Modeling myotonic dystrofi 1 i C2C12 myoblastceller

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

I denne protokol, præsenterer vi procedurerne i oprettelse myotonisk dystrofi 1 myoblast modeller, herunder optimeret C2C12 celle vedligeholdelse, gen transfektion / transduktion, og myocyt differentiering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liang, R., Dong, W., Shen, X., Peng, X., Aceves, A. G., Liu, Y. Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells. J. Vis. Exp. (113), e54078, doi:10.3791/54078 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Myotonic dystrofi 1 (DM1) er en almindelig form for muskelsvind. Selv om der er etableret en række dyremodeller for DM1, myoblast celle modeller er stadig vigtigt, fordi de tilbyder et effektivt cellulært alternativ til at studere cellulære og molekylære begivenheder. Selvom C2C12 myoblastceller er ofte blevet brugt til at studere myogenese, modstandsdygtighed over for gen transfektion eller viral transduktion, hindrer forskning i C2C12-celler. Her beskriver vi en optimeret protokol, der omfatter daglig vedligeholdelse, transfektion og transduktion procedurer til at indføre gener i C2C12 myoblaster og induktion af myocyt differentiering. Kollektivt, disse procedurer gør det muligt bedste transfektion / transduktion effektivitet, samt konsistente differentiering resultater. Fremgangsmåden beskrevet i oprettelse DM1 myoblast cellemodeller ville gavne studiet af myotonisk dystrofi, samt andre muskelsygdomme protokol.

Introduction

Myotonic dystrofi (DM) er en autosomal dominant sygdom, der påvirker flere systemer, især hjerte- og skeletmuskulatur 1. Der er to undertyper af denne sygdom, DM1 og DM2. DM1 er mere almindelig og har en mere alvorlig manifestation end DM2 2. Den genetiske mutation underliggende DM1 er en udvidelse af CUG triplet repeats beliggende i den 3'-utranslaterede region (UTR) i DM proteinkinase genet (DMPK) 3. CUG repeat nummer i uberørte individer varierer fra 5 til 37. I modsætning hertil er det stiger til mere end 50, og nogle gange op til tusindvis i DM1 patienter 4. Som et resultat, RNA-bindende proteiner, såsom muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP, og Elav-lignende familie 1 (Celf1), er misregulated. På grund af den beslaglæggelse på de ekspanderede CUG gentagelser, MBNL1 mister sin evne til at regulere alternativ splejsning 5. Celf1, på den anden side, er opreguleret 6,7. Overekspression af Celf1 er forbundet med muskeltabog svaghed, som ikke tilskrives tab af MBNL1 funktion. Dyremodeller, der simulerer DM1-relaterede ændringer, herunder DMPK 3'-UTR CUG ekspansion, tab af MBNL1, og overekspression af Celf1, er blevet etableret. Men modellering DM1 i myoblaster tilbyder et effektivt alternativ, især for dissekere DM1-relaterede cellulære og molekylære begivenheder.

C2C12 myoblast cellelinje blev først isoleret fra såret C3H mus muskel og bredt anvendt til at undersøge myogene differentiering 8,9. C2C12 celler hurtigt formere sig i føtalt bovint serum (FBS) -holdige medier og let undergår differentiering, når FBS er opbrugt. Men ved hjælp af denne myoblast differentiering model præsenterer to udfordringer: C2C12 celler er ofte resistente over for gen transfektion / viral transduktion; og mindre variationer i celle håndtering og differentiering procedure kan føre til markante ændringer i myotube formation.

Vores laboratorium anvender rutinemæssigt C2C12 myoblaster som acell model og har udviklet protokoller, der effektivt leverer gener ved plasmidtransfektion, retroviral transduktion, og lentiviral transduktion ind C2C12 cellelinje 10. I videoen viser vi de optimerede procedurer til transfektion / transduktion C2C12 celler og opretholdelse differentiering konsekvens i oprettelse DM1 myoblast modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. C2C12 Cellekultur

  1. Opretholde C2C12 mus myoblaster i en 100 mm plade i vækstmedium (Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM)) suppleret med 20% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin. Tillad C2C12 passerede celler at blive ca. 50 - 60% sammenflydende.
  2. Kassér vækstmediet og vask C2C12 celler med 3 ml stuetemperatur phosphatbufret saltvand (PBS). Fjern PBS, og der tilsættes 500 pi 0,25% trypsin-EDTA at frigøre cellerne. Pladen anbringes i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 3 - 5 min.
  3. Neutralisere trypsin ved at tilsætte 3 ml vækstmedium. Pipette 6 - 8 gange for at suspendere cellerne. Der tilsættes 1 ml suspenderede celle til en ny 100 mm plade og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2.

2. C2C12 celletransfektion / transduktion og Selection

  1. C2C12 plasmidtransfektion
    1. 24 timer før transfektion, ssene 7,0 x 10 5 C2C12 celler i en brønd i en seks-brønds plade for hver transfektion.
      Bemærk: Dette fører til 50 - 60% sammenløb på tidspunktet for transfektion.
    2. Tillad transfektionsreagens at nå stuetemperatur før anvendelse.
    3. Tilsæt 2 ug plasmid DNA (GFP-CUG5 eller GFP-CUG200) i 200 pi forvarmet serumfri medium og vortex kortvarigt. Tilføj 6 pi transfektionsreagens til mediet og bland straks for 30 sek ved hjælp af en vortex. Inkuber blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur.
    4. Skift medierne i C2C12-celler til 2,5 ml serumfrit vækstmedium. Tilføj transfektionsblandingen til cellerne efter inkubation. Retur pladerne til en 5% CO2, 37 ° C inkubator.
    5. Holde cellerne i transfektionsblandingen / serumfrit vækstmedium i 4 timer eller op til natten over. Skift medier tilbage til vækstmedier næste dag, eller når cytotoksicitet fremgår.
      Bemærk: Cytotoksicitet vurderes ved mikroskopisk inspektion af ceLLS. Overhold ændringerne i cellemorfologi og celle løsrivelse. Så længe der ikke er nogen åbenlys cytotoksicitet, inkubation natten over i serumfrit vækstmedium øger transfektion.
    6. Vælge cellerne 48 timer efter transfektion ved tilsætning af 1.2 - 1,6 mg / ml G418 i ~ 10 dage indtil kontrolkulturen (transficeret uden plasmiderne) ikke har levende celler. Skift medierne hver to dage med vækstmedie suppleret med G418.
    7. Vedligehold G418-resistente celler i vækstmedium og 5% CO2 ved 37 ° C i efterfølgende eksperimenter.
  2. forberedelse retrovirus- og C2C12 retroviral transduktion
    1. Forbered HEK 293 dyrkningsmedium ved at supplere DMEM høj glucose med 10% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin.
      1. Ca. 24 timer før transfektion, plade 4,0 x 10 6 økotropiske HEK 293-baserede emballagematerialer celler i en 100 mm plade (80% konfluens ved transfektion) containing celledyrkningsmedium.
    2. Tillad transfektionsreagens at nå stuetemperatur før anvendelse.
    3. Bland 15 ug plasmid-DNA (pMSCV-Puro eller pMSCV-Celf1Flag-Puro) i 1 ml serumfrit vækstmedium. Vortex kortvarigt. Tilsæt 30 pi transfektionsreagens fra trin 2.2.2 i DNA'et / serumfrit vækstmedium rør, og bland godt ved hjælp vortex. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 30 min.
    4. Tilføj transfektionsblandingen dråbevis til de ecotropisk HEK 293-baserede pakkeceller. Forsigtigt hvirvle pladerne og returnere dem tilbage til 5% CO2, 37 ° C inkubator. Efter 24 timer ændre mediet til 10 ml forvarmet frisk vækstmedium.
    5. Høst supernatanten (indeholdende retrovirus) 48 timer efter transfektion under anvendelse af en pipette og overføres supernatanten til et 50 ml centrifugerør. Der tilsættes 10 ml nye varme medier til pladen og returnere det til inkubatoren. Hold supernatanten ved 4 ° C.
      Bemærk: Medierne føjes forsigtigt til than side af brønden for ikke at forstyrre cellemonolaget.
    6. Harvest det andet parti supernatant 60 timer efter transfektion og samle den med supernatanten fra 2.2.5. Der centrifugeres ved 500 xg, 4 ° C i 7 minutter til fjernelse af cellerester.
    7. Supernatanten overføres til et nyt 50 ml centrifugerør. Brug retrovirus til at transducere C2C12 celler på dette tidspunkt ved at gå til trin 2.2.9 eller portion og opbevar supernatanten ved -20 ° C til senere brug.
    8. Optøs retrovirus fra 2.2.7 ved stuetemperatur, hvis en frossen stamopløsning anvendes her.
      Bemærk: Undgå flere fryse-tø cykler.
    9. Plate C2C12 celler på samme dag af transduktion sigter i 30 - 40% konfluens.
      1. Kassér vækstmediet og vask C2C12 celler med 3 ml stuetemperatur PBS. Fjern PBS, tilsættes 500 pi 0,25% trypsin-EDTA og inkuberes pladen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 3 - 5 min.
      2. Neutralisere trypsin ved at tilsætte 3 ml vækst withium. Pipette 6 - 8 gange for at suspendere cellerne. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og tilsæt 8,0 x 10 5 C2C12 celler til en 60 mm plade.
    10. Tilsæt 0,5 ml retrovirus til at inficere en 60 mm plade af celler i 3 ml vækstmedium. Returnere pladen til inkubatoren.
    11. Erstat med 3 ml frisk medium suppleret med valg antibiotikum (puromycin 1 - 3 ud ug / ml) 48 timer efter infektion. Udskift 3 ml medium med antibiotika hver dag for ~ 5 dage, indtil utransducerede C2C12 kontrol kultur dør ud.
  3. Lentivirus forberedelse og C2C12 lentiviral transduktion
    Bemærk: Udfør alle lentivirus-relaterede procedurer i biosikkerhedsniveau 2 kabinet og følg biologiske sikkerhedsretningslinjer. Flydende affald indeholdende virussen skal desinficeres inden bortskaffelse.
    1. Plade 4,0 x 10 6 293T celler i en 100 mm plade (~ 80% konfluens på dagen for transfektion) med HEK 293 celledyrkningsmedium (DMEM høj glucose, suppleret med 10% føtaltbovint serum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin) 24 timer før transfektion.
    2. Varm transfektionsreagens til stuetemperatur. Bland lentiviral emballage vektorer (4 ug pMD2.G og 6 ug psPAX2) sammen med 8 ug lentiviral-transfer-vektor (Celf1 shRNA eller krypteret kontrol shRNA) i 1 ml serumfrit cellekulturmedium. Vortex kortvarigt.
    3. Tilføj 36 pi forvarmet transfektionsreagens til DNA / DMEM rør og bland godt ved vortex. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 30 min.
    4. Fjern 293T-celler fra inkubatoren og tilføj transfektionsblandingen til pladen. Vend forsigtigt pladen og returnere det tilbage til 5% CO2, 37 ° C inkubator. Efter 24 timer udskiftes transfektionsblandingen med 10 ml frisk dyrkningsmedium.
    5. Opsaml supernatanten indeholdende lentivirus 48 timer efter transfektion og overføre den til en 50 ml centrifugerør. Tilsæt 10 ml nye varme medier til pladen og returnere detat inkubator. Supernatanten opbevares ved 4 ° C.
    6. Saml det andet parti supernatant 60 timer efter transfektion og kombinere det med supernatanten fra 2.3.5. Centrifuge kortvarigt ved 500 xg, 4 ° C i 7 min.
    7. Supernatanten overføres til et frisk 50 ml centrifugerør. Hvis du bruger frisk virus, gå videre til trin 2.3.9. Til fremtidig anvendelse opbevares virusholdige supernatant ved -20 ° C i portioner på 10 ml.
    8. Optø virus fra 2.3.7 ved stuetemperatur før brug, hvis der anvendes en frossen stamopløsning.
      Bemærk: Undgå flere fryse-tø cykler.
    9. Plate C2C12-CUG200 celler (opnået i afsnit 2.1), som beskrevet i 2.2.9 på samme dag af transduktion.
      Bemærk: Sigt 30 - 40% af sammenløb.
    10. Tilsæt 0,5 ml virus til at inficere en 60 mm plade af C2C12-CUG200 og returnere pladen til inkubatoren.
    11. Erstat dyrkningsmediet med frisk medium suppleret med valg antibiotikum (puromycin 1 - 3 ud ug / ml) 72 timer efter transduktion.Opdater dyrkningsmedier hverdagen med udvælgelsen antibiotikum for ~ 5 dage, indtil alle utransducerede C2C12-CUG200 kontrol kultur dør ud.
    12. Brug Western blot at verificere Celf1 knockdown i GFP-CUG200 transficerede celler.

3. C2C12 Cell Differentiering

  1. Plade 2 x 10 6 celler i en brønd i en 6-brønds plade i 2,5 ml vækstmedier 24 timer før initiering af differentiering.
    Bemærk: udpladningsdensitet kan justeres, så at fuld konfluens er nået i 24 timer.
    1. Skyl konfluente celler med PBS, og der tilsættes 2,5 ml af lav-serum differentiering medium (Dulbeccos modificerede Eagles medium suppleret med 2% hesteserum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1 pM insulin) . Udskifte mediet hver anden dag.
      Bemærk: Hold lager insulin frosne og føje den til medierne på hvert medium forandring.
  2. Under C2C12 differentiering, indsamle prøver til quantitative RT-PCR (se afsnit 4) på ​​følgende tidspunkter: Dag 0, 1, 2, 4 og 6. Proces kulturen for immunfarvning på dag 6 - 8 (se afsnit 5).

4. RNA-isolering og kvantitativ RT-PCR

  1. Brug fabrikantens protokol for RNA-isolering. Efter isolering, resuspender RNA pellet i 30 pi RNase-frit vand og pipetteres op og ned flere gange.
    Bemærk: Prøverne kan fortsætte til kvantitativ RT-PCR eller kan opbevares ved -80 ° C.
  2. Brug en RT qPCR kit til kvantitativ RT-PCR 10 og følg producentens anvisninger. Forbered reaktionsblandingen i henhold til tabel 1.
Komponent Volumen (pi) slutkoncentration
2x reaktionsbuffer 10 1x
fremadrettet primer 0.5 200 nM
reverse primer 0.5 200 nM
Probe 0.5 200 nM
Reverse transcriptase & RNase Inhibitor 0,1 0,25 U / ml
Skabelon 1 100 ng totalt RNA
RNase-frit vand 7.4 NA
Samlet Mix 20

Tabel 1. Kvantitativ RT-PCR Master Mix Fremstilling

  1. Køre en 20 pi RT-qPCR reaktion under anvendelse termisk profil tabel 2.
Revers transkription trin 30 min, 48 ° C
DNA-polymerase aktivering / revers transkriptase inaktivering 10 min, 95 ° C
40 cykler 15 sek, 95 ° C
1 min, 60 ° C

Tabel 2. Kvantitativ RT-PCR termisk profil

5. Immunfarvning

  1. Fastgør monolagskultur i 2,5 ml frisk fremstillet 4% paraformaldehyd / PBS ved stuetemperatur i 10 min.
  2. Permeabilisere prøverne i 2,5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS i 30 minutter ved stuetemperatur.
  3. Overfør prøverne til et fugtigt kammer. Blokere prøverne i 2,5 ml blokerende buffer (0,1% ikke-ionisk overfladeaktivt middel / PBS, 10% normalt gedeserum) i 30 minutter ved 37 ° C.
  4. Kassér blokerende puffer og anvende 800 pi primære antistof mod Myosin Heavy Chain fortyndet med blokerende buffer (1: 100). Inkuber i et fugtigt kammer natten over ved stuetemperatur.
  5. Vask pladen 3 times (10 min hver) med 2,5 ml vaskebuffer (0,1% polysorbat 20 / PBS) på dag 2.
  6. Fjern vaskepufferen og anvende 800 pi sekundært antistof (gede-anti-muse IgG, 1: 500 fortyndet i PBS). Inkuber i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i 1 time.
  7. Vask to gange (10 min hver) med 2,5 ml vaskebuffer.
  8. Inkuber med 800 pi DAPI (1 ug / ml, fortyndet i destilleret deioniseret H2O) i 5 minutter.
  9. Vask med 2,5 ml vaskebuffer igen i 10 min.
  10. Skift vaskebuffer til 2,5 ml PBS og anvende et fluorescerende mikroskop for at tage billeder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C2C12-celler blev transficeret med GFP-CUG5 eller GFP-CUG200. Efter lægemiddel-resistens selektion blev stabile pools etableret, hvilket kan visualiseres ved GFP-ekspression (figur 1A). Myotube dannelse i de differentierede myoblaster blev påvist ved myosin tung kæde immunfarvning 10 (figur 1B). Kvantificeringen af myotube dannelse viste, at fusion indeks blev reduceret fra 35,4 ± 4,1% til 2,6 ± 1,1% og myotube områder blev reduceret fra 35,6 ± 2,2% til 2,7 ± 0,8% af unormal CUG ekspansion i GFP-CUG200 (figur 1C). Sammensmeltningen indeks og den myotube området blev talt via det totale antal kerner i myorør (≥ 2 kerner) divideret med det samlede antal kerner og procentdelen af ​​det samlede billedområde dækket af myorør hhv. Real-time RT-PCR 10 blev udført for at analysere ekspression for en række muskel forskelligiation beslægtede gener herunder MyoD, MyoG, Mef2c og Celf1. Sammenlignet med CUG5 kulturer, CUG200 øgede ekspressionen af ​​Celf1 mRNA i prolifererende myoblaster i begyndelsen af ​​differentiering. Kongruent med tidligere rapporter, blev Celf1 opregulering forbundet med CUG-ekspansion i myogene dystrofi 1 (figur 1D). Yderligere, Western blotting 10 viste konsekvent Celf1 proteinniveauet var forhøjet (figur 1E), og CUG200 inhiberede ekspressionen af MyoD, MyoG og Mef2c under differentiering (figur 1 D). Disse resultater antyder, at CUG-udvidelse fører til myotube fejl og forringet myoblast differentiation.

For at undersøge den rolle, Celf1 i myoblast differentiering blev pMSCV- Celf1Flag retroviral vektor konstrueret til at transducere C2C12 celler. 10 Puromycin-resistente kloner blev samlet for differentiering studier. Western blot-resultater viste, at Flag-tagged Celf1 var kun til stede i de pMSCV-Celf1Flag transducerede kulturer og udtryk for Celf1 protein blev opreguleret (figur 2A). Dannelsen af myorør i Celf1-overudtrykkende celler er sjælden i sammenligning med kontrolkulturerne (figur 2B), hvilket tyder på, at overekspression af Celf1 alvorligt forringer myoblast differentiation.

At afgøre, om Celf1 knockdown redder differentiering mangel i CUG-ekspansion celler blev Celf1 shRNA leveret til GFP-CUG200 celler ved lentivirusvektorer. Dobbelt resistente kloner (G418 og puromycin) blev udvalgt og puljet for differentiering studier. Niveauet af endogent Celf1 protein blev markant reduceret i nærvær af Celf1 shRNA (figur 3A). Efter 6 dages differentiering, virkningen af Celf1 shRNA om øget myotube formation var tydelig (figur 3B). Fusion indekser og myotube ersom var 16,1 ± 3,0% og 15,2 ± 1,2%, sammenlignet med 4,6 ± 0,8% og 5,1 ± 1,3% i kontrolkulturer (Figur 3C). I mellemtiden, real-time RT-PCR-resultater tyder på, at ekspressionen af MyoD, MyoG og Mef2c blev øget betydeligt i Celf1 shRNA celler (Figur 3D) understøtter Celf1 knockdown reddet myocyt differentiering mangel.

figur 1
Figur 1. CUG-Udvidelse Hæmmer myocyt Differentiering i C2C12 celler. (A) C2C12 celler udtrykte GFP-CUG5 eller GFP-CUG200 allestedsnærværende efter valget. Scale barer er 100 um. Dette tal har været ændret siden vores tidligere papir 10. (B) Myorør blev dannet i GFP-CUG5 celler, men mindre i GFP-CUG200 celler. Myorør blev visualiseret ved myosin tung kæde (MF-20) immunfarvning. Scale barer er 100 um. (C) (D) Real-time RT-PCR-analyse af Celf1, transkriptionsfaktorer MyoD, MyoG, og Mef2c ekspression under myoblast differentiation. mRNA-niveauer blev plottet efter GAPDH normaliseret. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelser. Students t-test blev udført for at sammenligne test til kontrol. n> 3, * P <0,05. (E) GFP-CUG200 transfektion forøget Celf1 proteinekspression. ß-actin er vist som lastning kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Overekspression af Celf1 forringer myoblast Differentiering. (A) Bevis for eksogen Celf1Flag EXPREssion i C2C12 celler ved Western blot. (B) Myotube dannelse blev svækket i Celf1Flag-overekspression C2C12 myoblaster. Myorør blev visualiseret ved MF-20 immunfarvning. Scale barer er 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Knockdown af Celf1 Delvist Rescues CUG-Expansion-induceret myoblast Differentiering mangel. (A) Bevis for Celf1 knockdown ved Western blot. (B) Celf1 shRNA induceret myotube dannelse i GFP-CUG200 myoblaster. Myorør blev visualiseret ved MF-20 immunfarvning. Scale barer er 100 um. (C) Celf1 shRNA-reddet celler, der var steget fusion indeks og myotube områder. Fejlbjælkerne viser standardafvigelser. (D) Real-time RT-PCR-analyse af Celf1, transkriptionsfaktorer MyoD, MyoG, og Mef2c ekspression under differentiering. mRNA niveau blev plottet efter normalisering til den for GAPDH. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelser. Students t-test blev udført for at sammenligne prøverne til kontrol. n> 3, * P <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C2C12-cellelinie er blevet anvendt som en model til at studere myogenese 11-14. Disse celler bevarer et fibroblastlignende udseende, prolifererer hurtigt i medier indeholdende 20% føtalt bovint serum og let differentiere i medier indeholdende 2% hesteserum 15. Den hurtige vækst og differentiering er fordelagtige egenskaber i en myogenese celle model. Her demonstrerer vi brug af plasmid, retroviral, og lentivirusvektorer at indføre cDNA, 3'-UTR, og shRNA ind C2C12-celler. De kritiske punkter for transfektion / transduktion og vedligeholdelse af konsistens i differentiering er fremhævet nedenfor.

Celledensiteten i den daglige celle vedligeholdelse er kritisk. Disse celler skal dyrkes under 50 - 70% sammenløb. På grund af den korte population fordoblingstid, høj konfluens (> 70%) C2C12 kultur spontant differentierer når venstre natten over. Mens den del af spontant differentierede celler kan være små, tilstedeværelsenaf differentierede celler vil bidrage til uoverensstemmelser i de efterfølgende differentiering eksperimenter. Derudover frisk optøede C2C12 celler, der har lav passage nummer foretrækkes. For differentiering celler udplades ved forudbestemte numre, så de når fuld sammenløb efter 24 timer. Insulin er holdt frosset i små portioner, og der tilsættes hver gang differentieringen ændres mediet. Disse foranstaltninger forbedrer differentiering resultater.

Serumfrit medium forøger C2C12 celletransfektion. Cellerne kan inkuberes i transfektionsblandingen / serumfrit medium natten over. I vores laboratorium, vi opnår op til 20% transfektion sats, ledsaget af svage tegn på cytotoksicitet. Koncentrationen af ​​lægemiddel, der anvendes til at vælge C2C12 celle er højere, 1,2 til 1,6 mg / ml G418 eller 1 til 3 pg / ml puromycin, og varigheden af ​​markeringen er længere end de fleste andre cellelinjer. På grund af potentielle toksicitet under højt lægemiddelkoncentration og den forlængede inkubationstid, parti-til-partivariation i differentiering potentiale kan opstå. Det er afgørende at justere markeringen ordningen (koncentration og varighed) baseret på celle udseende og at behandle eksperiment og kontrolgrupperne sammen.

Vi har med succes indført GFP-CUG200 i C2C12 celler, der formerer 3'-UTR CUG ekspansion i DM1. Introduktion Celf1 ind C2C12 celler og Celf1 shRNA i GFP-CUG200 C2C12 celler har tilladt vurdering af cellulære og molekylære begivenheder udløst af Celf1 opregulering og udforskning af målretning Celf1 at hjælpe DM1 myoblast differentiering, hhv. Sammenfattende C2C12 myoblast model præsenteres her gavner undersøgelse af myotonisk dystrofi samt generel muskel cellebiologi og myogene differentiering. Begrænsningen ved denne model er, at resultaterne i cellelinjer ikke helt kan omfatte organismer. Resultaterne i de nuværende modeller er ofte avancerede til at isolere friske myoblaster fra dyr og studere deres differentieringtion. I sidste ende vi underbygge myoblastceller fund i organismer.

Den unikke styrke denne undersøgelse er den multi-tier genmanipulation i C2C12 myoblaster, som muliggør modellering af sekventielle genetiske / patologiske begivenheder i DM1. Tidligere blev RNA toksicitet virkning DMPK CUG ekspansion dokumenteret i myoblaster 11-14, mens de patologiske roller Celf1 separat blev undersøgt i musemodeller 16,17. Modeling disse sekventielle genetiske / patologiske begivenheder er teknisk udfordrende og tidskrævende hvis den udføres i dyremodeller. Som påvist i denne undersøgelse, den kombinerede anvendelse af fluorescerende og lægemiddelresistente markører tillader modellering af supplerende molekylære begivenheder i myotonic dystrofi. Modellerne, der er etableret i denne undersøgelse vil være nyttigt i at dissekere de detaljerede mekanismer i DM1 patogenese. De vil også være værdifulde i screening for lægemidler, der er målrettet forskellige trin i DM1 patogenese. Strategierne og procedurerne i denneUndersøgelsen kan kaste lys over etablere andre muskulære sygdomsmodeller i myoblaster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose Life Technologies 11965-084 for culture medium
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 for culture medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Life Technologies 10378-016 for culture medium
Insulin from bovine pancreas Sigma Aldrich I6634-100MG for differentiation medium
equine serum Atlanta Biologicals S12150 for differentiation medium
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311  for transfection
G418 sulfate  Gold Biotechnology  G-418-10 for drug resistant selection
Puromycin dihydrochloride Sigma Aldrich sc-108071 for drug resistant selection
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well Life Technologies NP0323BOX for western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Life Technologies NP00061 for western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Life Technologies NP0002 for western blot
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m GE healthcare life science 10600015 for western blot
MF 20 Developmental Hybridoma Bank MF 20 primary Ab for immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate Thermo Fisher Scientific T-862 secondary Ab for immunostaining
One step qRT-PCR MasterMix AnaSpec 05-QPRT-032X for qRT-PCR
TriPure Isolation Reagent Roche 11667165001 for RNA isolation
CUG-BP1 Antibody (3B1) santa cruz sc-20003 primary Ab western blot
Actin Antibody santa cruz sc-1615 goat polyclonal IgG for loading control
293T Ecopack Clontech 631507 cells for retrovirus preparation
pMSCV-puro Clontech 634401 empty retroviral vector for retrovirus preparation
pMSCV-Celf1Flag-puro house-constructed not available retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation
psPAX2 gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
pMD2.G gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
GFP-CUG5 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
GFP- CUG200 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 for immunostaining
paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 for immunostaining
TWEEN 20 Sigma Aldrich P9416 for immunostaining
DAPI Sigma Aldrich D9542 for immunostaining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. W. B. Saunders. (2001).
  2. Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45, (10), 2280-2287 (2013).
  3. Brook, J. D., et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell. 68, (4), 799-808 (1992).
  4. Chau, A., Kalsotra, A. Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics. Dev Dyn. 244, (3), 377-390 (2015).
  5. Ho, T. H., et al. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J. 23, (15), 3103-3112 (2004).
  6. Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation. Mol Cell. 28, (1), 68-78 (2007).
  7. Kalsotra, A., et al. The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression. Cell Rep. 6, (2), 336-345 (2014).
  8. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, (5639), 725-727 (1977).
  9. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32, (4), 1171-1180 (1983).
  10. Peng, X., et al. Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity. Biochim Biophys Acta. 1852, (7), 1490-1497 (2015).
  11. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation. Hum Mol Genet. 10, (18), 1879-1887 (2001).
  12. Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. Hum Mol Genet. 8, (11), 1975-1984 (1999).
  13. Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. (CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta. 1453, (2), 221-229 (1999).
  14. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Dev Biol. 265, (2), 294-301 (2004).
  15. Emerson, C. P., Sweeney, H. L. Methods in muscle biology. 52, Academic Press. (1997).
  16. Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19, (18), 3614-3622 (2010).
  17. Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19, (6), 1066-1075 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics