Modellierung Muskeldystrophie 1 in C2C12 Myoblastenzellen

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Summary

In diesem Protokoll stellen wir die Verfahren in Muskeldystrophie 1 Myoblasten Modelle Gründung, einschließlich optimierte C2C12 Zell Wartung, Gen-Transfektion / Transduktion und Myozyten-Differenzierung.

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Liang, R., Dong, W., Shen, X., Peng, X., Aceves, A. G., Liu, Y. Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells. J. Vis. Exp. (113), e54078, doi:10.3791/54078 (2016).

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Abstract

Muskeldystrophie 1 (DM1) ist eine häufige Form der Muskeldystrophie. Obwohl mehrere Tiermodelle haben für DM1, Myoblasten Zellmodelle sind nach wie vor wichtig, weil sie eine effiziente zelluläre Alternative für die Untersuchung zellulärer und molekularer Ereignisse bieten etabliert. Obwohl in großem Umfang Zellen C2C12 Myoblasten verwendet myogenesis, Resistenz gegen Gen-Transfektion oder virale Transduktion zu studieren, behindert die Forschung in C2C12-Zellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll, das die tägliche Wartung umfasst, Transfektion und Transduktion Verfahren Gene in C2C12 Myoblasten und die Induktion von myocyte Differenzierung einzuführen. Gemeinsam ermöglichen diese Verfahren am besten Transfektion / Transduktionseffizienzen sowie konsequente Differenzierung Ergebnisse. Das Protokoll bei der Einrichtung DM1 Myoblasten Zellmodelle beschrieben würde die Studie von Muskeldystrophie zugute kommen, sowie andere Muskelerkrankungen.

Introduction

Muskeldystrophie (DM) ist eine autosomal dominante Erkrankung , die mehrere Systeme betrifft, vor allem Herz- und Skelettmuskulatur 1. Es gibt zwei Subtypen dieser Krankheit, DM1 und DM2. DM1 ist häufiger und hat 2 eine schwere Manifestation als DM2. Die genetische Mutation DM1 zugrunde liegt , ist eine Erweiterung der CUG Triplett - Wiederholungen in der 3' - untranslatierten Region liegt (UTR) von DM - Proteinkinase - Gen (DMPK) 3. Der CUG Wiederholungszahl in nicht betroffenen Individuen variiert von 5 bis 37. Im Gegensatz dazu erhöht sich auf mehr als 50, und manchmal bis zu Tausenden in DM1 Patienten 4. Als Ergebnis RNA-bindende Proteine, wie muscle-like 1 (MBNL1), CUGBP und Elav-like Familie 1 (Celf1) falsch reguliert sind. Aufgrund der Sequestrierung auf den CUG repeats erweitert, verliert seine Fähigkeit MBNL1 5 alternatives Spleißen zu regulieren. Celf1, andererseits wird 6,7 hochreguliert. Die Überexpression von Celf1 mit Muskelverlust verbundenund Schwäche, die zum Verlust nicht von MBNL1 Funktion zugeschrieben werden. Tiermodelle DM1 bedingte Veränderungen Simulieren, einschließlich DMPK 3'-UTR CUG Expansion, Verlust von MBNL1 und Überexpression von Celf1, festgelegt wurden. Allerdings bietet die Modellierung DM1 in Myoblasten eine effiziente Alternative, vor allem für Sezieren DM1 bezogenen zellulären und molekularen Ereignisse.

C2C12 Myoblasten - Zelllinie wurde zum ersten Mal von verletzten C3H Maus Muskel isoliert und weit verbreitete Muskeldifferenzierung 8,9 zu studieren. C2C12 Zellen vermehren sich rasch in fötalem Rinderserum (FBS) Medien -haltigen und leicht Differenzierung durchmachen, wenn FBS erschöpft ist. Doch dieses Myoblastendifferenzierung Modell stellt zwei Herausforderungen: C2C12-Zellen sind oft resistent gegen Gen-Transfektion / Virusübertragung; und leichte Variationen in die Handhabung von Zellen und Differenzierungsverfahren kann zu deutlichen Veränderungen in Myotube Bildung führen.

Unser Labor routinemäßig verwendet C2C12 Myoblasten als acell - Modell und hat Protokolle entwickelt , die effektiv Gene durch Plasmidtransfektion 10, retrovirale Transduktion und lentivirale Transduktion in C2C12 - Zelllinie zu liefern. Im Video zeigen wir die optimierte Verfahren für die Transfektion / Transduktion C2C12-Zellen und die Differenzierung Konsistenz beibehalten in Modellen DM1 Myoblasten zu etablieren.

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Protocol

1. C2C12 Zellkultur

  1. Pflegen C2C12-Maus-Myoblasten in einer 100 mm-Platte in Wachstumsmedium (Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin. Lassen Sie C2C12 agierten Zellen etwa 50 werden - 60% konfluent.
  2. Verwerfen das Wachstumsmedium und wasche C2C12 Zellen mit 3 ml Raumtemperatur phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS und fügen 500 ul 0,25% Trypsin-EDTA die Zellen zu lösen. Die Platte wird in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator 3 - 5 min.
  3. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 3 ml Wachstumsmedium. Pipette 6 - 8 mal um die Zellen zu suspendieren. 1 ml suspendierter Zellen zu einer neuen 100 - mm - Platte und inkubiere bei 37 ° C, 5% CO 2.

2. C2C12 Zelltransfektion / Transduktion und Selektion

  1. C2C12 Plasmidtransfektion
    1. 24 Stunden vor der Transfektion, pspäten 7,0 x 10 5 C2C12 Zellen in eine Vertiefung einer Sechs-Well - Platte für jede Transfektion.
      Anmerkung: Dies führt zu einer 50 bis 60% Konfluenz durch den Zeitpunkt der Transfektion.
    2. Lassen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch zu kommen.
    3. In 2 ug Plasmid-DNA (GFP-CUG5 oder GFP-CUG200) in 200 & mgr; l vorgewärmten serumfreien Medium und Wirbel kurz. In 6 ul Transfektionsreagenz auf das Medium und mischen sofort für 30 Sekunden einen Wirbel verwenden. Inkubieren der Mischung für 30 min bei Raumtemperatur.
    4. Ändern Sie die Medien von C2C12-Zellen zu 2,5 ml Serum-freien Wachstumsmedium. Fügen Sie das Transfektionsgemisch zu den Zellen nach der Inkubation. Rück die Platten zu einer 5% CO 2, 37 ° C Inkubator.
    5. Halten Sie die Zellen in Transfektionsgemischs / Serum-freien Wachstumsmedium für 4 Stunden oder bis über Nacht. Ändern Medien zurück zu den Wachstumsmedien am nächsten Tag oder wenn Zytotoxizität ist offensichtlich.
      Hinweis: Die Zytotoxizität wird beurteilt durch mikroskopische Untersuchung des cells. Beachten Sie die Veränderungen der Zellmorphologie und Zellablösung. Solange es keine offene Zytotoxizität ist, Inkubation über Nacht in serumfreiem Wachstumsmedium erhöht die Transfektionseffizienz.
    6. Markieren Sie die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion durch Zugabe von 1,2 bis 1,6 mg / ml G418 für ~ 10 Tage, bis die Kontrollkultur (ohne die Plasmide transfiziert) keine lebenden Zellen haben. Ändern Sie die Medien alle zwei Tage mit Wachstumsmedien mit G418 ergänzt.
    7. Pflegen die G418 - resistenten Zellen in Wachstumsmedium und 5% CO 2 bei 37 ° C für nachfolgende Experimente.
  2. Retrovirus Vorbereitung und C2C12 retrovirale Transduktion
    1. Bereiten HEK 293 Kulturmedium durch DMEM mit hohem Glucose mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin.
      1. Etwa 24 Stunden nach der Transfektion vor, Platte 4,0 x 10 6 ekotropischen HEK 293-basierte Verpackungszellen in einer 100 - mm - Platte (80% Zusammenfluß bei Transfektion) containing Zellkulturmedium.
    2. Lassen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch zu kommen.
    3. Mischen Sie 15 ug Plasmid-DNA (pMSCV-Puro oder pMSCV-Celf1Flag-Puro) in 1 ml Serum-freien Wachstumsmedium. Vortex kurz. In 30 ul Transfektionsreagenz aus Schritt 2.2.2 in die DNA / Serum-freien Wachstumsmedium Rohr und gut mischen Wirbel verwenden. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min.
    4. In Transfektionsgemisch tropfenweise zu den ekotropischen HEK 293-basierte Verpackungszellen. Vorsichtig die Platten wirbeln und sie zurück in die 5% CO 2, 37 ° C Inkubator zurück. Nach 24 Stunden ändern, um die Medien zu 10 ml frischem Wachstumsmedium vorgewärmten.
    5. Ernten Sie den Überstand (mit Retrovirus) 48 Stunden nach der Transfektion mit einer Pipette und den Überstand in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit. 10 ml neue warme Medien auf die Platte und wieder in den Inkubator. Halten der Überstand bei 4 ° C.
      Hinweis: Das Medium wird hinzugefügt sanft bis ter Seite des Bohrloches, um nicht die Zellschicht zu stören.
    6. Ernten Sie die zweite Charge von Überstand 60 Stunden nach der Transfektion und bündeln es mit dem Überstand von 2.2.5. Zentrifuge bei 500 × g, 4 ° C für 7 min Zelldebris zu entfernen.
    7. Den Überstand in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen. Verwenden Retro C2C12-Zellen an diesem Punkt zu transduzieren durch Vorgehen 2.2.9 oder aliquoten zu Schritt und speichern Sie den Überstand bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung.
    8. Auftauen Retrovirus aus 2.2.7 bei Raumtemperatur, wenn ein gefrorener Lager hier verwendet wird.
      Hinweis: Vermeiden Sie mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen.
    9. Platte C2C12-Zellen am Tag der Transduktion 30 Ziel - 40% Konfluenz.
      1. Entsorgen Sie das Wachstumsmedium und waschen C2C12-Zellen mit 3 ml Raumtemperatur PBS. Entfernen Sie die PBS, 500 & mgr; l 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation der Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator 3 - 5 min.
      2. Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 3 ml Wachstums medium. Pipette 6 - 8 mal um die Zellen zu suspendieren. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und fügen 8,0 x 10 5 C2C12 - Zellen auf eine 60 - mm - Platte.
    10. 0,5 ml Retrovirus ein 60-mm-Platte von Zellen in 3 ml Wachstumsmedium zu infizieren. Bringen Sie die Platte in den Inkubator.
    11. Ersetzen durch 3 ml frisches Medium mit Selektionsantibiotikum ergänzt (Puromycin 1-3 ug / ml) 48 Stunden nach der Infektion. Ersetzen 3 ml Medium mit Antibiotikum jeden Tag für ~ 5 Tage, bis die untransduzierten C2C12 Kontrollkultur stirbt aus.
  3. Lentiviren Vorbereitung und C2C12 lentivirale Transduktion
    Hinweis: Führen Sie alle Lentiviren bezogene Verfahren in Biosafety Level 2 Schrank und biologische Sicherheitsrichtlinien befolgen. Flüssige Abfälle, das Virus enthalten, müssen vor der Entsorgung desinfiziert werden.
    1. Platte 4.0 x 10 6 293T - Zellen in einer 100 mm Platte (~ 80% Konfluenz am Tag der Transfektion) mit HEK 293 - Zellkulturmedium (DMEM high Glucose, ergänzt mit 10% fötalemRinderserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) 24 h vor der Transfektion.
    2. Wärmen Sie das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur. Mischen Sie die lentivirale Verpackungsvektoren (4 ug pMD2.G und 6 ug psPAX2) zusammen mit 8 ug lentiviralen Transfervektor (Celf1 shRNA oder verschlüsselt Kontrolle shRNA) in 1 ml Serum-freiem Zellkulturmedium. Vortex kurz.
    3. In 36 ul vorgewärmte Transfektionsreagenz an die DNA / DMEM Rohr und gut mischen durch Wirbel. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 min.
    4. Entfernen Sie die 293T-Zellen aus dem Inkubator und zu der Platte die Transfektionsgemischs. Die Platte vorsichtig wirbeln und es Inkubator zurück zu 5% zurückkehren CO 2, 37 ° C. Nach 24 Stunden, ersetzen Sie das Transfektionsgemisch mit 10 ml frischem Kulturmedium.
    5. Die überstehende Flüssigkeit enthält Lentiviren 48 Stunden nach der Transfektion und gibt sie in eine 50 ml Zentrifugenröhrchen. 10 ml neue warme Medien auf die Platte und senden Sie esInkubator. Lagern Sie den Überstand bei 4 ° C.
    6. Sammeln Sie die zweite Charge von Überstand 60 Stunden nach der Transfektion und kombinieren es mit dem Überstand von 2.3.5. Zentrifuge kurz bei 500 · g, 4 ° C für 7 min.
    7. Den Überstand in ein frisches 50 ml Zentrifugenröhrchen. Wenn frische Virus verwenden, fahren 2.3.9 zu treten. Für eine zukünftige Verwendung, Speicherung virushaltigen Überstand bei -20 ° C in Aliquots von 10 ml.
    8. Auftauen das Virus aus 2.3.7 bei Raumtemperatur vor der Verwendung, wenn ein gefrorener Vorrat verwendet wird.
      Hinweis: Vermeiden Sie mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen.
    9. Platte C2C12-CUG200 Zellen (erhalten in Abschnitt 2.1), wie in 2.2.9 am gleichen Tag der Transduktion beschrieben.
      Hinweis: Ziel für 30 - 40% der Einmündung.
    10. 0,5 ml Virus eine 60-mm-Platte von C2C12-CUG200 zu infizieren und die Platte in den Inkubator zurück.
    11. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium mit der Auswahl Antibiotikum ergänzt (Puromycin 1-3 ug / ml) 72 Stunden nach der Transduktion.Aktualisieren Kulturmedien jeden Tag mit dem Selektionsantibiotikum für ~ 5 Tage, bis alle untransduzierten C2C12-CUG200 Kontrollkultur stirbt aus.
    12. Verwenden Western-Blot-Celf1 Knockdown in GFP-CUG200 transfizierten Zellen zu überprüfen.

3. C2C12 Zelldifferenzierung

  1. Platte 2 x 10 6 Zellen in einer Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen in 2,5 ml Wachstumsmedium 24 h vor der Initiierung der Differenzierung.
    Hinweis: Die Beschichtungsdichte eingestellt werden kann, so dass eine vollständige Konfluenz in 24 h erreicht ist.
    1. Spülen konfluenten Zellen mit PBS und fügen Sie 2,5 ml serumarmen Differenzierungsmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 2% Pferdeserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 1 uM Insulin) . Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage.
      Hinweis: Bewahren Sie Lager Insulin gefroren und fügen Sie es bei jedem Mediumwechsel zu den Medien.
  2. Während C2C12 Differenzierung, sammeln Proben für Quantitative RT-PCR in den folgenden Zeitpunkten (siehe Abschnitt 4): Tag0, 1, 2, 4 und 6. Verfahren die Kultur für Tag bei immunostaining 6 - 8 (siehe Abschnitt 5).

4. RNA Isolation und Quantitative RT-PCR

  1. Verwenden des Protokolls des Herstellers für die RNA-Isolierung. Nach der Isolierung resuspendieren RNA-Pellet in 30 ul RNase-freies Wasser und pipettieren nach oben und unten mehrmals.
    Hinweis: Die Proben Quantitative RT-PCR erfolgen kann oder kann bei -80 ° C gelagert werden.
  2. Verwenden Sie einen RT - qPCR - Kit für die quantitative RT-PCR 10 und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie die Reaktionsmischung gemäß Tabelle 1.
Komponente Volumen (ul) Endkonzentration
2x Reaktionspuffer 10 1x
Vorwärtsprimer 0,5 200 nM
Reverse-Primer 0,5 200 nM
Sonde 0,5 200 nM
Reverse Transkriptase und RNase Inhibitor 0,1 0,25 U / ml
Vorlage 1 100 ng Gesamt-RNA
RNase freies Wasser 7.4 N / A
insgesamt Mix 20

Tabelle 1 : Quantitative RT-PCR Master Mix Herstellungs

  1. Führen Sie einen 20 & mgr; l RT-qPCR - Reaktion unter Verwendung thermischen Profils Tabelle 2.
Reverse Transkriptionsschritt 30 min, 48 ° C
DNA-Polymerase Aktivierung / Reverse-Transkriptase-Inaktivierung 10 min, 95 ° C
40 Zyklen 15 sec, 95 ° C
1 min, 60 ° C

Tabelle 2. Quantitative RT-PCR - Thermoprofil

5. Immunostaining

  1. Befestigen Sie die Monolayer-Kultur in 2,5 ml frisch 4% Paraformaldehyd / PBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten vorbereitet.
  2. Permeabilisieren die Proben in 2,5 ml 0,1% Triton X-100 / PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
  3. Übertragen Sie die Proben auf einer feuchten Kammer. Blockieren die Proben in 2,5 ml Blockierungspuffer (0,1% nichtionisches Tensid / PBS, 10% normales Ziegenserum) für 30 min bei 37 ° C.
  4. Verwerfen Blockierungspuffer und anzuwenden 800 ul primärem Antikörper gegen Myosin schwere Kette in Blockierungspuffer verdünnt (1: 100). Inkubieren in einer befeuchteten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur.
  5. Waschen Sie die Platte 3 times (jeweils 10 Minuten) mit 2,5 ml Waschpuffer (0,1% Polysorbat 20 / PBS) am 2. Tag.
  6. Entfernen der Waschpuffer und 800 ul gelten Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus-IgG, 1: 500 in PBS verdünnt). Inkubieren in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 1 Std.
  7. Waschen zweimal (jeweils 10 Minuten) mit 2,5 ml Waschpuffer.
  8. Inkubieren mit 800 & mgr; l DAPI (1 ug / ml, in destilliertem deionisiertem H 2 O verdünnt) für 5 min.
  9. Waschen mit 2,5 ml Waschpuffer wieder für 10 min.
  10. Ändern Sie den Waschpuffer auf 2,5 ml PBS und mit einem Fluoreszenz-Mikroskop Bilder zu erfassen.

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Representative Results

C2C12-Zellen wurden mit GFP-CUG5 oder GFP-CUG200 transfiziert. Nach Medikamentenresistenz Selektion wurden stabile Pools hergestellt, das durch die GFP - Expression (Abbildung 1A) sichtbar gemacht werden kann. Myotube Bildung in den differenzierten Myoblasten wurde von Myosin schwere Kette Immunofärbung 10 (1B) detektiert. Die Quantifizierung der Myotube Bildung zeigte , dass Fusions Indizes von 35,4 ± 4,1% auf 2,6 ± 1,1% und Myotube Bereiche wurden von 35,6 ± 2,2% auf 2,7 ± 0,8% durch abnorme CUG Expansion in GFP-CUG200 (1C) verringerte sich verringert wurden. Das Fusionsindex und die Myotuben Bereich wurden über die Gesamtzahl der Kerne in Myotuben (≥ 2 Kerne), dividiert durch die Gesamtzahl der Kerne und der Prozentsatz der gesamten Bildfläche von Myotuben bzw. abgedeckt gezählt. Echtzeit - RT-PCR wurde durchgeführt , 10 - Expression für eine Anzahl von Muskeln zu analysieren verschiedeneiation verwandte Gene einschließlich MyoD, MYOG, Mef2c und Celf1. Im Vergleich zu CUG5 Kulturen erhöhte CUG200 die Expression von mRNA Celf1 in Myoblasten zu Beginn der Differenzierung proliferierenden. Deckungsgleich mit früheren Berichten wurde Celf1 upregulation mit GBG-Expansion in myogenic Dystrophie 1 (1D) zugeordnet ist . Ferner wurde Western - Blot - 10 zeigte durchweg Celf1 Proteinebene (Abbildung 1E) erhöht, und CUG200 die Expression von MyoD, MYOG und Mef2c während der Differenzierung (Abbildung 1D) gehemmt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die GBG-Erweiterung führt Defekte und die Beeinträchtigung der Myoblastendifferenzierung zu Myotube.

Um die Rolle von Celf1 in Myoblasten Differenzierung Studie wurde pMSCV- Celf1Flag retroviraler Vektor konstruiert C2C12 - Zellen zu transduzieren. 10 Puromycin-resistente Klone Differenzierungsstudien wurden gepoolt. Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass die Flag-tagged Celf1 war nur in den pMSCV-Celf1Flag transduzierten Kulturen und die Expression des Proteins wurde Celf1 aufreguliert (2A). Die Bildung von Myotuben in Zellen Celf1-überexprimierenden ist selten , wenn zu den Kontrollkulturen (2B) verglichen, was darauf hindeutet , dass die Überexpression von Celf1 stark Myoblasten Differenzierung beeinträchtigt.

Um festzustellen, ob Celf1 Knockdown die Differenzierung Mangel in GBG-Expansion Zellen rettet, wurde Celf1 shRNA GFP-CUG200 Zellen von lentiviralen Vektoren geliefert. Doppel-resistente Klone (G418 und Puromycin) wurden für die Differenzierung Studien ausgewählt und vereinigt. Die Höhe der endogenen Celf1 Protein wurde in Gegenwart von Celf1 shRNA (3A) deutlich reduziert. Nach 6 Tagen Differenzierung, war die Wirkung von Celf1 shRNA auf Myotube Bildung zunehmenden evident (3B). Fusion Indizes und Myotube sindso waren 16,1 ± 3,0% und 15,2 ± 1,2% betragen, im Vergleich zu 4,6 ± 0,8% und 5,1 ± 1,3% in Kontrollkulturen (3C). Inzwischen deuten darauf hin , real-time RT-PCR - Ergebnisse , dass die Expression von MyoD, MYOG und Mef2c deutlich in Celf1 shRNA - Zellen erhöht wurde (Abbildung 3D) Unterstützung Celf1 Knockdown myocyte Differenzierung Mangel gerettet.

Abbildung 1
Abbildung 1. CUG-Expansion Hemmt Muskelzellen Differenzierung in C2C12 - Zellen. (A) C2C12 - Zellen exprimiert GFP-CUG5 oder GFP-CUG200 ubiquitär nach der Auswahl. Maßstabsbalken sind 100 & mgr; m. Diese Zahl wurde aus unserem vorherigen Papier geändert . 10 (B) Myotuben wurden in GFP-CUG5 Zellen gebildet , aber weniger in GFP-CUG200 Zellen. Myotuben wurden von Myosin schwere Kette (MF-20) Immunfärbung sichtbar gemacht. Maßstabsbalken sind 100 & mgr; m. (C) (D) Echtzeit - RT-PCR - Analyse von Celf1, Transkriptionsfaktoren MyoD, MYOG und Mef2c Expression während der Differenzierung der Myoblasten. mRNA-Spiegel wurden nach dem GAPDH normalisiert aufgetragen. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen. Student-T-Test wurde durchgeführt, um die Tests zu Kontrollen zu vergleichen. n> 3, * P <0,05. (E) GFP-CUG200 Transfektion erhöhte Celf1 Proteinexpression. ß-Aktin als Ladekontrolle gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Die Überexpression von Celf1 Beeinträchtigt Myoblastendifferenzierung. (A) Der Nachweis von exogenen Celf1Flag expression in C2C12 - Zellen durch Western - Blot. (B) Myotube Bildung wurde in Celf1Flag-überexprimierenden C2C12 Myoblasten beeinträchtigt. Myotuben wurden von MF-20-Immunfärbung sichtbar gemacht. Maßstabsbalken sind 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Sturz von Celf1 Teil Rettungen CUG-Expansion-Induced Myoblastendifferenzierung Mangel. (A) Nachweis der Celf1 Knockdown durch Western - Blot. (B) Celf1 shRNA induziert Myotube Bildung in GFP-CUG200 Myoblasten. Myotuben wurden von MF-20-Immunfärbung sichtbar gemacht. Maßstabsbalken sind 100 & mgr; m. (C) Celf1 shRNA-geretteten Zellen , die Fusion - Index und Myotube Bereiche erhöht hatte. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen. (D) Echtzeit - RT-PCR - Analyse von Celf1, Transkriptionsfaktoren MyoD, MYOG und Mef2c Expression während der Differenzierung. mRNA-Ebene wurde aufgetragen, nachdem der von GAPDH normalisiert. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen. Student-T-Test wurde durchgeführt, um die Tests zu Kontrolle zu vergleichen. n> 3, * P <0.05. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

C2C12 - Zelllinie wurde als Modell verwendet worden myogenesis 11-14 zu studieren. Diese Zellen behalten einen Fibroblasten-ähnliche Aussehen, proliferieren schnell in den Medien 20% fötales Rinderserum enthält , und unterscheiden sich leicht in Medien mit 2% Pferdeserum 15. Das schnelle Wachstum und die Differenzierung sind vorteilhafte Eigenschaften in einem myogenesis Zellmodell. Hier zeigen wir die Verwendung des Plasmids, retroviralen und lentiviralen Vektoren einzuführen cDNA, 3'-UTR und shRNA in C2C12-Zellen. Die kritischen Punkte für die Transfektion / Transduktion und Wartung der Konsistenz bei der Differenzierung sind unten hervorgehoben.

Die Zelldichte in der täglichen Zell Wartung entscheidend. Diese Zellen müssen unter 50 kultiviert werden - 70% Konfluenz. Aufgrund der kurzen Verdopplungszeit unterscheidet hohe Einmündung (> 70%) C2C12 Kultur spontan, wenn über Nacht stehen gelassen. Während der Anteil des spontan differenzierten Zellen klein sein kann, die Anwesenheitvon differenzierten Zellen werden zu Inkonsistenzen in den nachfolgenden Differenzierungsexperimente beitragen. Zusätzlich frisch C2C12 Zellen aufgetaut, die niedrige Passage-Nummer haben, werden bevorzugt. Zur Unterscheidung werden die Zellen in vorher festgelegten Zahlen überzogen, so dass sie voll Einmündung nach 24 Stunden erreichen. Insulin wird in kleinen Portionen eingefroren gehalten und wird jedes Mal, wenn der Differenzierungsmedium zugegeben wird, verändert. Diese Maßnahmen verbessern die Differenzierung Ergebnisse.

Serum freies Medium verbessert C2C12 Transfektion von Zellen. Die Zellen können über Nacht in Transfektionsgemischs / Serum-freien Medien inkubiert werden. In unserem Labor erreichen wir bis zu 20% Transfektionsrate auf, durch leichte Anzeichen von Zytotoxizität begleitet. Die Konzentration des Arzneimittels verwendet C2C12 Zelle auszuwählen höher ist, 1,2 bis 1,6 mg / ml G418 oder 1 bis 3 & mgr; g / ml Puromycin, und die Dauer der Auswahl ist länger als die meisten anderen Zelllinien. Aufgrund der potentiellen Toxizität bei hohen Wirkstoffkonzentration und dem verlängerten Inkubationsperiode lot-to-lotVariation in Differenzierungspotential entstehen können. Es ist entscheidend, um die Auswahlschema (Konzentration und Dauer), basierend auf Zelle Erscheinungsbild anzupassen und die Test- und Kontrollgruppen zusammen zu behandeln.

Wir haben erfolgreich GFP-CUG200 in C2C12-Zellen eingeführt, die 3'-UTR CUG Expansion in DM1 reproduzieren. Einführen Celf1 in C2C12-Zellen und Celf1 shRNA in GFP-CUG200 C2C12 Zellen hat die Bewertung der zellulären und molekularen Ereignisse, ausgelöst durch Celf1 upregulation und Exploration von Targeting Celf1 DM1 Myoblasten zu helfen Differenzierung erlaubt, respectively. Zusammenfassend stellte der C2C12 Myoblasten Modell hier profitiert die Untersuchung von Muskeldystrophie sowie allgemeine Muskel Zellbiologie und Muskeldifferenzierung. Die Begrenzung dieses Modells ist, dass die Ergebnisse in Zelllinien können nicht vollständig auf Organismen verlängern. Die Ergebnisse in den aktuellen Modellen sind fortgeschritten oft an die frische Myoblasten von Tieren zu isolieren und das Studium ihrer differentiation. Letztlich untermauern wir Myoblasten Erkenntnisse in Organismen.

Die einzigartige Stärke dieser Studie ist die Multi-Tier-Genmanipulation in C2C12 Myoblasten, die die aufeinanderfolgenden genetischen / pathologischen Ereignisse in DM1 ermöglicht die Modellierung. Bisher wurde die RNA Toxizitätswirkung DMPK CUG Expansion in Myoblasten dokumentiert 11-14, während die pathologische Rollen Celf1 separat in Mausmodellen 16,17 wurden untersucht. diese sequentielle genetischen / pathologischen Ereignisse Modellierung ist technisch anspruchsvoll und zeitraubend, wenn in Tiermodellen durchgeführt. Wie in dieser Studie gezeigt, ermöglicht die kombinierte Verwendung von Fluoreszenz- und arzneimittelresistente Marker die Modellierung von zusätzlichen molekularen Ereignisse in myotonische Dystrophie. Die Modelle in dieser Studie festgestellt wäre nützlich, in die detaillierten Mechanismen in DM1 Pathogenese sezieren. Sie würden auch wertvoll sein für Drogen in Screening, die verschiedene Schritte der DM1 Pathogenese Ziel. Die Strategien und Verfahren dafürStudie beleuchten können andere Muskelkrankheit Modelle in Myoblasten auf etablieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose Life Technologies 11965-084 for culture medium
Fetal Bovine Serum - Premium Atlanta Biologicals S11150 for culture medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) Life Technologies 10378-016 for culture medium
Insulin from bovine pancreas Sigma Aldrich I6634-100MG for differentiation medium
equine serum Atlanta Biologicals S12150 for differentiation medium
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311  for transfection
G418 sulfate  Gold Biotechnology  G-418-10 for drug resistant selection
Puromycin dihydrochloride Sigma Aldrich sc-108071 for drug resistant selection
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well Life Technologies NP0323BOX for western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Life Technologies NP00061 for western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Life Technologies NP0002 for western blot
Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m GE healthcare life science 10600015 for western blot
MF 20 Developmental Hybridoma Bank MF 20 primary Ab for immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate Thermo Fisher Scientific T-862 secondary Ab for immunostaining
One step qRT-PCR MasterMix AnaSpec 05-QPRT-032X for qRT-PCR
TriPure Isolation Reagent Roche 11667165001 for RNA isolation
CUG-BP1 Antibody (3B1) santa cruz sc-20003 primary Ab western blot
Actin Antibody santa cruz sc-1615 goat polyclonal IgG for loading control
293T Ecopack Clontech 631507 cells for retrovirus preparation
pMSCV-puro Clontech 634401 empty retroviral vector for retrovirus preparation
pMSCV-Celf1Flag-puro house-constructed not available retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation
psPAX2 gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
pMD2.G gift from Didier Trono not available for lentivirus preparation
GFP-CUG5 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
GFP- CUG200 gift from M.S. Mahadevan not available details in reference 10 
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 for immunostaining
paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 for immunostaining
TWEEN 20 Sigma Aldrich P9416 for immunostaining
DAPI Sigma Aldrich D9542 for immunostaining

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References

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