón de lavado (0,1% de polisorbato 20 / PBS) el día 2.
  6. Eliminar el tampón de lavado y aplicar anticuerpo secundario 800 l (de cabra anti-IgG de ratón, 1: 500 diluido en PBS). Incubar en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 1 hr.
  7. Lavado dos veces (10 min cada una) con tampón de lavado de 2,5 ml.
  8. Incubar con 800 l DAPI (1 g / ml, diluido en agua destilada desionizada H 2 O) durante 5 min.
  9. Se lava con 2,5 ml de tampón de lavado de nuevo durante 10 minutos.
  10. Cambiar el tampón de lavado a 2,5 ml de PBS y el uso de un microscopio de fluorescencia para capturar imágenes.

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Representative Results

C2C12 células fueron transfectadas con GFP-CUG5 o GFP-CUG200. Después de la selección de resistencia a fármacos, se establecieron piscinas estables, que puede ser visualizado por la expresión de GFP (Figura 1A). Formación de miotubos en los mioblastos diferenciadas fue detectado por la cadena pesada de la miosina inmunotinción 10 (Figura 1B). La cuantificación de la formación de miotubos demostró que los índices de fusión se redujeron de 35,4 ± 4,1% a 2,6 ± 1,1% y las zonas de miotubos se redujeron del 35,6 ± 2,2% a 2,7 ± 0,8% en la expansión anormal en CUG-GFP CUG200 (Figura 1C). El índice de fusión y el área myotube se contaron a través del número total de núcleos en miotubos (≥ 2 núcleos) dividido por el número total de núcleos y el porcentaje del área total de la imagen cubierta por miotubos, respectivamente. Real-time RT-PCR 10 se llevó a cabo para analizar la expresión de un número de músculo diferenteiation genes relacionados, incluyendo MyoD, MYOG, MEF2C y Celf1. En comparación con CUG5 culturas, CUG200 aumentó la expresión de mRNA Celf1 en la proliferación de los mioblastos en el comienzo de la diferenciación. Congruentes con los informes anteriores, Celf1 regulación positiva se asoció con CUG-expansión de la distrofia miogénica 1 (Figura 1D). Además, Western Blot 10 mostraron consistentemente el nivel de proteína Celf1 fue elevado (Figura 1E), y CUG200 inhibe la expresión de MyoD, MYOG y MEF2C durante la diferenciación (Figura 1D). Estos resultados sugieren que el CUG-expansión conduce a myotube defectos y alteración de la diferenciación de mioblastos.

Para estudiar el papel de Celf1 en la diferenciación de mioblastos, pMSCV- Celf1Flag vector retroviral se construyó para transducir células C2C12. Clones 10 resistentes a la puromicina se combinaron para estudios de diferenciación. Western blot resultados mostraron que la Bandera-tagged Celf1 sólo estaba presente en las culturas pMSCV-Celf1Flag transducidas y se reguló la expresión de la proteína Celf1 (Figura 2A). La formación de miotubos en células que sobreexpresan Celf1 es raro en comparación con los cultivos de control (Figura 2B), lo que sugiere que la sobreexpresión de Celf1 que limita enormemente la diferenciación de mioblastos.

Para determinar si Celf1 caída rescata la deficiencia de la diferenciación en células CUG-expansión, Celf1 shRNA fue entregado a las células GFP-CUG200 por vectores de lentivirus. Se seleccionaron clones resistentes a G418 y dobles (puromicina) y se agruparon para los estudios de diferenciación. El nivel de proteína Celf1 endógeno se redujo notablemente en presencia de Celf1 shRNA (Figura 3A). Después de 6 días de diferenciación, el efecto de Celf1 shRNA en el aumento de la formación de miotubos fue evidente (Figura 3B). índices de fusión y son myotubecomo eran 16,1 ± 3,0% y 15,2 ± 1,2%, respectivamente, en comparación con 4,6 ± 0,8% y 5,1 ± 1,3% en cultivos de control (Figura 3C). Mientras tanto, los resultados en tiempo real de RT-PCR sugieren que la expresión de MyoD, MYOG y MEF2C fue significativamente mayor en las células Celf1 shRNA (Figura 3D) de apoyo Celf1 caída rescatado deficiencia de la diferenciación de los miocitos.

Figura 1
Figura 1. CUG-Expansión inhibe la diferenciación de las células miocitos C2C12. Células (A) C2C12 expresan GFP-CUG5 o GFP-CUG200 doquier después de la selección. Las barras de escala son 100 micras. Esta cifra se ha modificado desde nuestro anterior documento 10. (B) Myotubes se formaron en las células GFP-CUG5 pero menos en las células GFP-CUG200. Miotubos se visualizaron por la miosina de cadena pesada (MF-20) inmunotinción. Las barras de escala son 100 micras. (C) (D) en tiempo real el análisis RT-PCR de Celf1, factores de transcripción MyoD, MYOG, y la expresión durante la diferenciación de mioblastos MEF2C. los niveles de mRNA se trazaron después de la GAPDH normalizado. Las barras de error representan desviaciones estándar. Se realizó la prueba t de Student para comparar las pruebas con los controles. n> 3, * P <0,05. (E) GFP-CUG200 transfección aumento de la expresión de proteínas Celf1. ß-actina se muestra como el control de carga. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. La sobreexpresión de Celf1 deteriora mioblastos diferenciación. (A) La prueba de la expre Celf1Flag exógenosión en las células C2C12 por Western blot. formación (B) myotube fue afectada en Celf1Flag sobreexpresan mioblastos C2C12. Myotubes se visualizaron por MF-20 inmunotinción. Las barras de escala son 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Derribo de Celf1 parcialmente rescates CUG-expansión inducida por deficiencia de mioblastos diferenciación. (A) La prueba de la caída Celf1 por Western blot. (B) Celf1 shRNA myotube formación inducida en mioblastos GFP-CUG200. Myotubes se visualizaron por MF-20 inmunotinción. Las barras de escala son 100 micras células. (C) Celf1 shRNA-rescató que habían aumentado áreas índice de fusión y de miotubos. Las barras de error representan desviaciones estándar. (D) en tiempo real RT-PCR análisis de Celf1, factores de transcripción MyoD, MYOG, y la expresión de MEF2C durante la diferenciación. el nivel de ARNm se trazó después de la normalización a la de GAPDH. Las barras de error representan desviaciones estándar. Se realizó la prueba t de Student para comparar las pruebas de control. n> 3, * p <0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Línea celular C2C12 se ha utilizado como un modelo para estudiar la miogénesis 11-14. Estas células conservan un aspecto similar a fibroblastos, proliferan rápidamente en medios que contienen suero bovino fetal 20% y fácilmente diferencian en medios que contienen 2% de suero equino 15. El rápido crecimiento y la diferenciación son características ventajosas en un modelo celular miogénesis. Aquí, se demuestra el uso de plásmido, retroviral, y vectores lentivirales para introducir ADNc, 3'-UTR, y shRNA en células C2C12. Los puntos críticos para la transfección / transducción y el mantenimiento de la coherencia en la diferenciación se destacan a continuación.

La densidad celular en el mantenimiento de células diaria es crítica. Estas células necesitan ser cultivadas por debajo de 50 - 70% de confluencia. Debido al corto tiempo de duplicación de la población, de alta confluencia (> 70%) cultura C2C12 se diferencia de forma espontánea cuando se deja durante la noche. Mientras que la fracción de células diferenciadas de forma espontánea puede ser pequeña, la presenciade las células diferenciadas contribuirán a inconsistencias en la diferenciación de los experimentos posteriores. Se prefieren las células C2C12 Además, recientemente descongelado que tienen bajo número de pasos. Para la diferenciación, las células se colocaron en placas a números predeterminados de manera que alcanzan la confluencia completa después de 24 hr. La insulina se mantiene congelada en pequeñas alícuotas y se añade cada vez que se cambia el medio de diferenciación. Estas medidas mejoran los resultados de diferenciación.

medio libre de suero mejora la transfección de células C2C12. Las células se pueden incubar en mezcla de transfección / medio libre de suero durante la noche. En nuestro laboratorio, logramos hasta 20% tasa de transfección, acompañado de ligeros signos de citotoxicidad. La concentración de medicamento que se usa para seleccionar células C2C12 es mayor, 1.2 a 1.6 mg / ml de G418 o 1 a 3 mg / ml de puromicina, y la duración de la selección es más largo que la mayoría de las otras líneas celulares. Debido a la toxicidad potencial bajo alta concentración de fármaco y el período de incubación prolongada, lote a lotevariación en el potencial de diferenciación puede surgir. Es crucial para ajustar el esquema de selección (concentración y duración) basada en la apariencia celular y para el tratamiento de los grupos experimentales y de control juntos.

Hemos introducido con éxito GFP-CUG200 en células C2C12 que reproducen 3'-UTR de expansión CUG en DM1. La introducción de Celf1 en células C2C12 y Celf1 shRNA en células GFP-CUG200 C2C12 ha permitido la evaluación de los eventos celulares y moleculares desencadenados por Celf1 regulación al alza y la exploración de la orientación Celf1 para ayudar a la diferenciación de mioblastos DM1, respectivamente. En resumen, el modelo de mioblastos C2C12 que se presenta aquí beneficia a la investigación de la distrofia miotónica, así como la biología celular muscular general y la diferenciación miogénica. La limitación de este modelo es que los hallazgos en las líneas celulares pueden no extenderse completamente para los organismos. Los resultados de los modelos actuales son a menudo avanzaron a aislar mioblastos frescas de animales y el estudio de su diferenciaciónción. En última instancia, justificar las no mioblastos en los organismos.

Lo que distingue a este estudio es la manipulación genética de varios niveles en mioblastos C2C12, que permite el modelado de la secuencia de eventos genéticos / patológicos en DM1. Anteriormente, el efecto de la expansión toxicidad ARN DMPK CUG se documentó en mioblastos 11-14, mientras que las funciones patológicas de Celf1 se estudiaron por separado en modelos de ratón 16,17. Modelado de estos eventos patológicos / genéticos secuenciales es técnicamente difícil y requiere mucho tiempo si se realiza en modelos animales. Como se demuestra en este estudio, el uso combinado de los marcadores fluorescentes y resistentes a drogas permite el modelado de eventos moleculares adicionales en la distrofia miotónica. Los modelos establecidos en este estudio pueden ser útiles en la disección de los mecanismos detallados en DM1 patogénesis. También sería muy útil en la detección de drogas que se dirigen a diferentes etapas de la patogénesis DM1. Las estrategias y procedimientos del presenteestudio puede arrojar luz sobre el establecimiento de otros modelos de enfermedades musculares en mioblastos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose Life Technologies 11965-084 for culture medium
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 for culture medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Life Technologies 10378-016 for culture medium
Insulin from bovine pancreas Sigma Aldrich I6634-100MG for differentiation medium
equine serum Atlanta Biologicals S12150 for differentiation medium
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311  for transfection
G418 sulfate  Gold Biotechnology  G-418-10 for drug resistant selection
Puromycin dihydrochloride Sigma Aldrich sc-108071 for drug resistant selection
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well Life Technologies NP0323BOX for western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Life Technologies NP00061 for western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Life Technologies NP0002 for western blot
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m GE healthcare life science 10600015 for western blot
MF 20 Developmental Hybridoma Bank MF 20 primary Ab for immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate Thermo Fisher Scientific T-862 secondary Ab for immunostaining
One step qRT-PCR MasterMix AnaSpec 05-QPRT-032X for qRT-PCR
TriPure Isolation Reagent Roche 11667165001 for RNA isolation
CUG-BP1 Antibody (3B1) santa cruz sc-20003 primary Ab western blot
Actin Antibody santa cruz sc-1615 goat polyclonal IgG for loading control
293T Ecopack Clontech 631507 cells for retrovirus preparation
pMSCV-puro Clontech 634401 empty retroviral vector for retrovirus preparation
pMSCV-Celf1Flag-puro house-constructed not available retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation
psPAX2 gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
pMD2.G gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
GFP-CUG5 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
GFP- CUG200 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 for immunostaining
paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 for immunostaining
TWEEN 20 Sigma Aldrich P9416 for immunostaining
DAPI Sigma Aldrich D9542 for immunostaining

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References

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