धारी परख एक प्रोटीन सब्सट्रेट Dissociated hippocampal न्यूरॉन्स के प्रयोग के आकर्षक या प्रतिकारक गतिविधि का अध्ययन करने के लिए

Neuroscience

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Yamagishi, S., Kesavamoorthy, G., Bastmeyer, M., Sato, K. Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (112), e54096, doi:10.3791/54096 (2016).

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Abstract

Introduction

अक्षतंतु मार्गदर्शन प्रक्रिया है जिसके द्वारा नवगठित न्यूरॉन्स तंत्रिका तंत्र 1,2 के विकास के दौरान अपने लक्ष्य को एक्सोन भेज रहा है। विकासशील एक्सोन उनकी नोक विकास शंकु नामक स्थान पर एक अत्यधिक गतिशील संरचना ले। विकास शंकु अक्षतंतु के पथ नेविगेट करने के लिए बाह्य संकेतों होश। ऐसे भट्ठा, semaphorin के रूप में मार्गदर्शन अणुओं, और ephrins, आकर्षित करने या उपयुक्त रिसेप्टर्स और अक्षतंतु 1,3,4 पर सह रिसेप्टर्स के साथ उनकी बातचीत के आधार पर एक्सोन पीछे हटाना कर सकते हैं। सक्रिय रिसेप्टर्स विकास शंकु कि अक्षतंतु और विकास-कोन आंदोलनों के लिए अपने cytoskeletal संगठन को प्रभावित करने के लिए संकेत हस्तांतरण।

विभिन्न तरीकों attractant और से बचाने वाली क्रीम के अणुओं की कार्रवाई का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया है। केमो-attractants और repellents एक ढाल एकाग्रता के साथ विकास / संस्कृति माध्यम में प्रशासित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए।, डन कक्ष या μ-स्लाइड) माइक्रो-P से 5,6, एक अत्यधिक ध्यान केंद्रित स्थान मेंipette (जैसे।, मोड़ परख) 7 या स्नान आवेदन (जैसे।, विकास शंकु पतन परख) 8,9 द्वारा एक समरूप एकाग्रता में।

अन्य तरीकों एक धारी परख या microcontact मुद्रण (μCP), जिसमें एक केमो-attractant या बचाने वाली क्रीम एक सब्सट्रेट 10-12 के रूप में एक थाली की सतह पर लेपित है शामिल हैं। Thestripe परख मूल रूप से लड़की retino-tectal प्रणाली 13 में स्थलाकृतिक मानचित्रण का विश्लेषण करने के लिए 1987 में Bonhoeffer और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित किया गया था। मूल विधि पॉली कार्बोनेट nucleopore धारीदार और meshed matrices का उपयोग कर झिल्ली पर कोट प्रोटीन के लिए एक निर्वात प्रणाली की आवश्यकता है। बाद के संस्करणों में, पुनः संयोजक प्रोटीन सीधे एक संस्कृति की थाली की सतह पर एक धारीदार पैटर्न में संकीर्ण भट्ठा सिलिकॉन matrices 14,15 का उपयोग कर मुद्रित किया गया। हाल ही में, विभिन्न अनुसंधान समूहों सफलतापूर्वक अक्षतंतु मार्गदर्शन अणु गतिविधियों 16-21 का विश्लेषण करने के लिए इस पट्टी परख आवेदन किया है।

21 पर नियंत्रण की पुनः संयोजक ectodomain की धारियों बारी पर सुसंस्कृत थे। संस्कृति के 24 घंटे के बाद, दोनों एक्सोन और न्यूरॉन्स सेल निकायों जोरदार FLRT2 धारियों से पीछे धकेल दिया गया। एक विरोधी Tau1 एंटीबॉडी के साथ धुंधला से पता चला है कि ~ न्यूरॉन्स की 90% FLRT2-एफसी पर ~ 10% की तुलना में एफसी लेपित क्षेत्रों पर वितरित किए गए, यह दर्शाता है कि FLRT2 एक मजबूत प्रतिकारक हैhippocampal न्यूरॉन्स 21 के लिए कार्य करते हैं।

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Protocol

पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं हमामात्सू विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. Matrices की तैयारी

  1. एक माइक्रोवेव में या 5 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर 4-8 सिलिकॉन matrices उबाल लें और उन्हें लामिना का प्रवाह (धारीदार ऊपर की ओर) के तहत 1 घंटे के लिए पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति देते हैं।
    नोट: निम्न कार्यविधियों लामिना का प्रवाह के तहत किया जाना चाहिए।
  2. संपीड़ित हवा उड़ा या पारदर्शी चिपचिपा टेप का उपयोग matrices की धारीदार की ओर से किसी भी धूल हटाने के लिए। धारीदार पक्ष साफ रखें तो यह मजबूती प्लेट सतह का पालन कर सकते हैं।
  3. ध्यान से एक उंगली (; नीचे पट्टी साइड डिश के प्रति एक मैट्रिक्स) के साथ दबाने से 6 सेमी प्लास्टिक के बर्तन पर matrices जगह है। मैट्रिक्स और पकवान के बीच हवा के बुलबुले हो रही करने से बचें। संस्कृति डिश के नीचे की ओर धारियों के स्थान चिह्नित।
  4. मैट्रिक्स को संलग्न करने में विफल रहता है, तो 1.2 कदम से दोहराएँ।

2. धारी जनरेशन और laminin कोटिंग न्यूरॉन संस्कृति के लिए

  1. fluorescently लेबल पुनः संयोजक प्रोटीन तैयार एफसी टैग प्रोटीन (10-50 माइक्रोग्राम / एमएल) और एक फ्लोरोसेंट dye- मिश्रण से (25 μl इंजेक्शन [2.2 कदम] या 100 μl नियुक्ति की विधि [कदम 2.2.1] के लिए प्रत्येक के लिए प्रत्येक) संयुग्मित विरोधी मानव एफसी एंटीबॉडी (1 से 3 अनुपात: 30-150 माइक्रोग्राम / एमएल) फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में। फिर, आरटी पर 30 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
  2. एक 22-जी सिरिंज का प्रयोग, मैट्रिक्स की ओर छोटे छेद के माध्यम से पिछले चरण (2.1) में तैयार पुनः संयोजक प्रोटीन के 25 μl इंजेक्षन (चित्रा 1 ए, 1 सी में तीर, और 1E)।
    1. वैकल्पिक रूप से, मैट्रिक्स के शीर्ष भट्ठा में पुनः संयोजक प्रोटीन के 100 μl जगह और महाप्राण छोटे से छेद से समाधान के लगभग आधे (चित्रा 1 ए, 1 सी, और 1E में तीर), ताकि पुनः संयोजक प्रोटीन धारीदार क्षेत्रों में रहता है।
  3. 30 मील के लिए पकवान सेतेएक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एन।
  4. शीर्ष भट्ठा (चित्रा 1 बी) और छोटे मैट्रिक्स के किनारे पर स्थित छेद से महाप्राण में पीबीएस के 300 μl की जगह (चित्रा 1 ए, सी और ई में तीर) स्वाधीन पुनः संयोजक प्रोटीन को हटाने के लिए। पीबीएस पूरी तरह से निकालना मत करो, क्योंकि प्रोटीन सूख जाएगा। इस कदम दो बार दोहराएँ। (3 कुल बार)
  5. ध्यान से मैट्रिक्स को हटाने और तुरंत नियंत्रण प्रोटीन की ~ 100 μl जगह (10-50 माइक्रोग्राम / एमएल, एफसी) पूरे धारीदार क्षेत्र को कवर करने के लिए एक वैकल्पिक कोटिंग बनाने। फिर, सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पकवान सेते हैं।
  6. डिश सतह पीबीएस में 20 माइक्रोग्राम / एमएल laminin के 100 μl के साथ, पीबीएस के साथ तीन बार यह कोट धोने ~ के बाद।
    नोट: Laminin solidification को रोकने के लिए बर्फ पर thawed किया जाना चाहिए।
  7. सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पकवान सेते हैं।
  8. पीबीएस के साथ पकवान सतह तीन बार धो और संस्कृति मेडी जोड़नेउम। उपयोग करें जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में मध्यम संस्कृति के साथ लेपित पकवान रखें।

E15.5 माउस भ्रूण से 3. संवर्धन hippocampal न्यूरॉन्स

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से मां euthanize और तीन E15.5 भ्रूण अलग।
  2. sagittally कैंची के साथ सिर के midline पर त्वचा और खोपड़ी में कटौती, और एक छोटा चम्मच का उपयोग कर मस्तिष्क को हटा दें। हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) के 3 मिलीग्राम से युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश के लिए ध्यान से मस्तिष्क स्थानांतरण।
  3. एक छुरी का प्रयोग, प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस और स्ट्रिएटम (2A चित्रा) सहित गोलार्द्धों बाहर काट दिया। फिर, ध्यान से तानिका हटाने के द्वारा हिप्पोकैम्पस क्षेत्र काटना, और, एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र HBSS समाधान के 2 मिलीलीटर युक्त ट्यूब को विच्छेदित हिप्पोकैम्पस ऊतकों हस्तांतरण बर्फ (चित्रा 2 बी-सी) पर। ट्यूब में 3 भ्रूण है, जो 8 व्यंजन में न्यूरॉन्स के लिए पर्याप्त हैं से 6 hippocampi लीजिए।
  4. एच बदलेंtrypsin / EDTA समाधान (2 मिलीलीटर) और एक पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते साथ बीएसएस समाधान।
    नोट: centrifugation बिना महाप्राण HBSS और ट्यूब झुकने से HBSS समाधान छानना नहीं है।
  5. भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 500 μl जोड़कर trypsin गतिविधि बेअसर।
  6. 5 मिनट के लिए 100 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और संस्कृति के माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ गोली धो लें। यह कदम एक बार दोहराएँ।
  7. Pipet hippocampi ऊपर और नीचे संस्कृति के माध्यम से 10 बार में एक बड़ा छेद के साथ 1,000 μl टिप का उपयोग (कट टिप) ऊतक अलग कर देना।
  8. एक नियमित रूप से (काटा हुआ) 1,000 μl टिप करने के लिए बदलने के लिए और अलग ऊतक pipet और नीचे एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए।
  9. एक 80-100 माइक्रोन जाल सेल झरनी के माध्यम से उन्हें गुजर द्वारा एकल कक्षों अलग करें।
  10. 5 मिनट के लिए 150 XG पर छान एकल कक्ष निलंबन अपकेंद्रित्र।
  11. श्वास से सतह पर तैरनेवाला निकालें, और तितर resuspendएट संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर में (न्यूरॉन्स)।
  12. trypan नीले रंग धुंधला के साथ एक hemocytometer का उपयोग घनत्व और व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए कोशिकाओं की गणना। फिर, संस्कृति के माध्यम से 150 μl में 10,000 न्यूरॉन्स की थाली के लिए stripes.The निलंबन के प्रत्येक सेट के ध्यान से पूरे पट्टी क्षेत्र को कवर करने के लिए रखा जाना चाहिए।

4. सेल निकायों और immunofluorescence धुंधला द्वारा Axons एक एंटी-Tau1 एंटीबॉडी का उपयोग करने का दृश्य

  1. संस्कृति के 24 घंटे के बाद, पक्षपाती कोशिकाओं को परेशान करने के बिना मध्यम aspirate, और पूर्व गर्म 4% paraformaldehyde (पीएफए) / 4% sucrose के 15 मिनट के लिए आरटी पर / पीबीएस के साथ न्यूरॉन्स तय कर लो।
  2. पीबीएस के साथ थाली की सतह 3 बार धोएं। अगर वांछित, एंटीबॉडी की जरूरत की राशि को कम करने के धारीदार क्षेत्र के चारों ओर एक चक्र आकर्षित करने के लिए एक पानी repellant कलम का उपयोग करें।
  3. 5 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन X-100 / पीबीएस के साथ न्यूरॉन्स Permeabilize।
  4. अवरुद्ध समाधान 3% गधा सीरम और 0.1% ट्राइटन X-100 के लिए युक्त साथ न्यूरॉन्स सेते30 मिनट के एक विरोधी Tau1 एंटीबॉडी (1: 200) के साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा 1% गधा सीरम में / 0.1% ट्राइटन X-100 / पीबीएस हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. पीबीएस के साथ थाली की सतह 3 बार धोएं। 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) /0.1% ट्राइटन X-100 30 के लिए / पीबीएस मिनट में एक fluorophore संयुग्मित विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी के साथ न्यूरॉन्स सेते हैं।
  6. पीबीएस के साथ थाली की सतह 3 बार धोएं। एक 18 मिमी x 18 मिमी कवर कांच antifade समाधान के 50 μl का उपयोग कर के साथ धारीदार क्षेत्र को कवर किया। हवा के बुलबुले, जो इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप से बचें।
  7. उचित प्रणाली का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, जैसे, X10 उद्देश्य लेंस, फिल्टर सेट GFP और आरएफपी, और 1000-मिसे जोखिम समय (चित्रा 3) के साथ फ्लोरोसेंट छवियों प्राप्त करते हैं।

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Representative Results

E15.5 चूहों से अलग hippocampal न्यूरॉन्स चढ़ाया और धारियों की fluorescently नियंत्रण एफसी (चित्रा 3 ए सी) या FLRT2-एफसी (चित्रा 3 डी-एफ) गैर लेबल नियंत्रण एफसी के साथ बारी लेबल पर 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे। दोनों ही मामलों में, न्यूरॉन्स एकत्रित थे और बंडलों के रूप में उनके एक्सोन बढ़ाया। नियंत्रण एफसी / एफसी धारियों, न्यूरॉन्स fluorescently लेबल और गैर लेबल धारियों पर समान रूप से वितरित किए गए, और वे यादृच्छिक दिशाओं (चित्रा 3 ए सी) में अपने एक्सोन बढ़ाया। इसके विपरीत, जब FLRT-2Fc / एफसी धारियों पर सुसंस्कृत, एक्सोन FLRT2-एफसी क्षेत्रों पर बढ़ती बचा। इस प्रकार, का विस्तार एक्सोन मुख्य रूप से नियंत्रण एफसी (चित्रा 3 डी-एफ) पर स्थित थे। उल्लेखनीय है कि दोनों सेल निकायों और एक्सोन FLRT2-एफसी से पीछे धकेल दिया गया। इस प्रकार, एक्सोन धारियों के लिए समानांतर दिशा में बढ़ाया चित्रा 3 डी '।' - एफ 'से पता चलता है कि एक्सोन के साथ बढ़ीनियंत्रण एफसी और FLRT2-एफसी लेकिन बीच सीमा FLRT2 क्षेत्र में विस्तार नहीं किया था।

आकृति 1
चित्रा 1. सिलिकॉन मैट्रिक्स धारीदार प्रोटीन स्टांप बनाने के लिए इस्तेमाल किया। (ए, बी) सिलिकॉन मैट्रिक्स के शीर्ष दृश्य। मैट्रिक्स का आकार 30 मिमी x 25 मिमी x 5 मिमी है। एक में सफेद तीर एक छोटा सा छेद जहां पुनः संयोजक प्रोटीन इंजेक्ट किया जाता है (2.2 कदम) को इंगित करता है। बी में Arrowhead एक भट्ठा जहां पुनः संयोजक प्रोटीन वैकल्पिक रूप से लागू किया जाता है (कदम 2.2.1)। (सी, डी) सिलिकॉन मैट्रिक्स के नीचे देखने को इंगित करता है। धारीदार क्षेत्र का आकार 7 मिमी x 9 मिमी है। प्रत्येक पट्टी की चौड़ाई 90 मीटर है। तीर एक छोटी नहर के माध्यम से जो पुनः संयोजक प्रोटीन इंजेक्शन है इंगित करता है। (ई) छोटा सा छेद, धारियों, और भट्ठा के बीच संबंध दिखा मैट्रिक्स के midline पर बाण देखने के योजनाबद्ध चित्रण। Arrow में इंगित करता है njection छेद। स्केल सलाखों एसी में 500 माइक्रोन और डी में 200 माइक्रोन हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. माउस हिप्पोकैम्पस के विच्छेदन। (ए) माउस भ्रूण हिप्पोकैम्पस, प्रांतस्था, और स्ट्रिएटम सहित अलग-थलग गोलार्द्धों पर काटने स्थिति (धराशायी लाइन) दिखा मस्तिष्क के शीर्ष दृश्य। (बी, सी) पृथक हिप्पोकैम्पस तानिका हटाने के बाद HBSS में एकत्र किया जाता है। ( डी) न्यूरॉन्स एक 6 सेमी डिश में धारियों पर संवर्धित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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E15.5 चूहों से नियंत्रण एफसी और FLRT2-एफसी और hippocampal न्यूरॉन्स की एक अलग संस्कृति के साथ चित्रा 3. धारी assays। Dissociated hippocampal न्यूरॉन्स नियंत्रण एफसी (एसी) या FLRT2-एफसी (डीएफ) की पट्टियों पर 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे। ( A'-सी ', डी-एफ', 'डी' - एफ '') (एसी, DF, और डी-एफ में बॉक्सिंग क्षेत्रों से बढ़े छवियों '।, क्रमशः) (ए, ए') धारियों उत्पन्न fluorescently एक नियंत्रण प्रयोग के रूप में एफसी (ग्रे) और एफसी (काला) लेबल का उपयोग कर। (डी, डी ',' डी ') fluorescently लेबल FLRT2-एफसी धारियों (ग्रे) एफसी (काला)। (बी, बी', ई के साथ बारी , ई ',' ई ') सेल निकायों और hippocampal न्यूरॉन्स के axons की विरोधी Tau1 एंटीबॉडी धुंधला। (सी, सी', एफ, एफ ', एफ' ') धारियों की छवियों और विरोधी Tau1 धुंधला विलय कर दिया गया। Neurons '(एफ' 'सेल निकायों और एक्सोन जोरदार FLRT2-एफसी एफ, एफ) से पीछे धकेल रहे थे'। ध्यान दें कि एक्सोन सीमा पर बारी और FLRT2-एफसी क्षेत्र (एफ में 'तीर') में प्रवेश नहीं करते .Scale सलाखों के हैं सी, सी में 100 माइक्रोन '' एफ में और 25 माइक्रोन '' एफ, एफ,। कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एक पट्टी परख E15.5 माउस हिप्पोकैम्पस से पुनः संयोजक प्रोटीन और अलग न्यूरॉन्स का उपयोग करता है वर्णन करता है। इस परख ब्याज की एक पुनः संयोजक प्रोटीन एक धारीदार पैटर्न में रखा न्यूरॉन्स की, प्रतिकारक आकर्षक, या तटस्थ प्रतिक्रियाओं के कुशल अवलोकन अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ धारियों, जिसमें प्रोटीन सीधे एक प्लास्टिक पकवान की सतह पर मुद्रित किया जाता है पैदा करने के लिए सरल विधि, पारंपरिक विधि है, जो विशेष matrices, एक निर्वात प्रणाली की आवश्यकता की तुलना में, और एक nucleopore झिल्ली है 20 21। प्रोटीन धारियों बनाने के लिए, लेबल पुनः संयोजक प्रोटीन एक छोटा सा छेद है, या एक बड़ा नमूना (~ 100 μl) मैट्रिक्स के शीर्ष पर भट्ठा में रखा जा सकता है के माध्यम से इंजेक्शन जा सकता है, अतिरिक्त बफर और अपार प्रोटीन से सावधान आकांक्षा द्वारा पीछा किया छेद के माध्यम से।

इस पद्धति का एक और लाभ यह है कि न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या के रूप में देखे जा सकते हैंचिमनी प्रयोग, और कई विकास शंकु एक साथ 21 विश्लेषण किया जा सकता है। इसके विपरीत, एक पारंपरिक मोड़ परख में, केवल एक न्यूरॉन और एकल विकास शंकु कल्पना की है। प्रतिकारक अणु FLRT2 न्यूरॉन्स, जो FLRT2-एफसी धारियों 21 से दूर विस्थापित से लगा है। हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) की तरह एक संवाददाता अणु उन्हें कालीन रंग के खिलाफ कल्पना और immunostaining के लिए आवश्यकता के बिना वास्तविक समय अवलोकन अनुमति देने के लिए न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जा सकता है। ध्वज की तरह अन्य टैग, Myc, और उनके एफसी टैग के बजाय प्रयोग किया जा सकता है, और पहचान उचित fluorescently लेबल विरोधी टैग एंटीबॉडी (2.1 कदम) के साथ। कुछ उच्च हाइड्रोफोबिक प्रोटीन आत्म-एकत्रीकरण की वजह से उचित धारी नहीं कर सकता। इसके अलावा, आकर्षण और दो ​​अलग अलग लक्ष्य प्रोटीन के बीच प्रतिकर्षण के रिश्तेदार कार्रवाई नियंत्रण एफसी धारी 20 के लिए एक दूसरे लक्ष्य प्रोटीन प्रतिस्थापन से तुलना की जा सकती।

सेवा मेरेन्यूरॉन्स की व्यवहार्यता में वृद्धि, enzymatic पाचन समय और trypsin अवरोध में समायोजन की जरूरत हो सकती है। न्यूरॉन्स के अस्तित्व के अनुपात से कम है, तो trypsin की एकाग्रता कमजोर या enzymatic पाचन समय कम। इनक्यूबेटर की नमी का स्तर संस्कृति अवधि के दौरान पूरी प्रणाली में वाष्पीकरण प्रेरित आसमाटिक दबाव से बचने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए।

डिश के लिए मैट्रिक्स के आसंजन अच्छा धारियों की तैयारी के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। एक बेतरतीब धारी पैटर्न में पकवान सतह परिणाम के लिए अनुचित पालन। हालांकि, कोशिकाओं और सब्सट्रेट की एकाग्रता का घनत्व भी एक सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस पट्टी में एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता एक अणु जिसका प्रतिकारक या आकर्षक गतिविधि अज्ञात है विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है। हालांकि हम इस प्रोटोकॉल अलग प्राथमिक न्यूरॉन्स का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया है, यह भी organotypic explant संस्कृतियों 15 के लिए लागू है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Violamo  1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA) Nacalai 01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody Thermo Scientific A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody Thermo Scientific A-21203 Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody Chemicon MAB3420 Dilution 1/200
Antifade Thermo Scientific P7481 Alternative mounting media may be used
B27 supplement Thermo Scientific 17504-044 Dilution 1/50
Bovine serum albumin Sigma 01-2030-2
Cell strainer 100 um BD Falcon 352360
Centrifugation machine Kubota 2410
Cover glass 18mmx18mm Matsunami 18x18 mm No. 1
DAKO pen DAKO S2002 Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel Feather 2975#11
FBS Thermo Scientific 10437-028
Fluorecent microscope Nikon E600
Forceps No. 5 Fine Science Tools 11254-20
GlutaMAX Thermo Scientific 35050-061 Dilution 1/100
Hamilton Syringe Hamilton 805N 22 gauge, 50 uL
HBSS Thermo Scientific 14170-112
Human IgG, Fc Fragment Jackson 009-000-008
Laminin Thermo Scientific 23017-015
Neurobasal Thermo Scientific 21103-049
Normal Donkey Serum Jackson 017-000-121
PBS Nacalai 14249-24
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063 Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm Thermo Scientific 150288
Silicone Matrices Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope Olympus SZ61
Tip, 1000 uL Watson 125-1000S
Transparent sticky tape Tesa 57315 Alternative sticky tape may be used
Triton X-100 Sigma T8787
Trypan blue, 0.4% Bio-Rad 145-0013
Trypsin/EDTA Thermo Scientific 25300-054
Culture medium Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.

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References

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