有针对性的RNA测序分析表征基因表达和基因组改变

Biology

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Martin, D. P., Miya, J., Reeser, J. W., Roychowdhury, S. Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations. J. Vis. Exp. (114), e54090, doi:10.3791/54090 (2016).

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Abstract

RNA测序(RNA测序)是可以被用于检测和表征的基因表达,突变,基因融合,和非编码RNA一个通用的方法。标准RNA测序需要30 - 亿测序读出并可以包括多个RNA产物如mRNA和非编码RNA。我们证明有针对性的RNA测序(捕获)如何允许在使用桌面序选定的RNA产品聚焦研究。 RNA测序采集可以表征可能以其它方式使用传统的RNA测序方法错过没有注释,低或瞬时表达成绩单。在这里,我们描述了从细胞系,核糖体RNA耗尽,cDNA合成,制备条形码库,杂交和靶向转录物的捕获和多重测序上的桌面序的RNA的提取。我们也勾勒出计算分析管道,其中包括质量控制评估,校准,检测融合,基因表达定量和单国统会的鉴定leotide变种。该测定允许有针对性的转录测序来表征的基因表达,基因融合,和突变。

Protocol

注意:此协议说明了同时处理和4个样品的分析。这种方法是用RNA从细胞中分离,新鲜冷冻组织和福尔马林固定,石蜡包埋的组织的(FFPE)兼容。该协议始于50 - 从RNA输入每个样本的1000纳克(250纳克推荐)。

1. rRNA的消耗和RNA议事碎片

  1. rRNA的消耗
    1. 在室温下除去洗脱,素,片段组合,rRNA的去除组合,rRNA的结合缓冲液和重悬浮缓冲液从-20℃并解冻。从4℃除去的洗脱缓冲液,rRNA的去除珠和RNA / cDNA的特定顺磁性珠粒,并把到室温。
    2. 添加0.25微克RNA​​对PCR管。稀释用不含核酸酶的超纯水的总RNA,以10微升总终体积。添加5微升的rRNA结合缓冲液,以每管再加入的rRNA去除混合5微升,轻轻pipettË向上和向下混合。在与盖的热循环仪的地方管预加热至100℃,程序热循环仪于68℃5分钟以变性RNA。
    3. RNA变性后,从热循环仪取出试管并在室温下孵育1分钟。涡rRNA基因去除珠管大力重悬珠。添加35微升的rRNA去除珠新管和转移RNA变性反应(20微升)添加到含有的rRNA去除珠管。
    4. 调整吸管45微升和吸管迅速向上和向下20X混合。在RT孵育管1分钟。然后放置在磁性支架管在室温下放置1分钟。转移上清液至新标记的PCR试管中在磁性支架再次将这些试管在室温下放置1分钟。这将确保没有珠粒转移。转移上清至新标记的PCR管。
    5. 涡流的RNA / cDNA的特定顺磁珠,并添加99微升的珠每管。轻轻吸管整个音量上下10倍混合。如果有降级-RNA起,加193微升充分混合的RNA / cDNA的顺磁性的珠子,每管。孵育在室温下进行15分钟。然后将试管在室温下的磁性支架5分钟。取下并丢弃上清液。
    6. 加入200μl新鲜配制的70%乙醇(乙醇)的。保持磁架管和照顾到不打扰珠。在室温下孵育30秒,然后取出并丢弃上清液。允许管放置在室温下5 - 10分钟进行干燥。
    7. 离心机解冻室温洗脱缓冲液在600×g下5秒。添加11微升洗脱缓冲液对每个管和轻轻吸取上下10倍混合。在RT孵育管2分钟。放置在磁性支架管在室温下5分钟。将上清转移的8.5μl到新标记的PCR试管中。
  2. rRNA基因RNA耗尽的碎片
    1. 加入8.5微升埃尔UTE,8.5微升黄金和8.5微升片段组合,以每管。吸管轻轻向上和向下10倍混合。地方管在与下面的程序热循环仪:预加热盖至100℃,94℃8分钟,然后4℃保持。
      注意:此步骤是为了产生155碱基对的平均插入片段大小。如果RNA样品的平均片段大小低于200基点,跳过此步骤并继续执行第一链cDNA合成。

2. cDNA合成

  1. 合成第一链cDNA
    1. 从-20°C取出第一链合成的混合,在室温下解冻。
    2. 预编程热循环仪,使用以下设置:预热盖选项和设定为100℃,然后25℃10分钟,42℃15分钟,70℃15分钟,并保持在4℃下。程序保存为“合成第一链。”
    3. 在600#离心机解冻-第一链合成混合管215;克5秒。将1微升逆转录酶与9微升第一链合成混合。
    4. 添加8微升第一链合成的和逆转录酶混合到每个管中,轻轻地吸取上下6倍混合。使用固定速度的迷你台式离心机在600 XG 4秒的离心管中,使液体底部。将管在热循环仪,并选择合成第一链。当热循环仪达到4℃,除去管和立即进行合成第二链cDNA。
  2. 合成cDNA第二链
    1. 预热热循环仪,以16℃下与盖子预先加热至30℃。解冻第二链预混并在冰上再悬浮缓冲。在事先从4℃除去的顺磁性珠的瓶子,静置至少30分钟,以使它们到室温。
    2. 添加5μl的重悬浮缓冲液,以每个PCR管中。离心机第二链预混600×g下5秒,并添加20微升到每个PCR管中。地方管在16℃,1小时预热的热循环仪。当完成温育后,从热循环仪取出,并允许管来室温。
    3. 涡流的顺磁性珠粒,直到它们被充分分散。添加90微升充分混合的顺磁珠到每个管中。轻轻吸取整个音量上下10倍混合。在室温下孵育管15分钟。在室温下的磁性支架5分钟地方管。
    4. 取下并丢弃135微升上清液然后离开磁力架管进行乙醇洗。加入200μl新鲜制备的80%的乙醇,以每管,而不会干扰所述珠,然后在室温下孵育30秒。取下并丢弃所有的上清液从每个。重复一共有两个80%的乙醇洗涤。
    5. 让试管在室温下静置5 - 10分钟以在磁性支架干燥。离心解冻室temperatur在600×克5秒ê悬浮缓冲液。从磁性底座取出PCR管。添加17.5微升悬浮缓冲液到每个PCR管,轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。孵育管在室温下2分钟。
    6. 在室温下5分钟的磁性支架地方管,然后转移15微升上清液(双股cDNA)至0.2ml的PCR条管中。
      注意:这是如cDNA可被储存在-20℃下长达7天的安全停止点。

3.文库制备

  1. 腺苷酸3'端
    1. 在室温下拆下-20°C和解冻A尾组合。预编程热循环仪使用以下设置:选择预热盖选项和设定为100℃,然后将在37℃30分钟,70℃5分钟,并保持在4℃。这个程序保存为“ATAIL70”。
    2. 加入2.5微升再悬浮的缓冲到每个管中。然后加入12.5微升解冻A尾组合。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。将管在热循环仪,并选择ATAIL70。当热循环仪的温度是在4℃下,从热循环仪取出PCR管并立即进行结扎适配器。
  2. 结扎适配器
    1. 除去合适的RNA适配器管,从-20℃停止连接缓冲液和重悬浮缓冲液并在室温下解冻。直到指示在协议中这样做,不要从-20°C除去连接混合物管。从4℃除去的顺磁性珠的瓶子,静置至少30分钟,使至室温。
    2. 预加热热循环仪,以30℃,并选择预加热盖选项和设定为100℃。离心600×克5秒解冻RNA适配器管。在使用前立即从-20℃取出连接混合物管存储。
    3. 添加2.5微升的再悬浮缓冲液中向每个样品管中。加入2.5微升连接混合物。返回连接混合物管-20°C使用后立即存储。添加2.5微升解冻的RNA适配器索引的向每个样品管中。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。
    4. 使用固定速度的迷你台式离心机在600×g的时间为4秒离心管中。管放置在预热的热循环仪。盖上盖子,在30℃下孵育10分钟。
    5. 除去从热循环仪管和添加5微升停止连接缓冲液到每个管灭活结扎。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。
    6. 2.2.4,使用42微升的混合顺磁珠,并丢弃79.5微升上清 - 如2.2.3所述重复洗。与在磁性支架上的管,让在室温下进行5样品风干 - 10分钟。
    7. 拆下的PCR条管磁架,并添加52.5微升悬浮缓冲液每管。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。在室温下孵育管2分钟。放置在RT磁性支架上的管5分钟,或直至所述液体是明确的。转移上清液加入50μl来自每个管新0.2毫升的PCR条管中。注意不要打扰珠。
    8. 2.2.4,用50微升的混合顺磁珠,并丢弃95微升上清 - 如2.2.3所述重复洗。与在磁性支架上的管,让在RT样品风干5 - 10分钟。
    9. 从磁性底座上卸下的PCR条管和添加22.5微升重悬浮缓冲液到每个管中。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。
    10. 孵育在RT管2分钟。放置在磁性支架上的管,在室温下放置5分钟或直至液体是明确的。转移20微升上清液从每个管到一个新0.2毫升PCR条管。注意不要打扰珠。这是一种安全的停止点和cDNA可以储存在-20℃达7天。

4.图书馆放大

  1. 丰富DNA片段
    1. 在室温下取出PCR主混合物,PCR引物鸡尾酒和再悬浮缓冲从-20°C的存储和解冻。除去从4℃贮存的顺磁性珠的瓶中,静置至少30分钟,使至室温。
    2. 预编程热循环仪使用以下设置:选择预热盖选项和设定为100℃,然后在98℃设定的初始变性在98℃,30秒,变性的15个循环持续10秒,退火在60℃下30秒,和延伸72℃30秒,在72℃下的最后一个扩展周期为5分钟,并保持在4℃。程序保存为“PCR”。
    3. 离心解冻PCR主在600×g下5秒混合和PCR引物的管。添加5微升的解冻PCR引物,以每个样品管中。加入25微升解冻PCR扩增预混每个样品管中。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。
    4. 请将加盖PCR条管的预编程热循环仪。盖上盖子,运行PCR程序。当PCR完成后,从热循环仪取出试管,并保持在冰上。
    5. 2.2.4,用50微升的混合顺磁珠,并丢弃95微升上清 - 如2.2.3所述重复洗。与在磁性支架上的管,让在室温下进行5样品风干 - 10分钟。
    6. 从磁性支架移除管和添加32.5微升重悬浮缓冲液到每个样品管中。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。孵育在室温下进行2分钟。放置在磁性支架上的PCR试管在室温下5分钟,或直至所述液体是明确的。然后换乘30微升苏pernatant新鲜0.2毫升PCR管。
    7. 使用荧光计7执行cDNA的定量和使用毛细管电泳系统8确定的cDNA质量。
      注意:这是一个安全的停止点和cDNA可以储存在-20℃达7天。注:该库被认为是一种RNA测序文库。
      后续步骤导致捕获库。

5.杂交,捕获和测序

  1. 复用杂交
    1. 从-20°C删除自定义水合探头,婴儿床-1 DNA,阻断通用寡核苷酸,以及适配器特异性阻断寡核苷酸和解冻冰。
    2. 在低绑定1.5mL管中,并结合500 ng的DNA(每个样品125纳克时,复用4个样本),5微升婴儿床-1 DNA(1微克/微升),1UL通用阻断寡核苷酸,0.5微升P7(6个核苷酸)适配器特定阻断寡核苷酸(该量可能需要根据多路复用conditi进行调整项)和0.5微升P7(8核苷酸)适配器特异性阻断寡聚(该量可能需要根据多路复用条件)进行调整。
    3. 将样品管在真空浓缩器具有面向旋转的相反方向帽打开。在45℃下20分钟,或直至所述液体完全蒸发干燥的内容。
    4. 干重悬内容与8.5微升2X杂交缓冲液,3.4微升杂交A组份和1.1微升无核酸酶的水。允许再悬浮和涡每2.5分钟10分钟。再悬浮的物质转移至0.2mL的PCR管并在95℃下孵育10分钟在热循环。
    5. 从热循环仪中删除的杂交样品管,加入2微升重新悬浮在1.5皮摩尔/微升的浓度定制探针。备选地,加入4微升重新悬浮在0.75皮摩尔/微升的浓度定制探针。孵育杂交反应过夜 - 在65℃下(16 24小时)。
      注:探头从不同的供应商处购买之间可以使用和制造商的说明应遵循。杂交步骤的持续时间也可以变化。
  2. 珠制备及捕获
    1. 从4℃除去的链霉抗偶联的顺磁珠瓶并在室温下平衡30分钟。稀释10倍的洗涤缓冲液(I,II,III和严格)和2.5倍珠洗涤液以创建1X工作方案。
    2. 等分试样140微升1×洗涤缓冲液的我成到一个新的1.5毫升管。的1倍严格缓冲热量全部量,并在65℃下1×洗涤缓冲液I的等分试样在至少2小时的热块。
    3. 等份加入100μl的每捕获蛋白链菌素偶联的顺磁珠到1.5毫升管。放置在磁铁和弃上清。添加每100微升磁珠200μl的珠洗涤缓冲液并涡旋10秒。在磁铁将用于2 - 5分钟或直到上清液是显而易见的。一旦上清液是明确的,放弃它,并重新泥炭一次,总共两次洗涤的。
    4. 拆除珠子洗涤缓冲液后,加入等体积的珠洗涤液作为初始起点体积( 100微升一个捕获)。重悬并转移到0.2mL的PCR管中。将管磁架为2 - 5分钟或直到上清液是显而易见的。弃上清。
    5. 既在在65℃的热循环仪的杂交样品和珠,杂交混合物转移到珠管和移液管上下10倍混合。孵育在65℃下45分钟,涡旋,并使用一个固定的速度(6.0 XG)台式微型离心机降速样品4秒。
  3. 珠洗
    1. 从热循环仪中取出捕获管,加入100微升预先加热1×洗涤缓冲液I至管,涡旋10秒以混合。将混合物转移到一个新的低绑定1.5mL管中。放置管中磁分离齿条和允许2 - 5分钟进行分离,或直至上清液是明确的。 ðiscard上清。
    2. 加入200μl预热1X严格的洗涤液和移液器上下10次混合。孵育在65℃下5分钟。把试管磁分离架上,并允许2 - 3分钟分离或直到上清液是显而易见的。弃上清。重复严格洗涤一次,总共两次洗涤的。
    3. 加入200μl室温1×洗涤缓冲液I和涡旋2分钟以混合。放置管在磁性分离架上并允许2 - 5分钟进行分离,或直至上清液是明确的。弃上清。
    4. 加入200μl室温1×洗涤缓冲液II和涡旋1分钟以混合。放置管在磁性分离架上并允许2 - 5分钟进行分离,或直至上清液是明确的。弃上清。
    5. 加入200μl室温1×洗涤缓冲液III和涡旋30秒以混合。放置管中磁分离机架允许2 - 5分钟进行分离,或直至上清液清楚了。弃上清。
    6. 从磁分离机架上卸下该管,并添加20微升不含核酸酶的水重悬珠子。吹打向上和向下10倍调匀。
  4. 拍摄后的PCR扩增
    1. 从4℃除去顺磁珠,在室温下平衡30分钟。
    2. 在RT除去-20℃并解冻的热启动PCR预拌(2×)和PCR引物混合,然后置于冰上。 27.5微升2倍热启动PCR预拌与PCR引物1的2.75微升至2.75微升PCR引物2相结合的图书馆准备扩增预混(这些卷1杂交库加过量10%)。
    3. 设置通过加入珠20微升加与文库扩增主混合物的30微升的50微升的总体积捕获的DNA在PCR管进行反应。帽筒正确,涡旋混合。 4秒的离心管使用一个固定的速度迷你卡在6.0×g的LE-离心机。
      1. 设置下述PCR程序: - 在98℃变性12个周期为15秒,退火65选择预热盖选项和设定为100℃,然后将初始变性在98℃45秒,10 ℃30秒和延伸72℃60秒,在72℃下的最后一个扩展周期为60秒并保持在4℃。
    4. 从热循环仪取出样本,加入75微升顺珠。拌匀,并在室温孵育15分钟。
    5. 放置在磁体管在室温下2 - 3分钟,然后除去上清液。通过加入200微升80%乙醇,温育30秒,然后除去上清液洗上磁珠。重复总共两次80%洗涤。
    6. 在RT孵育5 - 10分钟,以允许珠粒干燥。不要过度干燥,开裂。珠悬浮在22微升的Tris-EDTA pH值8.0(1X TE解决方案),并允许为洗脱3分钟。将样品在磁铁3 - 5分钟,日恩转移20微升洗脱的产品来新低绑定1.5mL管中,以确保没有珠结转。
    7. 执行使用荧光计7捕获的cDNA的定量和使用毛细管电泳系统8确定捕获的cDNA质量。
  5. 桌面序时的加载过程9
    1. 稀捕获cDNA文库利用10毫摩尔Tris-氯pH 8.5的具有0.1%Tween 20的解冻10N的NaOH和杂交缓冲在冰上4 1nM的最终浓度。使用前约30分钟,在解冻水RT桌面序V2试剂盒盒1。不要填写上面的最大加载线10。请注意,这是一个测序平台的具体程序和政策有可能根据制造商的说明而变化。
    2. 通过在离心管(始终准备好新鲜)20微升10 N氢氧化钠980微升核酸游离水结合准备的0.2N氢氧化钠1毫升。通过稀释PhiX库(库控制)至4纳米组合2微升10与3微升的10mM三Cl pH 8.5的纳米库控制的具有0.1%Tween 20。
    3. 5微升4nm的图书馆与5微升0.2N的氢氧化钠和旋涡简要相结合的混合最终变性图书馆和图书馆的控制。使用固定速度小型台式离心机在6.0×g下4秒离心管中。孵育在RT 5分钟以变性库。
    4. 添加990微升预冷的杂交缓冲液含有10微升变性库的管中。这导致了20 PM库。标记变性20 PM库与日期,并可以在-20℃储存长达3周。
    5. 混合375微升20日下午库控制的225微升预冷杂交缓冲液稀释库控制导致12.5分库控制。倒置几次到该溶液中混合。
    6. 结合594微升变性最终库6微升下午12时05分变性库控制和旋涡混合的。将结合SAMP乐库和磁带库控制预留冰上直到样品准备加载到桌面序试剂盒。

6.数据分析

  1. 序列质量评估
    1. 计算使用序列质量评估11原始序列数据(FASTQ文件)的质量。
      注意:此步骤有助于评估数据之前,进一步进行下游分析。该软件具有内置参数运行,并产生一组度量为每个FASTQ文件。
  2. 对准
    1. 对齐序列读取(FASTQ文件)的参考人类基因组hg19并使用Tophat2 12转录(2.0.10版本),同时提供成绩单称为一个GTF文件。输出是在所谓的BAM文件的二进制对准格式的形式。
    2. 执行包括排序,并使用Samtools 13(版本0.1.19索引后处理步骤)的BAM文件。执行重复的标记,重新排序SAM,插入尺寸计算,并使用工具皮卡德14(1.84版)增加或更换读取组。
  3. RNA测序质量评估
    1. 计算使用RNA测序质量评估RNA测序数据的一系列的质量控制指标。输入到这个软件是从Tophat2对准一个BAM文件15。输出是一个HTML文件,该目录总读取次数,重复的,映射的读百分比和rRNA的百分比, 等等 ,等等。
  4. 变异召唤
    1. 使用STAR(版本2.4.0)16对齐,然后调用单核苷酸变异使用GATK的(版本3.3-0)HaplotypeCaller 17。遵循GATK BAM后处理步骤和过滤标准标志,并从输出中删除误报。
  5. 基因表达
    1. 计算基因表达USING袖扣从燕尾服套装软件18(版本2.1.1)。
      注意:输入来自Tophat2对齐工具BAM文件。输出是在同种型,基因和转录物水平,其中,表达作为FPKM(每百万映射读取片段每千碱基)计算产生的。
  6. 融合呼叫
    1. 呼叫使用ChimeraScan 19(0.4.5版本),高顶礼帽融合20个自定义和TRUP 21每个样品的融合。注释使用Oncofuse 22(版本1.0.9b2)域的融合。

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Representative Results

在RNA测序捕捉的概略突出关键步骤示于图1。与已知的突变四癌细胞系被用来证明RNA测序捕捉技术的有效性(K562与ABL1融合,LC2与RET融合,EOL1与PDGFRalpha融合和RT- 4 FGFR3融合)。这四个样品汇集在一起​​,并进行测序2倍于台式机音序器,生成FASTQ文件100个基点的读取。 1)质量控制评估,2)对准至人类转录,3)基因表达的定量,4)融合通话,和5)的变体主叫:FASTQ文件被通过RNA测序分析管道,其包括五个主要部分运行。对准文件(BAM)的用于调用单核苷酸变体和计算基因表达。融合正在使用熔化呼叫者,例如高顶礼帽融合(表演自己对准)称为与输出注解全光照g的熔解检测软件。

从RNA测序的基因表达和捕获比较了10〜证明有针对性的成绩单富集1000倍使用捕获方法( 图2A)。此外, 图2B示出的百分比增加了读取映射到使用捕获相比RNA测序靶向转录物的区域。的质量控制措施的评估在图3表示。捕获和RNA测序在对准方面的转录(3A,94% 93%)同样进行,平均插入片段大小(3B,174碱基 162碱基对)。使用捕获方法,外显子区域的更高百分比进行测序(3C,77% 60%),而相反地内含子区域的一个较低的百分比被测序(3D,4% 20%)。每个样品的总读取计数3E描绘(3F,4% 15%)存在于每个样品中的rRNA序列的百分率是使用捕获方法低。

表1所示的融合检测输出与归一融合支承读取生成的。捕获RNA测序成功检测融合所有四个细胞系。单核苷酸变异体称为重叠捕获和RNA测序的区域的比较显示在图4中 。这表明在目标区域内的捕获和RNA测序之间变体的高一致性。

图1
图1. RNA测序捕捉步骤示意图。在这个试验示范,RNA是第一deple核糖体RNA的泰德,随后使用逆转录酶的化学片段化和互补DNA(cDNA)的合成。接着,该cDNA是聚腺苷酸化并连接两端到特定平台的适配器,以产生一个文库。仅具有适当的适配器cDNA文库,然后通过PCR扩增。然后文库杂交到定制的寡核苷酸探针和使用磁珠捕获。这个小捕获文库的量必须放大的第二时间有足够的用于下一代测序。多个库然后可以并行地测序。测序数据分析所关注的RNA的事件,如基因融合,表达或突变。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
2.Ç在捕获 RNA测序A,通过测量4肿瘤细胞株K562,LC2,EOL1和RT-4捕捉和RNA测序的基因表达比较靶基因的omparison每百万映射读取(FPKM)(对数刻度)每千碱基的读取。相比于非靶基因(灰色)。B,中读取映射到目标区域中捕获与RNA测序库在四个肿瘤细胞株的百分比增加的兴趣有针对性的基因丰富(蓝色)。 请点击此处查看大图这个数字。

图3
图3. 测序指标在四个代表癌细胞捕获 RNA测序的A,百分比读取映射转录, C,百分比的外显子区域的读取。D,比例在内含子区域的读取。E,总测序读数。 读取映射到核糖体RNA的百分比。 请点击这里查看更大的版本这个数字。

细胞系 聚变 库类型 共读 在目标读取 归一化融合支持读取(NFSR)
TophatFusion ChimeraScan TR向上
K562 BCR-ABL RNA测序 150300482 279438 0 438 0
捕获 9341148 7566087 598 343 0
LC2 CCDC6-RET RNA测序 128861790 307566 0 97 0
捕获 12320692 10314284 71 44 6
EOL1 FIP1L1-PDGFRA RNA测序 135321406 225222 0 0 170
捕获 9317418 7680818 143 0 7
RT4 FGFR3 -TACC3 RNA测序 161350024 208741 0 131 469
捕获 8305950 6563574 358 88 34

表1. 融合检测的捕捉 K562,LC2,EOL1和RT-4的RNA测序。此表显示在该演示利用4肿瘤细胞系和三个不同的融合检测算法,TopHat2,ChimeraScan和TRUP。此表说明读取相比更大的超过6000万读取用于RNA测序检测用不到10万总捕捉融合的能力。融合配套读取被融合除以计算支持通过读取读取激酶,再乘以100万人次。

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图4. SNV要求捕捉 RNA测序。这些维恩图显示了由捕获和RNA测序为每4个细胞系中检测到的单核苷酸变体(SNVs)的数量(K562,LC2,EOL1和RT-4)。这说明捕获和RNA测序的目标区域内SNVs的高度一致性:K562(81.3%),LC2(78.3%),EOL1(89.5%)和RT-4(73.9%) 点击此处查看大图这个数字。

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Discussion

RNA测序Capture是RNA测序和芯片之间的中间策略评估转录的选定部分接近。捕获的优点包括在桌面序器,高吞吐量,和基因组改变的检测降低的成本,快速的周转时间。可适于表征非编码RNA 23,检测单核苷酸的方法变体4-6,检查RNA剪接,并确定基因融合或结构重排24。此外,这种方法可应用于已经经过用福尔马林固定并包埋在石蜡块24,25临床或处理的样本。

有相比于微阵列RNA测序捕获的几个显著好处,实时定量PCR,桑格测序和DNA测序。微阵列是通过高背景由于交叉杂交和非特异性探针的结合的限制。基因的升量化由于背景噪声流动表达被限制,而高表达基因测量由信号饱和1的影响。相比于RNA测序采集,实时PCR证明难以重现。此外,RNA测序可以检测新成绩单,需要较少的起始输入材料,可检测剪接26。与此相反,以Sanger测序,RNA测序允许更高的吞吐量和低表达的miRNA的分析。 Sanger测序已被证明是用于与已知的外显子 - 外显子接点和体细胞DNA突变,然而新的融合的识别是通过先验候选断点的要求阻碍了融合的验证的宝贵工具。 DNA测序是不符合成本效率,需要用于数据更大的存储空间,而且是无法检测的转录后修饰的。

有参与RNA测序捕捉几个关键步骤。首先,要提高图书馆产品产量洗涤过程中的RNA / cDNA的特定顺磁珠和顺磁性珠粒,谨慎不要过度干燥珠粒,这将导致产率的损失。另外,不要下干燥珠粒,确保所有的乙醇从样品管除去,乙醇可以减少的cDNA产率。第二,cDNA文库的具有互补探针杂交依赖于温度一致,我们建议变暖洗涤缓冲液I和严格缓冲液至65℃的至少两个小时提前。此外,杂交后是在结合和洗涤步骤,保持65℃的关键。此处所用的探针设计用于药物开发,包括激酶,参与共同重排,如转录因子,和持家基因的基因的兴趣基因的外显子。此外,基因含量是可自定义和捕捉面板尺寸可能会有所不同。此外,如在基因组区域的信息出现时,附加的探针可以设计并加入到t他现有的捕获面板。

调整指标评价,特别是对目标的速度,提供了有针对性的区域是如何以及丰富的信息。低通目标速率可能是由于失败的杂交和捕获,由此,所需的目标区域未捕获和富集。在这种情况下,该库集的重新杂交和捕获必须执行。低通目标速率也可能是由于未能耗尽rRNA基因,其可通过计算的rRNA的样品中的百分比来确认。样品内高的rRNA百分比将要求与rRNA的耗尽开始样品的重新制备。此外,如果库浓度低于用于杂交和捕获的要求,这将是可取的优化起始输入量为样品类型和质量(范围:50-1000纳克)。

而有针对性的RNA测序应用几个优点,也有局限考虑。基于RNA的RIN质量差或破碎的程度样品可能不产生质量库测序。一些研究小组已经证实用福尔马林固定的石蜡包埋的样品的成功,但也有一个不能通过用于测序24,25,27样品。另外,由于RNA测序捕捉集中在已知的转录,它失去了小说或未注释的转录偏RNA测序的好处。此外,对于SNP检测,RNA测序方法只能检测在表达转录突变。

RNA测序捕捉未来机会包括研究和临床应用。数千长的非编码RNA和它们的生物学作用最近发现将要求集中表征。在临床中,RNA测序捕捉可延伸超出研究测试和转化为临床试验以人类疾病表征,例如癌症,感染性疾病,以及非侵入性的检测。在基因测序approa结合CHES,RNA测序捕捉可以集成研究和表征表达的基因组。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Centrifuge 5417R Eppendorf 5417R
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004
Molecular Biology Grade Ethanol Sigma Aldrich E7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 ml Eppendorf 21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles) Illumina MS-102-2002
MiSeq Desktop Sequencer Illumina
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA Illumina RS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5 IDT 127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt) IDT 127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt) IDT 127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads  Beckman-Coulter A63880
Dynabeads® M-270 Streptavidin Life Technologies 65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mg Roche Applied Science 05480647001
Qubit® Assay Tubes  Life Technologies Q32856
Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions) Roche NimbleGen  05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer  Life Technologies Q32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) IDT
Tween20 BioXtra Sigma P7949-500ML
Nuclease Free Water Life Technologies AM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection Module Biorad 185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash Kits Roche Applied Science 05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μl Life Technologies 18064-014
D1000 ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 ml Beckman Coulter Inc A63987
RNA ScreenTape Agilent Technol. Inc. 5067-5576
RNA ScreenTape Ladder Agilent Technol. Inc. 5067-5578
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent Technol. Inc. 5067-5577
Sodium Hydroxide Sigma 72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1 Life Technologies 65602
DYNAMAG -96 SIDE EACH Life Technologies 12331D
Chloroform Sigma C2432-1L
KAPA HotStart ReadyMix KAPA Biosystems KK2602
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific
My Block Mini Dry Bath Benchmark BSH200
D1000 Reagents Agilent Technol. Inc. 5067- 5583
Vacufuge Plus Eppendorf 022829861 

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References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).
  3. Maher, C. A., et al. Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).
  4. Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data. Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).
  5. Quinn, E. M., et al. Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data. PLoS One. 8, e58815 (2013).
  6. Tang, X., et al. The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data. Nucleic Acids Res. 42, e172 (2014).
  7. Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. Available from: http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf (2010).
  8. Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf (2013).
  9. Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. Available from: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf (2013).
  10. Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012).
  11. Andrews, S. FastQC. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  12. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14, R36 (2013).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  14. Broad Institute. Picard. Available from: http://picard.sourceforge.net/ (2014).
  15. DeLuca, D. S., et al. RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization. Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).
  16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
  17. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  18. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  19. Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data. Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).
  20. Kim, D., Salzberg, S. L. TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biol. 12, R72 (2011).
  21. Fernandez-Cuesta, L., et al. Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data. Genome Biol. 16, 7 (2015).
  22. Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions. Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).
  23. Clark, M. B., et al. Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods. 12, 339-342 (2015).
  24. Cieslik, M., et al. The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing. Genome Res. (2015).
  25. Cabanski, C. R., et al. cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples. J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).
  26. Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq. Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).
  27. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15, 419 (2014).

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