RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

Biology

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Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J. W., Roychowdhury, S. Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations. J. Vis. Exp. (114), e54090, doi:10.3791/54090 (2016).

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Abstract

RNA 서열 (RNAseq)는 유전자 발현 돌연변이 유전자 융합체, 및 비 암호화 RNA를 검출하고 특성화하는 데에 이용 될 수있는 다목적 방법이다. 1 억 순서 읽고 등의 mRNA 및 비 암호화 RNA를 여러 RNA 제품을 포함 할 수있다 - 표준 RNAseq (30)가 필요합니다. 우리는 타겟 RNAseq (캡처) 바탕 화면 시퀀서를 사용하여 선택 RNA 제품에 초점을 맞춘 연구를 허용하는 방법을 보여줍니다. RNAseq 캡처 그렇지 않으면 기존의 RNAseq 방법을 사용하여 놓칠 수있다, 주석이 달려 있지 않은 저, 또는 일시적으로 표현 된 성적 증명서를 특성화 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 세포 라인, 리보솜 RNA 고갈, cDNA 합성, 바코드 라이브러리, 바탕 화면 시퀀서에 하이브리드 및 목표 성적 증명서의 캡처 및 다중 서열의 준비에서 RNA의 추출을 설명합니다. 또한 품질 관리 평가, 정렬 검출 융합 유전자 발현의 정량화 및 단일 NUC의 식별을 포함하는 연산 파이프 라인을 분석, 개요leotide 변형. 이 분석은 유전자 발현, 유전자 융합, 돌연변이의 특성을 타겟팅 사체 서열을 허용한다.

Protocol

참고 :이 프로토콜은 동시 처리 및 4 개의 샘플의 분석을 설명합니다. 이 방법은 세포에서 분리 된 RNA, 냉동 조직과 포르말린 고정 파라핀 조직 (FFPE)와 호환됩니다. 각 샘플에 대해 RNA 입력을 시작하는 1000 NG (250 권장 NG) -이 프로토콜은 50로 시작합니다.

1. rRNA의 고갈 및 RNA 절차의 분열

  1. rRNA의 고갈
    1. 실온에서 -20 ° C와 해동에서 용출, 프라임, 조각 믹스, rRNA의 제거 믹스, rRNA의 결합 버퍼와 부유 버퍼를 제거합니다. 4 ° C에서 용출 버퍼, rRNA의 제거 구슬과 RNA / cDNA를 특정 상자성 비드를 제거하고 실내 온도에 가져.
    2. PCR 튜브에 RNA의 0.25 μg의 추가. 10 μl의 총 최종 부피 클레아없는 초순수 총 RNA를 희석한다. 각 튜브에 rRNA의 결합 버퍼의 5 μl를 추가하면 부드럽게 pipett 5 rRNA의 제거 믹스의 μL 및 추가전자 위아래로 혼합합니다. 뚜껑을 열 자전거 타는 사람에 장소 튜브는 RNA를 변성 5 분 동안 68 ° C에 100 ° C 및 프로그램 열 자전거 타는 사람에 미리 가열.
    3. RNA 변성 후, 열 순환기에서 관을 제거하고 1 분 동안 실온에서 배양한다. 소용돌이 rRNA의 제거 비드 튜브는 적극적으로 구슬을 재현 탁합니다. 새로운 튜브에 rRNA의 제거 구슬의 35 μl를 추가하고 rRNA의 제거 비즈를 포함하는 튜브에 RNA의 변성 반응 (20 μl를) 전송합니다.
    4. 빨리 45 μl를 피펫에 피펫을 조정하고 20 배 아래로 혼합. 1 분 동안 실온에서 튜브를 품어. 그런 다음 1 분 동안 실온에서 자기 스탠드에 튜브를 배치합니다. 새로 라벨 PCR 튜브에 뜨는을 전송하고 1 분 동안 실온에서 자기 스탠드에 다시이 관을 배치합니다. 이은 구슬이 전송되지 않도록 보장한다. 새로 라벨 PCR 튜브에 뜨는을 전송합니다.
    5. 소용돌이 RNA / cDNA를 특정 상자성 구슬과 각 관에 구슬의 99 μl를 추가합니다. 조심스럽게 피펫 전체볼륨 상하 10 배를 혼합합니다. 성능이 저하 된-RNA로 시작하는 경우, 각각의 튜브에 잘 혼합 된 RNA / cDNA를 특정 상자성 비즈의 193 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. 그런 다음 5 분 동안 실온에서 자석 스탠드에 튜브를 놓는다. 제거하고 상층 액을 버린다.
    6. 새로 제조 된 70 % 에탄올 (EtOH로) 200 μl를 추가합니다. 자기 스탠드에 튜브를 유지하고 구슬을 방해하지 않도록주의하십시오. 다음 제거하고 상층 액을 버리고, 30 초 동안 실온에서 품어. 10 분 건조 - (5)가 튜브를 상온에서 방치한다.
    7. 원심 분리는 5 초 동안 600 × g으로 실온에서 용출 완충액을 해동. 각 튜브에 용출 버퍼의 11 μl를 추가하고 부드럽게 피펫과 10 배 아래로 혼합. 2 분 동안 실온에서 인큐베이션 튜브. 5 분 동안 실온에서 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 새로 라벨 PCR 튜브에 뜨는의 8.5 μl를 전송합니다.
  2. rRNA의 고갈 RNA의 분열
    1. 8.5 μL 엘 추가UTE, 8.5 μL 총리, 각 튜브에 8.5 μl의 조각 믹스. 부드럽게 피펫과 10 배 아래로 혼합. 8 분 후, 4 ℃로 유지 100 ° C, 94 ° C로 예열 뚜껑 : 프로그램을 다음과 열 자전거 타는 사람에 장소 튜브.
      주의 :이 단계는 155 bp의 평균 삽입 크기를 생성하도록 설계된다. RNA 샘플의 평균 조각의 크기가보다 낮은 200 bp의 경우,이 단계를 건너 뛰고 첫번째 가닥의 cDNA 합성을 진행합니다.

2. cDNA를 합성

  1. 첫 번째 가닥의 cDNA를 합성
    1. -20 ° C에서 첫번째 가닥의 합성 혼합물을 제거하고, 실온에서 해동.
    2. 사전 프로그램 다음 설정을 열 자전거 타는 사람 : 예열 뚜껑 옵션과 15 분 동안 15 분 동안 100 ° C, 10 분 후 25 ° C, 42 ° C, 70 ° C로 설정하고 4 ° C에서 개최 . 본 프로그램 저장 "를 합성 1 해변을."
    3. 600 & # 원심 분리기 해동 최초의 가닥 합성 혼합 관(215); 5 초 동안 g. 1 μL 첫번째 스트랜드 합성 믹스 9 μL로 역전사 섞는다.
    4. 첫 번째 가닥 합성의 8 μl를 추가하고 각 튜브에 효소 믹스 역, 부드럽게 피펫 아래로 혼합 6 배. 6.0 XG에서 고정 된 속도 미니 탁상 원심 분리기를 이용하여 4 초 동안 원심 분리기 튜브 바닥에 액체 가져올 수 있습니다. 열 자전거 타는 사람에 튜브를 놓고를 합성 1 스트랜드를 선택합니다. 열 자전거 타는 4 °의 C에 도달하면, 튜브를 제거하고 두 번째 가닥의 cDNA를 합성 바로 진행합니다.
  2. 두 번째 가닥의 cDNA를 합성
    1. 뚜껑 16 ° C로 예열 열 자전거 타는 사람은 30 ° C로 예열. 해동 두 번째 가닥 마스터 믹스와 얼음에 다시 정지 버퍼입니다. 사전에, 4 ° C에서 상자성 구슬의 병을 제거하고 실내 온도에 가져 적어도 30 분 동안 서 보자.
    2. 각 PCR 튜브에 재 부유 버퍼의 5 μl를 추가합니다. 600에서 원심 분리기 두 번째 가닥 마스터 믹스5 초 동안 g을 × 각 PCR 튜브에 20 μl를 추가합니다. 1 시간 동안 16 ℃에서 예열 열 자전거 타는 사람에 장소 튜브. 배양이 완료되면, 열 순환기에서 제거하고 관을 실온으로 제공 할 수있다.
    3. 소용돌이 상자성 구슬들은 잘 분산 될 때까지. 각 튜브에 잘 혼합 된 상자성 비즈의 90 μl를 추가합니다. 조심스럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 10 배는 혼합 할 수 있습니다. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션 튜브. 5 분 동안 실온에서 자석 스탠드에 놓고 튜브.
    4. 제거하고 상층 액 135 μl를 폐기 한 후 EtOH로 세척을 수행하는 자기 스탠드에 튜브를 둡니다. 구슬을 방해하지 않고 200 ㎕를 갓 각각의 튜브에 80 % EtOH로 준비를 추가, 다음 30 초 동안 실온에서 품어. 제거하고 각에서 상층 액을 모두 폐기합니다. 이 80 % EtOH로 세척의 총 반복합니다.
    5. 10 분 자기 스탠드에 건조 - (5)가 튜브는 실온에 서 보자. 해동 객실 그리고 온도를 원심 분리기5 초 동안 600 × g에서 전자 부유 버퍼입니다. 자기 스탠드에서 PCR 튜브를 제거합니다. 각 PCR 튜브에 17.5 μl를 재 부유 버퍼를 추가하고 부드럽게 잘 혼합 위아래로 10 배 전체 볼륨을 피펫. 실온에서 2 분 동안 인큐베이션 튜브.
    6. 5 분 동안 실온에서 자기 스탠드에 배치 튜브 후 0.2 ml의 PCR 스트립 튜브에 15 μl의 상층 액을 (더블 cDNA를 좌초) 전송합니다.
      주 :이 cDNA를 최대 7 일 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있는 안전한 정지 점이다.

3. 라이브러리 준비

  1. 아데 3 '끝
    1. 실온에서 -20 ° C와 해동에서 A-미행 믹스를 제거합니다. 사전 프로그램 다음 설정을 열 자전거 타는 사람 : 예열 뚜껑 옵션을 선택하고 100 ° C로 설정은 다음 5 분에서 30 분 동안 37 ° C, 70 ° C로 설정하고 4 ° C에서 개최합니다. 본 프로그램을 저장 "ATAIL70."
    2. 부유의 2.5 μl를 추가각각의 튜브에 버퍼. 그리고 해동 A-미행 믹스의 12.5 μl를 추가합니다. 조심스럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 10 배 철저하게 혼합 할 수 있습니다. 열 자전거 타는 사람에 튜브를 삽입하고 ATAIL70을 선택합니다. 열 순환기 온도는 39 ° C에있는 경우에는 열 사이 클러에서 PCR 튜브를 제거하고 어댑터 결찰 즉시 진행.
  2. 결찰 어댑터
    1. 적절한 RNA 어댑터 튜브 제거 -20 ° C에서 라이 게이션 완충액 및 재현 탁 버퍼를 멈추고 실온에서 해동. 프로토콜에서 지시 할 때까지 -20 ° C에서 결찰 믹스 튜브를 제거하지 마십시오. 4 ° C에서 상자성 구슬의 병을 제거하고 적어도 30 분 실온으로 가져 방치 할 수 있습니다.
    2. 30 ° C의 열 자전거 타는 사람을 미리 가열 예열 뚜껑 옵션을 100 ℃로 설정을 선택합니다. 원심 분리기 5 초 동안 600 × g에서 해동 RNA 어댑터 튜브. 즉시 사용하기 전에, -20 ° C에서 결찰 믹스 튜브를 제거저장.
    3. 각 샘플 튜브에 재 부유 버퍼의 2.5 μl를 추가합니다. 결찰 믹스의 2.5 μl를 추가합니다. 결찰 믹스 튜브 사용 후 즉시 -20 ° C 스토리지를 돌려줍니다. 각각의 샘플 튜브에 해동 RNA 어댑터 지수의 2.5 μl를 추가합니다. 조심스럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 10 배 철저하게 혼합 할 수 있습니다.
    4. 6.0 X g에서 고정 된 속도 미니 탁상 원심 분리기를 이용하여 4 초 동안 원심 분리기 튜브. 예열 열 자전거 타는 사람에 장소 튜브. 뚜껑을 닫고 10 분 동안 30 ° C에서 품어.
    5. 열 자전거 타는 사람에서 튜브를 제거하고 결찰을 비활성화하기 위해 각각의 튜브에 정지 내고 버퍼의 5 μl를 추가합니다. 조심스럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 10 배 철저하게 혼합 할 수 있습니다.
    6. 혼합 된 상자성 구슬의 42 μl를 사용하고 79.5 μl의 상층 액을 버리고, 2.2.4 - 2.2.3에 기술 된 바와 같이 반복 세척. 10 분 - 자기 스탠드에 튜브로, 5 상온에서 샘플 공기 건조를 할 수 있습니다.
    7. 로부터의 PCR 스트립 튜브를 제거자기 스탠드와 각 튜브에 52.5 μL의 재 부유 버퍼를 추가합니다. 조심스럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 10 배 철저하게 혼합 할 수 있습니다. 2 분 동안 실온에서 인큐베이션 튜브. 5 분 동안 또는 액체가 선명해질 때까지 실온에서 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 전송 새로운 0.2 ㎖의 PCR 용 튜브 스트립 각 튜브의 상등액을 50 μL. 구슬을 방해하지 않도록주의하십시오.
    8. 혼합 된 상자성 구슬의 50 μl를 사용하여 95 μl의 상층 액을 버리고, 2.2.4 - 2.2.3에 기술 된 바와 같이 반복 세척. 10 분 - 자기 스탠드에 튜브로, 5 RT에서 샘플 공기 건조를 할 수 있습니다.
    9. 자기 스탠드에서 PCR 스트립 튜브를 제거하고 각 튜브에 22.5 μL의 재 부유 버퍼를 추가합니다. 조심스럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 10 배 철저하게 혼합 할 수 있습니다.
    10. 2 분 동안 실온에서 인큐베이션 튜브. 5 분 동안 또는 액체가 깨끗해질 때까지 실온에서 자기 스탠드에 튜브를 놓는다. (A)에 각 튜브에서 뜨는 μl를 전송 (20)새로운 0.2 ml의 PCR 스트립 튜브. 구슬을 방해하지 않도록주의하십시오. 이것은 안전한 정류소하고 cDNA를 최대 7 일 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.

4. 도서관 증폭

  1. DNA 조각을 풍성
    1. 실온에서 -20 ° C 저장 및 해동에서 PCR 마스터 믹스, PCR 프라이머 칵테일 및 재 부유 버퍼를 제거합니다. 4 ° C 형 스토리지에서 상자성 구슬의 병을 제거하고 적어도 30 분 실온으로 가져 방치 할 수 있습니다.
    2. 사전 프로그램 다음 설정을 열 자전거 타는 사람 : 예열 뚜껑 옵션을 선택하고 100 ° C로 설정 후 10 초, 어닐링 98 ° C에서 30 초 동안 98 ° C에서 변성의 15주기를 초기 변성을 설정 30 초, 5 분, 72 ° C에서 하나의 최종 확장 사이클 및 72 ° C에서 30 초, 및 확장을위한 60 ° C에서 4 ° C에서 개최합니다. 본 프로그램 저장 "PCR을."
    3. 해동 PCR 마스터를 원심 분리기5 초 동안 600 × g에서 튜브를 혼합하고 PCR 프라이머. 각 샘플 튜브에 해동 PCR 프라이머의 5 μl를 추가합니다. 각 샘플 튜브에 해동 PCR 마스터 믹스 25 μl를 추가합니다. 조심스럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 10 배 철저하게 혼합 할 수 있습니다.
    4. 미리 프로그램 된 열 자전거 타는 사람에 출장 PCR 스트립 튜브를 놓습니다. 뚜껑을 닫고 PCR 프로그램을 실행합니다. PCR이 완료되면, 열 순환기에서 관을 제거하고 얼음에 보관.
    5. 혼합 된 상자성 구슬의 50 μl를 사용하여 95 μl의 상층 액을 버리고, 2.2.4 - 2.2.3에 기술 된 바와 같이 반복 세척. 10 분 - 자기 스탠드에 튜브로, 5 상온에서 샘플 공기 건조를 할 수 있습니다.
    6. 자기 스탠드에서 튜브를 제거하고 각 샘플 튜브에 32.5 μL의 재 부유 버퍼를 추가합니다. 조심스럽게 전체 볼륨 업을 피펫 아래로 10 배 철저하게 혼합 할 수 있습니다. 2 분 동안 실온에서 인큐베이션. 5 분 동안 또는 액체가 깨끗해질 때까지 실온에서 자기 스탠드의 PCR 튜브를 놓는다. 그런 다음 30 μL 스와 전송신선한 0.2 ml의 PCR 튜브에 pernatant.
    7. 형광 분석기 (7)를 사용하여 cDNA를 정량화를 수행하고, 모세관 전기 영동 시스템 (8)를 사용하여 cDNA의 품질을 결정합니다.
      주 :이 안전한 정류소하고 cDNA를 최대 7 일 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 참고 :이 라이브러리가 RNAseq 라이브러리로 간주됩니다.
      다음 단계는 캡처 라이브러리로 이어집니다.

5. 하이브리드, 캡처 및 시퀀싱

  1. 멀티 플렉스 하이브리드
    1. -20 ° C에서 사용자 정의 수화 프로브, 침대-1 DNA, 보편적 차단 올리고,와 어댑터 특정 차단 올리고를 제거하고 얼음에 해동.
    2. 낮은 바인딩 1.5 ML 튜브에서 500 ng를 DNA 결합 (샘플 당 125 NG를 할 때 다중 4 샘플), 5 ㎕를 침대-1 DNA (1 μg의 / μL), 1ul 보편적 차단 올리고, 0.5 μL의 P7 (6 뉴클레오티드) 특정 어댑터 올리고 블로킹 (이 양은 다중 컨디셔닝에 따라 조절해야 할 수도기능) 0.5 μL의 P7 (8 염​​기) 어댑터 특정 차단 올리고 (이 양이) 다중 조건에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.
    3. 회전의 반대 방향을 향 캡 오픈과 함께 진공 농축기에서 샘플 튜브를 놓습니다. 20 분 동안 45 ° C에서 또는 액체의 완전한 증발 될 때까지 건조 내용.
    4. 8.5 μL 배 혼성화 완충액, 3.4 ㎕의 혼성화 성분 A 및 1.1 μL 클레아없는 물과 함께 건조 된 콘텐츠를 재현 탁. 부유와 소용돌이 매 2.5 분 동안 10 분을 허용합니다. 0.2 ㎖의 PCR 용 튜브에 현탁 물질을 전송 및 열 순환기에서 10 분 동안 95 ℃에서 배양한다.
    5. 열 자전거 타는 사람에서 하이브리드 샘플 튜브를 제거하고 1.5 pmol의 / μL의 농도로 재현 탁 사용자 정의 프로브 2 μl를 추가합니다. 또한, 0.75 pmol의 / μL의 농도로 재현 탁 사용자 정의 프로브의 4 μl를 추가합니다. 65 ° C에서 - (24 시간 16) 밤새 혼​​성화 반응을 품어.
      참고 : 프로브여러 공급 업체에서 구입들 사용될 수 있으며, 제조업체의 지침에 따라야한다. 혼성화 단계의 지속 기간은 다양 할 수있다.
  2. 비드 준비 및 캡처
    1. 39 ° C에서 스트렙 타비 딘 - 결합 된 상자성 비드 병을 제거하고 실온에서 30 분 동안 평형화. 1X 작업 용액을 만드는 배 워시 버퍼 (I, II, III, 엄격한) 및 2.5 비드 세척 완충제를 희석.
    2. 나누어지는 I 신선한 1.5 ML 튜브에에 1X 세척 버퍼 140 μL. 적어도 2 시간 동안 가열 블록 열 전체 1X 엄격한 버퍼 크기, 65 ° C에서 1X 세척 완충액 I의 분취.
    3. 나누어지는 1.5 ML 튜브로 캡처 당 스트렙 타비 딘 결합 상자성 비드 100 ㎕. 자석에 배치하고 상층 액을 버린다. 10 초 동안 200 μl의 비드 세척 100 μl의 구슬 당 버퍼와 소용돌이를 추가합니다. 5 분 또는 상층 액이 깨끗해질 때까지 - 2 자석에 놓습니다. 뜨는 분명되면, 그것을 버리고 다시이 세척의 총 한 번 더 이탄.
    4. 비드 세척 완충액의 제거 후, 초기 시작 볼륨으로 동일 부피의 비드 세척 완충액을 추가 (즉, 하나의 캡쳐 100 μL). 재현 탁하고, 0.2 ml의 PCR 튜브로 전송. 5 분 또는 상층 액이 깨끗해질 때까지 - 2 자기 랙에 튜브를 놓습니다. 폐기 뜨는.
    5. 65 ° C의 열 순환기에 혼성화 샘플 비드 모두 비드 튜브 피펫 최대 혼성화 믹스를 전송하고 다운 10 배 섞어. 45 분, 소용돌이 65 ° C에서 품어 고정 된 속도 (6.0 XG) 테이블 탑 미니 원심 분리기를 이용하여 4 초 동안 샘플을 스핀 다운.
  3. 구슬 워시
    1. 열 자전거 타는 사람에서 캡처 튜브를 제거하고 난 혼합 10 초 동안 튜브와 소용돌이에 100 ㎕의 예열 1X 세척 버퍼를 추가 할 수 있습니다. 신선한 낮은 바인딩 1.5 ML 튜브로 혼합물을 전송합니다. 자기 분리 랙에 튜브를 삽입하고이 가능 - 분리 또는 상층 액이 깨끗해질 때까지 5 분. 디iscard 상층 액.
    2. 200 ㎕의 예열 1 배 엄격한 세척 버퍼를 추가하고 혼합 아래로 10 회를 피펫합니다. 5 분 동안 65 ° C에서 품어. 자기 분리 랙에 튜브를 삽입하고이 가능 - 분리 또는 상층 액이 깨끗해질 때까지 3 분. 폐기 뜨는. 이 세척의 총 한 번 더 엄격한 세척을 반복합니다.
    3. 200 ㎕의 실내 온도 1 배는 I와 소용돌이 2 분 믹스하기위한 버퍼를 씻어 추가합니다. 자기 분리 랙에 튜브를 삽입하고이 가능 - 상층 액을 분리 또는 때까지 5 분은 분명하다. 폐기 뜨는.
    4. 200 ㎕의 실내 온도 1 배를 혼합하는 1 분 동안 버퍼 II와 소용돌이를 씻어 추가합니다. 자기 분리 랙에 튜브를 삽입하고이 가능 - 상층 액을 분리 또는 때까지 5 분은 분명하다. 폐기 뜨는.
    5. 추가 200 μl의 실내 온도 1 배는 혼합 30 초 동안 버퍼 III와 소용돌이를 씻는다. 분리 또는 상층 액까지 5 분 - 2를 허용하는 자기 분리 랙에 튜브를 배치분명하다. 폐기 뜨는.
    6. 자기 분리 랙에서 튜브를 제거하고 구슬을 재현 탁 20 μl를 클레아없는 물을 추가합니다. 최대 피펫 팅에 의해 10 배 아래로 철저하게 섞는다.
  4. 포스트 캡처 PCR 증폭
    1. 39 ° C에서 상자성 비드를 제거하고 실온에서 30 분 동안 평형화.
    2. RT에서 -20 ° C와 해동에서 핫 스타트 PCR 준비 믹스 (2 배) 및 PCR 프라이머 믹스를 제거하고 얼음에 배치합니다. (이러한 볼륨 1 하이브리드 라이브러리 플러스 10 %를 초과위한) PCR 프라이머 1의 2.75 μL 및 PCR 프라이머 2의 2.75 μL와 배 핫 스타트 PCR 준비 믹스의 27.5 μl를 결합하여 도서관 증폭 마스터 믹스를 준비합니다.
    3. 설치 비드 20 ㎕를 50 ㎕의 플러스의 총 부피에 대한 증폭 라이브러리 마스터 믹스를 30 μL로 캡처 DNA를 첨가하여 PCR 튜브에서 반응. 캡 튜브 제대로 와류 믹스합니다. 고정 된 속도 미니 탭을 사용하여 4 초 동안 원심 분리기 튜브6.0 × g으로 제작 탑 원심 분리기.
      1. 다음 PCR 프로그램을 설정합니다 : - 65에서 15 초, 어닐링 98 ℃에서 변성의 12주기 예열 뚜껑 옵션을 선택하고 100 ° C로 설정 한 다음 45 초, 10 98 ° C에서 초기 변성을 설정 60 초 동안 72 ° C에서 30 초 및 확장 한 최종 연장 60 초 동안 72 ° C에서 사이클, 4 ° C에서 개최 ° C.
    4. 열 순환기에서 샘플을 제거하고 75 μl의 상자성 구슬을 추가합니다. 잘 혼합하고 15 분 동안 실온에서 품어.
    5. 2 실온에서 자석에 튜브를 배치 - 3 분 후 상층 액을 제거합니다. 30 초 후 상층 액을 제거하기위한 배양, 200 μL 80 % 에탄올을 첨가하여 자석에 구슬을 씻으십시오. 이 80 %의 세척의 총 반복합니다.
    6. 10 분 구슬 건조 할 수 있도록 - 5 RT에서 품어. 끝나지 건조 균열 마십시오. 를 Resuspend 구슬 트리스 - EDTA pH가 8.0 (1X TE 솔루션) 22 μL 및 용출 3 분을 할 수 있습니다. 5 분 일 - 3 자석에 샘플을 배치이전에는 구슬을 보장하지 않는 신선한 낮은 바인딩 1.5 ML 튜브에 용출 된 제품의 20 μL, 욕실 이월된다.
    7. 형광 7을 사용하여 캡처 된 cDNA의 정량화를 수행하고, 모세관 전기 영동 시스템 (8)를 사용하여 캡처 된 cDNA의 품질을 결정한다.
  5. 바탕 화면 시퀀서로드 절차 (9)
    1. 얼음 0.1 % 트윈 20 녹여 10 N NaOH를 혼성화 완충액 10 mM 트리스-CL의 pH 8.5을 사용하여 4 nM의 최종 농도 캡처 cDNA 라이브러리를 희석. RT 물 데스크톱 시퀀서 V2 시약 키트 상자 (1) 해동 사용하기 전에 약 30 분. 최대 적재 선 (10) 위에 기입하지 마십시오. 이것은 시퀀싱 플랫폼 특정 절차와 제조업체의 지침에 따라 다를 수 있습니다.
    2. 미세 원심 관 (항상 신선한 준비)에 980 ㎕의 뉴 클레아 무료 물을 20 μl를 10 N의 NaOH를 결합하여 0.2 N NaOH를 1 ㎖를 준비합니다. 4 nm의에 의해 PhiX 라이브러리 (라이브러리 제어) 희석0.1 % 트윈 20로 3 ㎕를 10mM이 CL 트리스 pH를 8.5으로 10 나노 라이브러리 제어 2㎕의 조합.
    3. 혼합 짧게 5 0.2 N NaOH를 μL와 소용돌이와 4 ㎚ 라이브러리의 5 μl를 결합하여 최종 라이브러리 및 라이브러리 제어 변성. 6.0 X g에서 고정 된 속도 미니 테이블 탑 원심 분리기를 이용하여 4 초 동안 원심 분리기 튜브. 5 분 라이브러리를 변성하기 위해 RT 부화.
    4. 변성 라이브러리의 10 μl를 포함하는 튜브에 미리 냉장 하이브리드 버퍼의 990 μl를 추가합니다. 이것은 20 오후 라이브러리가 발생합니다. 마크 날짜와 변성 20 오후 도서관과는 -20 ° C에서 최대 3 주 동안 저장 될 수있다.
    5. 12.5 μM의 라이브러리 제어 결과에 미리 냉장 하이브리드 버퍼와 희석 라이브러리 제어의 225 μl를 20 μM의 라이브러리 제어의 375 μl를 섞는다. 용액을 혼합하여 여러 번 전환.
    6. 오후 12시 5분 변성 라이브러리 제어 및 혼합하는 소용돌이의 6 μL와 변성 최종 도서관의 594 μl를 결합합니다. 결합 SAMP를 설정르 라이브러리와 따로 얼음에 라이브러리 제어 샘플은 바탕 화면 시퀀서 시약 카트리지에로드 할 준비가 될 때까지.

6. 데이터 분석

  1. 시퀀스 품질 평가
    1. 시퀀스 품질 평가 (11)를 사용하여 로우 시퀀스 데이터 (fastq 파일)의 품질을 계산한다.
      주의 :이 단계는 상기 다운 스트림 분석을하기 전에 데이터를 평가하는 것을 돕는다. 이 소프트웨어는 내장 매개 변수와 함께 실행되며 각 fastq 파일에 대한 통계 세트를 생성합니다.
  2. 조정
    1. 정렬 순서는 GTF 파일로 알려진 성적 증명서를 제공하면서 참조 인간 게놈 hg19 및 사체 Tophat2 12 사용하기 (fastq 파일) (버전 2.0.10)를 읽습니다. 출력은 BAM 파일이라는 이진 배향 형식의 형태이다.
    2. 정렬 및 Samtools 13 (버전 0.1.19을 사용하여 인덱스를 포함하는 후 처리 단계를 수행)가 BAM 파일에. , SAM을 재정렬, 표시 복제를 수행 크기 계산 및 피카르 도구 14 (버전 1.84)를 사용하여 추가 또는 교체 읽기 그룹을 삽입합니다.
  3. RNAseq 품질 평가
    1. RNAseq 품질 산정을 사용 RNAseq 데이터 품질 제어 측정하는 일련의 계산. 이 소프트웨어에 대한 입력은 Tophat2 정렬에서 BAM 파일 15입니다. 출력은 다른 사람의 사이에서 비율과 rRNA의 비율을 읽고, 매핑 된 총 읽기 수, 중복을 나열하는 HTML 파일입니다.
  4. 변형 콜링
    1. 정렬 STAR (버전 2.4.0) (16)를 사용하고 단일 염기 전화 변종 플래그 GATK의 (버전 3.3-0) HaplotypeCaller 17 .Follow GATK BAM 후 처리 단계 및 필터링 기준을 사용하여 출력에서 오탐 (false positive)을 제거합니다.
  5. 유전자 발현
    1. 유전자 발현 USI 계산턱시도 슈트 (18)로부터 NG 커프스 소프트웨어 (버전 2.1.1).
      참고 : 입력 Tophat2 정렬 도구에서 BAM 파일입니다. 출력은 식을 (읽어 매핑 백만 당 킬로 당 조각)을 FPKM로 계산 된 이소 형, 유전자 전사 수준에서 생산된다.
  6. 퓨전 콜링
    1. ChimeraScan 19 (버전 0.4.5), Tophat 퓨전 (20) 사용자 정의 및 TRUP (21)를 사용하여 각 샘플에서 융합을 호출합니다. Oncofuse 22 (버전 1.0.9b2)를 사용하여 도메인에 대한 융합 주석.

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Representative Results

RNAseq 캡처 개략적 강조 주요 단계가도 1에 도시되어있다. 공지 된 돌연변이와 함께 4 개의 암 세포주는 RNAseq 캡처 기술의 유효성을 증명 하였다 (K562 ABL1 융합, RET 융합과 LC2와, EOL1 PDGFRalpha 융합 및 RT-으로 4 FGFR3 융합과). 네 개의 샘플을 함께 모으고 100 혈압 FASTQ 파일을 생성하는 데스크탑 시퀀서에 판독 2 배속으로 서열화 하였다. 인간 사체 1) 품질 관리 평가 2) 정렬 3) 유전자 발현의 정량 분석​​, 4) 융합 호출 및 5) 변형 호출 : FASTQ 파일 다섯 가지 주요 구성 요소를 포함하는 RNAseq 분석 파이프 라인을 통해 실행 하였다. 정렬 파일 (BAM)은 단일 염기 변이를 호출 유전자 발현을 계산하는데 사용된다. 융합은 (자신의 정렬 수행) 등 TopHat 융합 등 융합 발신자를 사용하여 호출되고, 출력은 날기를 주석이g 융합 탐지 소프트웨어.

유전자 RNAseq에서 표현과 캡처의 비교 (10)에 의해 표적 성적 증명서의 농축을 보여줍니다 캡처 방법 (그림 2A)를 사용하여 1,000 배. RNAseq 비교 포착하여 타겟 사체 영역에 매핑 된 읽기 또한,도 2b는 퍼센트의 증가를 나타낸다. 품질 관리 대책의 평가는 그림 3에 표시됩니다. 캡처 RNAseq은 사체 (3A, 94 % 93 %)에 정렬의 관점에서 동일하게 수행하고 삽입 크기 (3B, 174 bp의 (162) BP)를 의미한다. 캡쳐 방법을 사용하여, 엑손 영역의 높은 비율은 서열화되어있다 (3C 77 % 60 %), 반대로 인트론 영역의 하부 비율 서열화된다 (3D, 4 % 20 %). 샘플 당 총 읽기 수는 3E에 도시된다 층, 4 % 15 %)에 비해 포획 방법을 이용하여 낮았다.

표 1에 나타낸 용융 검출 출력은 표준화 된 융합 판독지지 생성된다. RNAseq 4 개의 모든 세포주 융합체 검출에 성공 캡처. 캡처 및 RNAseq의 영역을 중첩라는 단일 염기 변이의 비교는 그림 4에 표시됩니다.이 대상 영역 내에서 캡처 및 RNAseq 사이 변종의 높은 일치도를 보여줍니다.

그림 1
그림 1. 도식 RNAseq 캡처 단계의.이 실험 데모에서는, RNA가 먼저 deple입니다역전사 효소를 사용하여 화학적 분열 보완 DNA (cDNA의)의 합성 다음 리보솜 RNA의 테드. 다음으로, cDNA를 폴리아 데 닐화 및 라이브러리를 생성하기 위해 플랫폼 별 어댑터 양단에 결찰된다. 적절한 어댑터 만의 cDNA 라이브러리는 다음 PCR에 의해 증폭된다. 라이브러리는 사용자 정의 올리고 뉴클레오티드 프로브에 하이브리드 및 자기 구슬을 사용하여 캡처됩니다. 캡처 라이브러리이 소량 차세대 시퀀싱 충분를 한 번 증폭되어야한다. 다중 라이브러리는 병렬로 순서화 될 수있다. 시퀀싱 데이터는 유전자 융합, 발현 또는 돌연변이 같은 관심의 RNA 이벤트를 분석한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. CRNAseq. A, 측정 네 개의 암 세포 라인 K562, LC2, EOL1 및 RT-4 캡처 및 RNAseq 사이의 유전자 발현 비교 캡처에서 표적 유전자의 omparison 매핑 만 읽고 (FPKM) (로그 스케일) 당 킬로 당 읽습니다. 관심의 표적 유전자가 아닌 타겟 유전자 (회색). B, 대상 영역에 매핑이 네 가지 암 세포주에서 RNAseq 라이브러리 대 캡처에 증가 읽기의 비율 비교 (파란색) 강화됩니다. 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 이 그림.

그림 3
네 개의 대표 암 세포주에서 RNAseq 캡처. A는, 비율로는 사체에 매핑을 읽고 시퀀싱 메트릭 그림 3, C를,의 비율은 엑손 지역에서 읽습니다. D의 비율이 인트론 지역에서 읽습니다. E를, 총 순서가. F, 리보솜 RNA에 매핑을 읽는 비율이 읽습니다. 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.

세포주 퓨전 도서관 유형 총 읽어 대상 읽고에 지원 정규화 퓨전 읽고 (NFSR)
TophatFusion ChimeraScan TR쪽으로
K562 BCR-ABL RNAseq 150300482 279438 0 (438) 0
포착 9341148 7566087 598 (343) 0
LC2 CCDC6-RET RNAseq 128861790 307566 0 97 0
포착 12320692 10314284 (71) (44) 6
EOL1 FIP1L1-PDGFRA RNAseq 135321406 225222 0 0 (170)
포착 9317418 7680818 (143) 0 (7)
RT4 FGFR3 -TACC3 RNAseq 161350024 208741 0 (131) 469
포착 8305950 6563574 (358) (88) (34)

K562, LC2, EOL1 및 RT-4의 RNAseq 캡처 1. 퓨전 감지.이 표는이 데모에 사용되는 네 개의 암 세포 라인과 세 가지 융합 탐지 알고리즘, TopHat2, ChimeraScan 및 TRUP를 표시합니다. 이 표는보다 큰 60000000가 RNAseq 활용 읽기에 비해 읽기 미만 1,000 만 총을 사용하여 캡처와 융합을 감지 할 수있는 능력을 보여줍니다. 키나아제 판독하여 융착지지 융합 나누어 계산 하였다 판독지지 1 백만 곱 읽는다.

</ HTML"그림 4"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 54090 / 54090fig4.jpg"/>
RNAseq 캡처를 요구 그림 4. SNV.이 벤 다이어그램은 네 개의 세포주의 각각에 대해 캡처 및 RNAseq에 의해 검출 된 단일 염기 변형 (SNVs)의 수를 표시 (K562, LC2, EOL1 및 RT-4). 이 높은 대상 영역 내에서 캡처 및 RNAseq 사이 SNVs의 일치 보여줍니다. K562 (81.3 %), LC2 (78.3 %), EOL1 (89.5 %)과 RT-4 (73.9 %)을 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.

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Discussion

RNAseq 캡처 RNAseq 및 마이크로 어레이 사이의 중간 전략은 사체의 선택된 부분을 평가하기위한 접근이다. 캡처의 이점은 유전자 변형의 데스크탑 시퀀서, 높은 처리량, 및 검출에 선정 신속한 처리 시간 감소를 포함한다. 이 방법은, 비 코딩 RNA를 (23)의 특성을 단일 염기를 검출하도록 구성 될 수있는 RNA의 스 플라이 싱을 조사하고 유전자 융합체 또는 구조적 재 배열 (24)을 식별하기 위해, 4-6 변종. 또한,이 방법은 파라핀 블록 (24, 25)에 포르말린으로 고정 후의 임베디드 한 임상 샘플 또는 처리에 적용될 수있다.

마이크로 어레이에 비해 RNAseq 캡처 몇 가지 중요한 이점이 있으며, 실시간 정량 PCR, 생거 시퀀싱 및 DNA 시퀀싱. 마이크로 어레이 인해 크로스 하이브리드 및 프로브의 결합이 아닌 특정 높은 배경에 의해 제한된다. 리터와 유전자의 정량고도로 발현 유전자 측정 채도 신호의 영향을받는 동안 흐름 식은, 배경 노이즈로 인해 제한된다. RNAseq 캡처 비교, 실시간 PCR 재현하기 어려운 증명한다. 또한, RNAseq이 새로운 성적 증명서의 검출을 허용, 이하 시작 입력 자료를 필요로하며, 생거 시퀀싱 대안 스 플라이 싱 (26) .IN 대비를 검색 할 수 있습니다, RNAseq는 높은 처리량과 낮은 표현의 miRNA의 분석을 할 수 있습니다. 생거 시퀀싱 그러나 새로운 융합의 식별이 선험적 후보 중단의 요구에 의해 방해 알려진 엑손 - 엑​​손 접합 및 체세포 DNA 돌연변이와 융합의 검증을위한 유용한 도구로 입증했다. 비용 효율적인되지 DNA 시퀀싱, 데이터의 큰 저장 공간을 필요로하고, 전사 후 변형 검출 불가능하다.

RNAseq 캡처에 관련된 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 우선, 도서관에서의 제품 수율을 향상시킬세척시 RNA / cDNA를 특정 상자성 구슬과 상자성 비즈, 이상 수율의 손실로 이어질 것입니다 구슬을, 건조하지 않도록주의해야합니다. 또한,하지의 밑에 건조 된 cDNA 수율을 감소시킬 수 에탄올, 모든 에탄올 샘플 튜브에서 제거되어 있는지 확인 구슬을. 둘째, 상호 보완적인 프로브의 cDNA 라이브러리의 하이브리드 우리가 사전에 적어도 두 시간 동안 65 ° C로 온난화 워시 버퍼 I과 엄격한 버퍼를 추천 일관된 온도에 따라 달라집니다. 또한, 하이브 리다이 제이션 이후의 결합 및 세척 단계 동안 65 ° C를 유지하기 위해 필수적이다. 여기에 사용되는 프로브는 키나아제, 같은 전사 인자, 집 유지 유전자와 같은 일반 재배에 관여하는 유전자를 포함하는 약물 개발에 대한 관심의 유전자의 엑손을 위해 설계되었다. 또한, 유전자 함량은 사용자 정의 및 캡처 패널 크기는 다를 수 있습니다. 게놈 영역에 새로운 정보가 발생로서 또한, 추가적인 프로브 설계와 T에 추가 될 수있다그는 캡처 패널을 기존.

정렬 측정 평가, 특히 온 - 목표 비율은 대상 영역이 강화되었다 얼마나 잘에 대한 정보를 제공합니다. 낮은 온 - 목표 속도는 원하는 대상 영역을 캡처 및 농축되지 않은 이에 실패 하이브리드 캡처, 때문일 수 있습니다. 이 경우, 라이브러리 세트의 재 혼성화 캡처가 수행되어야한다. 낮은 온 - 레이트 목표는 또한 샘플의 rRNA의 비율을 산출함으로써 확인할 수있다 rRNA의 고갈 실패로 될 수있다. 샘플 내의 rRNA의 높은 비율은 rRNA의 고갈로 시작하는 샘플의 재 조제를 필요로한다. 라이브러리 농도 혼성화 캡처위한 요구 이하로 떨어질 경우, 또한, 상기 샘플 종류와 품질 (: 50 ~ 1,000 ng의 범위)에 대해 시작 입력의 양을 최적화하는 것이 바람직 할 것이다.

대상 RNAseq 응용 프로그램에 대한 몇 가지 장점이 있지만, 또한에 제한 사항이 있습니다중히 여기다. 가난한 RNA의 RIN에 따라 품질이나 분열의 정도와 샘플 시퀀싱 품질 라이브러리를 생성 할 수 없습니다. 여러 그룹이 포르말린 고정 파라핀 포함 된 샘플의 성공을 증명하고있다, 그러나 순서 24,25,27에 대한 통과하지 않습니다 샘플이 있습니다. RNAseq 캡처 알려진 성적 증명서에 초점을 맞추고 있기 때문에, 그것은 소설이나 주석이 달려 있지 않은 성적에 대한 편견 RNAseq의 장점을 잃는다. 또한, SNP 검출을위한 방법 RNAseq는 표현 사체의 돌연변이를 검출 할 수있다.

RNAseq 캡처의 미래의 기회는 연구와 임상 응용 프로그램을 포함한다. 긴 비 코딩 RNA의 수천 생물학에서의 역할의 최근 발견은 초점을 맞춘 특성화가 필요합니다. 암, 감염성 질환, 및 비 침습적 검사로 인간 질병의 특성을 병원에서 RNAseq 캡처 연구 테스트를 넘어 확장 할 수 있으며, 임상 분석으로 번역합니다. 게놈 서열과 함께 approaCHES, RNAseq 캡처 연구하고 표현 게놈의 특성을 통합 할 수 있습니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Centrifuge 5417R Eppendorf 5417R
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004
Molecular Biology Grade Ethanol Sigma Aldrich E7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 ml Eppendorf 21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) Illumina MS-102-2002
MiSeq Desktop Sequencer Illumina
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA Illumina RS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 IDT 127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) IDT 127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) IDT 127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads  Beckman-Coulter A63880
Dynabeads® M-270 Streptavidin Life Technologies 65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg Roche Applied Science 05480647001
Qubit® Assay Tubes  Life Technologies Q32856
Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions) Roche NimbleGen  05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer  Life Technologies Q32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) IDT
Tween20 BioXtra Sigma P7949-500ML
Nuclease Free Water Life Technologies AM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module Biorad 185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits Roche Applied Science 05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl Life Technologies 18064-014
D1000 ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 ml Beckman Coulter Inc A63987
RNA ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5576
RNA ScreenTape Ladder Agilent Technol. Inc. 5067-5578
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent Technol. Inc. 5067-5577
Sodium Hydroxide Sigma 72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65602
DYNAMAG -96 SIDE EACH Life Technologies 12331D
Chloroform Sigma C2432-1L
KAPA HotStart ReadyMix KAPA Biosystems KK2602
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific
My Block Mini Dry Bath Benchmark BSH200
D1000 Reagents Agilent Technol. Inc. 5067- 5583
Vacufuge Plus Eppendorf 022829861 

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References

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