Çizgili Deneyi Disosiye Hipokampal Nöronlar kullanarak Protein Substrat çekici veya itici Aktivite Eğitim için

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yamagishi, S., Kesavamoorthy, G., Bastmeyer, M., Sato, K. Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (112), e54096, doi:10.3791/54096 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Akson rehberlik yeni oluşan nöronlar sinir sistemi 1,2 geliştirilmesi sırasında hedef aksonları göndermek süreçtir. Gelişmekte olan aksonlar büyüme konisinin denilen kendi ucunda son derece hareketli yapısını taşıyacak. büyüme konisinin aksonun yolunu gezinmek için hücre dışı ipuçları algılar. Rehberlik gibi yarık, semaforin'in olarak moleküller, ve ephrins, çekmek ya da akson 1,3,4 üzerinde uygun reseptörleri ve ko-reseptörleri ile etkileşim bağlı olarak aksonlar dağılmasına neden olabilir. aktive reseptörler akson ve büyüme konisi hareketler için onun iskelet organizasyonunu etkileyen büyüme konisinin sinyalleri aktarmak.

Çeşitli yöntemler, çekici madde ve itici moleküllerin etkisini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Kemo-çekiciler ve kovucular bir degrade konsantrasyonuna sahip büyüme / kültür ortamı içine uygulanabilir (örn., Dunn odası veya μ-slaytlar) mikro-p yüksek konsantrasyonlu noktada 5,6,ipette (örn., torna deneyi) 7 ya da banyo uygulaması (örn., büyüme konisi çöküşü deneyi) 8,9 ile homojen bir konsantrasyonda.

Diğer yöntemler, bir kemo-çekici ya da kovucu bir alt-tabaka 10-12 kadar bir plaka yüzeyi üzerinde kaplandığı bir şerit deneyi ya microcontact baskı (μCP) içerir. Thestripe tahlil başlangıçta civciv retino-tectal sisteminde 13 topografik haritalama analiz etmek 1987 yılında Bonhoeffer ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. Orijinal yöntem çizgili ve örgülü matrisleri kullanarak polikarbon Nucleopore membranlar üzerine kaplama proteinlerine bir vakum sistemi gereklidir. Sonraki sürümlerinde, rekombinant proteinleri doğrudan dar yarık silikon matrisler 14,15 kullanarak çizgili desen bir kültür plaka yüzeyinde basıldı. Son zamanlarda, çeşitli araştırma grupları başarıyla akson rehberlik molekül faaliyetleri 16-21 analizine bu şerit tahlil uyguladık.

21 kontrol rekombinant ekto şeritler alternatif kültüre edildi ayrışmış. Kültür 24 saat sonra, akson ve nöronların hücre gövdeleri hem güçlü FLRT2 çizgili itilir edildi. Bir anti-Tau1 antikorla boyama FLRT2 itici güçlü olduğunu göstermektedir, nöronların% 90 FLRT2-Fc ile ~% 10 ile karşılaştırıldığında, Fc kaplı bölgelere nm yayıldığını gösterdihipokampal nöronlar 21 işlevi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan denekleri Prosedürleri Tıp Hamamatsu Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

Matris 1. Hazırlık

  1. Bir mikrodalga fırında ya da 5 dakika boyunca sıcak bir plaka üzerinde 4-8 silikon matris kaynatın ve onları laminer akış (çizgili yüzü yukarı) altında 1 saat boyunca tamamen kurumasını bekleyin.
    Not: Aşağıdaki prosedürler laminer akış altında yapılmalıdır.
  2. basınçlı hava üfleyin veya matrislerin çizgili tarafında herhangi bir tozu çıkarmak için şeffaf yapışkan bant kullanın. temiz çizgili tarafı tutmak bu yüzden sıkıca levha yüzeyine yapışabilir.
  3. Dikkatle bir parmak (; şerit tarafı aşağı çanak başına bir matrisin) ile bastırarak 6 cm plastik tabaklar üzerine matrisler yerleştirin. matris ve çanak arasındaki hava kabarcıkları kaçının. kültür çanak alt tarafında şeritler konumunu işaretleyin.
  4. matris eklemek için başarısız olursa, adım 1.2 tekrarlayın.

Nöron Kültürü 2. Çizgili Üretimi ve Laminin Kaplama

  1. floresan etiketli bir araya getiren proteini hazırlamak Fc-etiketli protein (10-50 ug / ml) ve bir flüoresan dye- karıştırılarak (25 ul enjeksiyon [Aşama 2.2] ya da 100 ul yerleşim yöntemi [Aşama 2.2.1] için her biri için her biri) konjüge edilmiş anti-insan Fc antikoru (1 oran 3: 30-150 ug / ml) fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe karışımı.
  2. 22-G şırınga kullanarak, matrisin tarafında küçük bir delikten geçen basamak (2.1) 'de hazırlanan yeniden birleştirici proteinin 25 ul enjekte (Şekil 1A, 1C'de oklar ve 1 E).
    1. Seçenek olarak ise, matrisin üst açıklığına yeniden birleştirici proteinin 100 ul koyun ve çok küçük delikten çözeltisi aspire yaklaşık yarısı (Şekil 1A, 1C ve 1E oklar), yeniden birleştirici proteinin çizgili bölgelerinde kalır.
  3. 30 mi için çanak inkübebir hücre kültür inkübatörü içinde 37 ° C de n.
  4. Matrisin tarafında bulunan küçük bir delikten üst yarık (Şekil 1B) ve aspirat içine PBS 300 ul yerleştirin (Şekil 1A, C ve E oklar) bekâr rekombinant proteinleri uzaklaştırmak için. proteinler kuruyacak, çünkü tamamen PBS aspire etmeyin. İki kez bu adımı yineleyin. (3 kez toplam)
  5. Alternatif bir kaplama oluşturma tüm şerit alanı kapsayacak şekilde, (Fc 10-50 ug / ml) dikkatli bir şekilde kontrol proteini ~ 100 ul yeri hemen matrisini ve. Daha sonra, hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 30 dakika süreyle etiketlenir inkübe edin.
  6. PBS içinde ~ ile birlikte, bulaşık yüzeyi ile 20 ug / ml laminin 100 ul PBS ile üç kez, kapla yıkanmasından sonra.
    Not: Laminin katılaşmasını önlemek için buz üzerinde çözdürülmelidir.
  7. Hücre kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de 1 saat süre ile çanak inkübe edin.
  8. PBS ile çanak Yüzeye üç kez yıkayın ve kültür medi ekleyinum. Kullanılana kadar 37 ° C'de bir% 5 CO2 inkübatörde kültür ortamı ile kaplanmış bir tabak yerleştirin.

E15.5 Fare Embriyolar 3. Kültürleme Hipokampal Nöronlar

  1. servikal dislokasyon ile anne Euthanize ve üç E15.5 embriyolar izole.
  2. sagittally makas ile baş orta hatta deri ve kafatası kesin ve küçük bir kaşık kullanarak beyin kaldırmak. Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 3 ml ihtiva eden bir 60 mm Petri kabı dikkatlice beyin aktarın.
  3. Bir neşter kullanılarak, korteks, hipokampus ve striatum (Şekil 2A) de dahil olmak üzere hemisfer kesip. Daha sonra, dikkatli bir şekilde meninks kaldırarak hipokamp bölgesinin teşrih ve buz (Şekil 2B-C), HBSS çözeltisi 2 ml ihtiva eden bir 15-ml santrifüj tüpüne parçalara hipokampal dokuların aktarın. 8 tabağın nöronları kültürünün oluşturulması için yeterli olan bir tüp içinde 3 embriyolar, 6 hipokampları toplayın.
  4. H Değiştirtripsin / EDTA solüsyonu (2 mi) ve bir su banyosu içinde 15 dakika boyunca 37 ° C'de tüp inkübe ile BSS çözeltisi.
    Aspire HBSS santrifüj olmadan ve tüp eğerek HBSS çözüm süzün yok: Not.
  5. fetal sığır serumu (FBS), 500 ul ekleyerek tripsin aktivitesi etkisiz hale getirir.
  6. 5 dakika boyunca 100 x g'de karışımı santrifüjleyin. Süpernatantı ve kültür ortamına 2 ml pelet yıkayın. bir kez daha bu adımı yineleyin.
  7. Pipetleyin büyük bir delik ile 1.000 ul ucu kullanarak kültürü ortamında yukarı ve aşağı hippocampi 10 kez doku ayırmak (-ucu kesilmiş).
  8. Bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için aşağı düzenli (kesilmemiş) 1000-ul ucu değiştirin ve ayrışmış doku yukarı pipetlemeyin ve.
  9. Bir 80-100 mikron örgü hücre süzgecinden geçirerek tek hücre ayırın.
  10. 5 dakika boyunca 150 xg'de süzülür tek bir hücre süspansiyonu santrifüj.
  11. aspire Süpernatantı ve pell tekrar süspansiyonve kültür ortamının 2 ml (nöronlar).
  12. yoğunluk ve yaşama kabiliyetinin saptanması için tripan mavi boyama ile bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. stripes.The süspansiyonu, her resim grubu dikkatle tüm şerit bölgeyi kapsayacak şekilde yerleştirilmelidir daha sonra, kültür ortamı 150 ul 10.000 nöronlar plaka.

Anti-Tau1 Antikor kullanılarak Hücre Organları ve İmmünofloresan Boyama tarafından Aksonlar 4. Görselleştirme

  1. kültür, 24 saat sonra, yapışkan hücreleri bozmadan orta aspire ve önceden ısıtılmış% 4 paraformaldehit (PFA) /% 4 sakroz, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında / PBS ile nöronların düzeltin.
  2. PBS ile plaka Yüzeye 3 kere yıkayın. İstenirse, gerekli antikor miktarını azaltmak için çizgili bölgenin etrafında bir daire çizmek için bir su itici kalem kullanın.
  3. 5 dakika için% 0.3 Triton X-100 / PBS ile nöronlar geçirgenliği.
  4. % 3 eşek serumu ve% 0.1 Triton X-100 ihtiva eden bloklama çözeltisi ile nöronların inkübe4 ° C 'de% 1 eşek serumu içinde /% 0.1 Triton X-100 / PBS O / N: bir anti-Tau1 antikoru (200 1) ile kuluçkalandı ve ardından 30 dk.
  5. PBS ile plaka Yüzeye 3 kere yıkayın. % 1 sığır serum albümini (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS ile 30 dakika için bir florofor konjuge edilmiş anti-fare IgG antikoru ile nöronların inkübe edin.
  6. PBS ile plaka Yüzeye 3 kere yıkayın. antifade çözüm 50 ul kullanarak 18 mm x 18 mm cam kapak ile çizgili bölgeyi kaplayın. görüntüleme ile müdahale hava kabarcıkları, kaçının.
  7. GFP ve RFP ve 1000-msn pozlama süresi (Şekil 3) için, örneğin uygun sistemi kullanılarak floresan mikroskop, x10 objektif lens, filtre setleri ile floresan görüntüleri elde edebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

E15.5 farelerde ayrışmış hipokampal nöronlar kaplandı ve floresan kontrol Fc (Şekil 3A-C) veya etiketli olmayan kontrol Fc ile sırayla değişen FLRT2-Fc (Şekil 3B-F) etiketli çizgili 24 st için kültürlenmiştir. Her iki durumda da, nöronlar toplanmış ve demetler halinde bunların aksonları genişletilmiş. Kontrol Fc / Fc şeritler, nöronlar floresan etiketli ve etiketsiz çizgili eşit olarak dağıtıldı ve rastgele yönde (Şekil 3A-C) aksonları genişletilmiş. Buna karşılık, ne zaman FLRT-2FC / Fc çizgili kültüre, aksonlar FLRT2-Fc bölgelerinde büyüyen kaçınılmalıdır. Böylece, uzanan aksonlar özellikle kontrol Fc (Şekil 3D-F) üzerinde bulunan bulundu. Özellikle, hücre gövdeleri ve aksonlar hem FLRT2-Fc uzaklaştırılacaktır bulundu. Bu nedenle, aksonlar şeritlere paralel bir yönde uzatılmış Şekil 3D. '' - F 'aksonları boyunca büyüdüğünü göstermektedirKontrol Fc ve FLRT2-Fc ancak arasındaki sınır FLRT2 topraklarına genişletmek vermedi.

Şekil 1
Şekil 1. Silikon Matrix çizgili protein damgası oluşturmak için kullanılır. Silikon matris (A, B) Üstten görünüm. matrisin boyutu, 30 mm x 25 mm x 5 mm olan. A beyaz ok rekombinant protein enjekte edilir küçük bir delik (adım 2.2) gösterir. B ok ucu rekombinant protein, alternatif olarak uygulanan bir yarık (aşama 2.2.1). (C, D), silikon matris alt görünüşüdür gösterir. Çizgili bölgesinin boyutu x 9 mm 7 mm'dir. Her şerit genişliği 90 mm. Ok Rekombinant protein enjekte edildiği bir küçük bir kanala gösterir. (E) küçük bir delik, çubuk ve yarık arasındaki bağlantıyı gösteren matrisin orta hat sajital görünümü şematik gösterimi. Ok i gösterir njection delik. Ölçek çubukları AC 500 mikron ve D 200 mikron olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Fare hipokampus Şekil 2. Diseksiyon. (A) hipokampus, korteks ve striatum dahil izole hemisfer üzerinde kesme pozisyonu (kesikli çizgi) gösteren fare embriyonik beyin Üstten görünüm. (B, C) ​​izole hipokampus meninksler çıkardıktan sonra HBSS toplanır. ( D) Nöronlar 6 cm'lik çanak çizgili üzerinde yetiştirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ftp_upload / 54096 / 54096fig3.jpg "/>
Kontrol Fc ve FLRT2-Fc ve hipokampal nöronlar ayrışık kültürü Şekil 3 şerit tahlilleri. Disosiye hipokampal nöronlar E15.5 fareler kontrol Fc (AC) veya FLRT2-Fc (DF) sahiptir çizgili 24 st için kültürlenmiştir. ( A'-C 'D'-F' D '' - F '') (AC, DF ve D'-F kutulu bölgelerden Genişletilmiş görüntüler '. sırasıyla) (A, A') Stripes oluşturulan floresan bir kontrol deneyi olarak Fc (gri) ve Fc (siyah) etiketli kullanarak. (D, D ', D' ') floresan etiketli FLRT2-Fc çizgili (gri) Fc (siyah). (B, B', E ile dönüşümlü E ', E' ') hücre gövdeleri ve hipokampal nöronların akson anti-Tau1 antikor boyama. (C, C, F, K, F' ') çizgili görüntüleri ve anti-Tau1 boyama birleştirilmiştir. neurons '(F' 'hücre gövdeleri ve aksonlar şiddetle FLRT2-Fc F, F) uzaklaştırılacaktır edildi'. '' F ve 25 mikron ', F, F' .Scale çubukları C, C 100 mikron olan aksonlar sınırında açmak ve FLRT2-Fc toprakları ( 'F ok başları)' girmeyin unutmayın. Tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol E15.5 fare hipokampus rekombinant protein ve ayrışmış nöronlar kullanan bir şerit deneyi anlatır. Bu deney, bir çizgili kalıp yerleştirilir ilgi konusu bir rekombinant proteinin nöronların, itici, çekici, ya da nötr yanıtların etkin gözlem sağlar. Bu protokolün bir büyük avantajı, özel matrisleri, bir vakum sistemi gerektirir, geleneksel yönteme kıyasla bir protein ile doğrudan plastik bir kaba yüzeyi üzerine yazdırılma şeritler, üretilmesi için basit bir yöntem ve bir Nucleopore membran 20 21. Protein şeritleri yapmak için etiketli rekombinant protein aşırı tampondan ve bağlanmamış protein dikkat aspirasyon, ardından küçük bir delik veya daha büyük bir numune (~ 100 ul) matrisin üzerine yarık yerleştirilebilir yoluyla enjekte edilebilir delikten.

Bu yöntemin diğer bir avantajı, nöron sayıda olarak görselleştirilebilir olmasıdıringle deney ve birçok büyüme konileri aynı anda 21 analiz edilebilir. Bunun aksine, geleneksel bir dönüm tahlilinde, sadece tek bir nöron, bir büyüme konisi görüntülenmiştir. Itici molekül FLRT2 FLRT2-Fc çizgili 21 uzağa göç nöronlar tarafından algılanır. Yeşil floresan proteini (GFP) veya kırmızı flöresanlı proteindir (RFP) gibi bir haberci molekülü halı rengine karşı görselleştirmek ve immün gerek kalmadan, gerçek zamanlı gözlem izin vermek için nöronlarda ifade edilebilir. FLAG gibi diğer etiketler, Myc ve O'nun uygun floresan etiketli anti-tag antikoru (adım 2.1) ile yerine Fc etiketi kullanılabilir ve tespit edilebilir. Bazı yüksek hidrofobik proteinler nedeniyle kendini toplama uygun şerit yapamazsınız. Bundan başka, bir çekim ve iki farklı hedef proteinleri arasındaki itme nispi işlem kontrol Fc şerit 20 için bir ikinci hedef proteini değiştirilmesi ile karşılaştırılabilir.

içinnöronların canlılığını geliştirmek, enzimatik sindirim, zaman ve tripsin önleme ayarlamalar gerekebilir. nöronların hayatta kalma oranı düşük ise, tripsin seyreltilmesi veya enzimatik sindirim süresini kısaltır. kuluçka nem oranı kültürü süresi boyunca tam bir sistem buharlaşma kaynaklı ozmotik basıncı önlemek için muhafaza edilmelidir.

çanak matris yapışması iyi şeritler hazırlanması için önemli bir faktördür. dağınık bir şerit deseni bulaşık yüzey sonuçlarına uygunsuz bağlılık. Bununla birlikte, hücreler ve alt-tabaka konsantrasyonu yoğunluğu da başarılı bir deney için önemlidir. şerit içerisinde daha yüksek protein konsantrasyonu olan itici veya çekici aktivite bilinmeyen bir molekülü analiz etmek için önerilmektedir. Bu ayrışmış primer nöronlar bu protokol göstermiştir, ancak, aynı zamanda Organotipik eksplant kültürlerinde 15 için de geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Violamo  1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA) Nacalai 01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody Thermo Scientific A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody Thermo Scientific A-21203 Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody Chemicon MAB3420 Dilution 1/200
Antifade Thermo Scientific P7481 Alternative mounting media may be used
B27 supplement Thermo Scientific 17504-044 Dilution 1/50
Bovine serum albumin Sigma 01-2030-2
Cell strainer 100 um BD Falcon 352360
Centrifugation machine Kubota 2410
Cover glass 18mmx18mm Matsunami 18x18 mm No. 1
DAKO pen DAKO S2002 Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel Feather 2975#11
FBS Thermo Scientific 10437-028
Fluorecent microscope Nikon E600
Forceps No. 5 Fine Science Tools 11254-20
GlutaMAX Thermo Scientific 35050-061 Dilution 1/100
Hamilton Syringe Hamilton 805N 22 gauge, 50 uL
HBSS Thermo Scientific 14170-112
Human IgG, Fc Fragment Jackson 009-000-008
Laminin Thermo Scientific 23017-015
Neurobasal Thermo Scientific 21103-049
Normal Donkey Serum Jackson 017-000-121
PBS Nacalai 14249-24
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063 Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm Thermo Scientific 150288
Silicone Matrices Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope Olympus SZ61
Tip, 1000 uL Watson 125-1000S
Transparent sticky tape Tesa 57315 Alternative sticky tape may be used
Triton X-100 Sigma T8787
Trypan blue, 0.4% Bio-Rad 145-0013
Trypsin/EDTA Thermo Scientific 25300-054
Culture medium Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, (5600), 1959-1964 (2002).
  2. Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (5), 001941 (2010).
  3. Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403, (6765), 93-98 (2000).
  4. Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29, (2), 441-452 (2001).
  5. Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32, (15), 5209-5215 (2012).
  6. Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185, (10), 6294-6305 (2010).
  7. Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133, (7), 1241-1254 (2008).
  8. Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184, (5), 737-750 (2009).
  9. Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47, (4), 515-528 (2005).
  10. von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. (2007).
  11. Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269, (5224), 664-666 (1995).
  12. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
  13. Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
  14. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2, (5), 1216-1224 (2007).
  15. Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
  16. Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10, (7), 736-741 (2009).
  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139, (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138, (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84, (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30, (14), 2920-2933 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics