Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yamagishi, S., Kesavamoorthy, G., Bastmeyer, M., Sato, K. Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (112), e54096, doi:10.3791/54096 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

הדרכת האקסון היא התהליך שבו הנוירונים שהוקם זה עתה לשלוח אקסונים אל היעד שלהם במהלך פיתוח של 1,2 מערכת העצבים. אקסונים פיתוח לשאת מבנה ניע מאוד בקצהו שלהם שנקרא חרוט צמיחה. חרוט הצמיחה החושים רמזים תאיים לנתב את הדרך של האקסון. מולקולות הנחיה, כגון חתך, semaphorin, ו ephrins, יכולים למשוך או לדחות אקסונים תלוי האינטראקציה שלהם עם קולטנים מתאימים-קולטנים שיתוף על האקסון 1,3,4. הקולטנים מופעלים להעביר אותות אל חרוט הצמיחה המשפיעים ארגון cytoskeletal שלה לתנועות האקסון וצמיחה חרוטה.

שיטות שונות פותחו כדי להעריך את הפעולה של מולקולות attractant ודוחה. חמו-משיכה ודוחים יכול להינתן לתוך מדיום הגידול / תרבות עם ריכוז שיפוע (למשל., קאמרית או μ-מגלשות דאן) 5,6, במקום מרוכז מאוד על ידי מיקרו-p ipette (למשל., assay מפנה) 7 או בריכוז הומוגנית ידי יישום אמבטיה (למשל., assay קריסת צמיחה חרוט) 8,9.

שיטות אחרות כוללות assay פס או הדפסת microcontact (μCP), שבו attractant הכימותרפיה או דוחה מצופה על פני השטח של צלחת כמו מצע 10-12. Thestripe assay פותחה במקור על ידי בונהופר ועמיתיו בשנת 1987 לנתח מיפוי טופוגרפי במערכת retino-tectal חומוס 13. השיטה המקורית נדרש שואב אבק לחלבונים מעיל על ממברנות פוליקרבונט nucleopore באמצעות פסים ומטריצות מרושת. בגירסאות מתקדמות יותר, חלבונים רקומביננטיים הודפסו ישירות על פני השטח של צלחת תרבות בדפוס פסים באמצעות 14,15 מטריצות סיליקון פתח צר. לאחרונה, קבוצות מחקר שונות יישמו בהצלחה assay פס זה ניתוח של פעילות מולקולה הדרכה האקסון 16-21.

ss = "jove_content"> כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור assay פס המודד את למשיכה או לדחיה של מולקולות האקסון הדרכה עבור נוירונים בהיפוקמפוס ניתק. יש לציין, שיטה זו יכולה להיות מיושמת במסגרות מעבדה מצוידות מינימאלי. עבור assay זה, פסים מתחלפים של מצע שכותרתו fluorescently ו חלבון בקרה מופקים על צלחת פלסטיק באמצעות מטריצת סיליקון עם חריצי 90 מיקרומטר ומצופי laminin. בהפגנה שלנו, ניתק נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים E15.5 היו בתרבית על לסירוגין פסים של ectodomain רקומביננטי של פיברונקטין ו לאוצין עשיר הטרנסממברני חלבון-2 (FLRT2) ולשלוט Fc חלבון 21. לאחר 24 שעות של תרבות, הן אקסונים גופי התא של הנוירונים נהדפו מאוד מן פסים FLRT2. צביעה עם נוגדן אנטי Tau1 גילה כי כ -90% של נוירונים חולקו על אזורים מצופה Fc, לעומת כ -10% על FLRT2-FC, המציין כי FLRT2 יש חזקה דוחהפונקציה עבור נוירונים בהיפוקמפוס 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש בבית הספר אוניברסיטת Hamamatsu לרפואה.

1. הכנת מטריצות

  1. מרתיחים 4-8 מטריצות סיליקון במיקרוגל או על פלטה חשמלית במשך 5 דקות ולאפשר להם להתייבש לחלוטין עבור h 1 תחת זרימה למינרית (צד פסים למעלה).
    הערה: ההליכים הבאים יש לבצע תחת זרימה למינרית.
  2. לפוצץ אוויר דחוס או להשתמש סרט דביק שקוף כדי להסיר כל אבק מצד הפסים של המטריצות. שמור את צד הפסים נקיים אז זה בתקיפות יכול לדבוק פני הצלחת.
  3. בזהירות את מטריצות על צלחות פלסטיק 6 ס"מ על ידי לחיצה באצבע (מטריצה ​​אחד לכל צלחת; פס בצד למטה). להימנע מקבלת בועות אוויר בין מטריקס ואת המנה. סמן את מיקומו של הפסים בצד התחתון של מנת התרבות.
  4. אם המטריצה ​​נכשלה לצרף, וחזור משלב 1.2.

דור Stripe 2. Laminin ציפוי לתרבות Neuron

  1. הכן שכותרתו fluorescently חלבון רקומביננטי (25 μl כל להזרקה [שלב 2.2] או 100 μl כל לשיטת מיקום [צעד 2.2.1]) על ידי ערבוב של חלבון Fc-tagged (10-50 מיקרוגרם / מ"ל) ו dye- ניאון אנטי אנושי מצומדות נוגדנים Fc (1 עד 3 יחס: 30-150 מיקרוגרם / מ"ל) ב בופר פוספט (PBS). ואז, דגירה את התערובת למשך 30 דקות ב RT.
  2. באמצעות מזרק 22-G, להזריק 25 μl של חלבון רקומביננטי מוכן בשלב הקודם (2.1) דרך חור קטן בצד של מטריקס (חיצים באיור 1A, 1C, ו 1E).
    1. לחלופין, במקום 100 μl של חלבון רקומביננטי לתוך החריץ העליון של מטריקס לשאוב כמחצית הפתרון מהחור הקטן (חיצים באיור 1A, 1C, ו 1E), כך חלבון רקומביננטי נשאר באזורי הפסים.
  3. דגירת הצלחת עבור 30 מיליםn ב 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאים.
  4. מניח 300 μl של PBS לתוך החריץ העליון (איור 1 ב ') ואת לשאוב מהחור הקטן הממוקם בצד של מטריקס (חיצים באיור 1A, C ו- E) כדי להסיר חלבונים רקומביננטיים פנויים. אין לשאוב את PBS לחלוטין, משום שהחלבונים יתייבשו. חזור על פעולה זו פעמיים. (3 פעמים בסך הכל)
  5. מוציאים בזהירות את מטריקס ומיד למקם ~ 100 μl של חלבון בקרה (10-50 מיקרוגרם / מ"ל; Fc) כדי לכסות את האזור כולו פסים, יצירת ציפוי חלופי. לאחר מכן, דגירת הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים.
  6. לאחר שטיפת משטח צלחת שלוש פעמים עם PBS, לצפות אותו ~ 100 μl של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​laminin ב PBS.
    הערה: Laminin צריך להיות מופשר על הקרח כדי למנוע התמצקות.
  7. דגירת הצלחת של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים.
  8. שטפו את פני השטח צלחת שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף Medi תרבותאממ. מניח את הצלחת המצופית עם מדיום תרבות חממה 5% CO 2 ב 37 ° C עד שימוש.

3. נוירונים בהיפוקמפוס Culturing מ E15.5 עכבר עוברים

  1. להרדים אמא באמצעות נקע בצוואר הרחם ולבודד שלושה E15.5 עוברים.
  2. חותכים את עור הגולגולת sagittally על קו האמצע של הראש עם מספריים, ולהסיר את המוח בעזרת כף קטנה. מעביר את המוח בזהירות לצלחת 60 מ"מ פטרי המכילה 3 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS).
  3. באמצעות אזמל, לחתוך את ההמיספרות כולל קליפה, ההיפוקמפוס בסטריאטום (איור 2 א). לאחר מכן, לנתח את אזור בהיפוקמפוס על ידי הסרת קרומי המוח בזהירות, ולהעביר את רקמות בהיפוקמפוס גזור לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של תמיסת HBSS, על הקרח (איור 2 ב-ג). אסוף 6 hippocampi מן 3 עוברים בצינור, אשר מספיקים culturing נוירונים 8 מנות.
  4. החזר את Hפתרון BSS עם פתרון טריפסין / EDTA (2 מ"ל) ו דגירה צינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות באמבט מים.
    הערה: לשאוב HBSS ללא צנטריפוגה ואינו למזוג פתרון HBSS על ידי הטיית הצינור.
  5. לנטרל את פעילות טריפסין על ידי הוספת 500 μl של בסרום שור העוברי (FBS).
  6. צנטריפוגה את התערובת על 100 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 2 מ"ל של מדיום תרבות. חזור על פעולה זו פעם נוספת.
  7. Pipet hippocampi למעלה ולמטה 10 פעמים במדיום תרבות באמצעות קצה 1,000 μl עם חור גדול (לחתוך קצה) כדי לנתק את הרקמה.
  8. שנה עד קצה 1,000 μl רגיל (נימול) ו pipet למעלה רקמות הניתקות ולמטה כדי לקבל השעית תא בודד.
  9. הפרד את התא הבודד על ידי העברת אותם באמצעות מסננת תא רשת 80-100 מיקרומטר.
  10. צנטריפוגה השעית התא הבודדה המסוננת ב XG 150 במשך 5 דקות.
  11. הסר את supernatant על ידי aspirating, ו resuspend פלet (נוירונים) ב 2 מ"ל של מדיום תרבות.
  12. ספירת התאים באמצעות hemocytometer עם מכתים trypan הכחול כדי לקבוע את הצפיפות ואת הכדאיות. לאחר מכן, צלחת 10,000 נוירונים 150 μl של מדיום התרבות עבור כל קבוצה של השעית stripes.The צריכה להיות ממוקמות היטב על מנת לטייח באזור הפס כולו.

ויזואליזציה 4. Cell גופות אקסונים ידי Immunofluorescence מכתים באמצעות נוגדן אנטי Tau1

  1. לאחר 24 שעות של תרבות, לשאוב את המדיום מבלי להפריע את התאים החסידים, ולתקן את הנוירונים עם paraformaldehyde מחומם מראש 4% (PFA) / 4% סוכרוז / PBS ב RT במשך 15 דקות.
  2. שטוף את פעמי צלחת המשטח 3 עם PBS. אם תרצה, להשתמש בעט מים ודוחה לצייר עיגול סביב אזור הפסים כדי להקטין את כמות הנוגדנים הצורכות.
  3. Permeabilize הנוירונים עם 0.3% Triton X-100 / PBS במשך 5 דקות.
  4. דגירה הנוירונים עם פתרון חסימה המכיל סרום 3% חמורים 0.1% Triton X-100 טובים30 דקות ואחריו הדגירה עם נוגדן אנטי Tau1 (1: 200) בסרום חמור 1% / 0.1% Triton X-100 / PBS O / N ב 4 ° C.
  5. שטוף את פעמי צלחת המשטח 3 עם PBS. דגירה הנוירונים עם נוגדן fluorophore מצומדות אנטי עכבר IgG ב אלבומין 1% שור (BSA) /0.1% טריטון X-100 / PBS למשך 30 דקות.
  6. שטוף את פעמי צלחת המשטח 3 עם PBS. מכסה את אזור פסים עם מכסה זכוכית 18 מ"מ x 18 מ"מ באמצעות 50 μl של antifade פתרון. למנוע בועות אוויר, אשר להפריע הדמיה.
  7. להשיג תמונות ניאון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המערכת המתאימה, למשל, עדשה אובייקטיבית x10, מערכות סינון עבור GFP ו RFP, וזמן חשיפה של 1,000 מילים-שניות (איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נוירונים בהיפוקמפוס ניתקו מעכברי E15.5 היו מצופים ותרבותי במשך 24 שעות על פסים של שכותרתו fluorescently Fc ביקורת (איור 3A-C) או FLRT2-FC (איור 3D-F) לסירוגין עם Fc שליטה הלא מסומן. בשני המקרים, הנוירונים היו מצטברים והאריכו האקסונים שלהם כמו צרורות. בשלט Fc / פסים Fc, הנוירונים חולקו באופן שווה על שכותרתו fluorescently ופסים אי שכותרתו ושם האריכו האקסונים שלהם בכיוונים אקראיים (איור 3A-C). לעומת זאת, כאשר בתרבית על פסי FLRT-2Fc / Fc, האקסונים להימנע גדלו על אזורי FLRT2-FC. לפיכך, אקסונים הארכת אותרו בעיקר על Fc הביקורת (איור 3D-F). יש לציין, הן את גופי התא אקסונים נהדפו מן FLRT2-FC. לפיכך, האקסונים מורחבים בכיוון במקביל פסי האיור 3D '.' - ו '' עולה כי אקסונים גדלו יחדהגבול בין Fc המלא FLRT2-Fc אבל לא להאריך לשטח FLRT2.

איור 1
איור 1. הסיליקון מטריקס המשמש ליצירת חותמת חלבון פסים. (A, B) נוף למגוון רחב של מטריקס סיליקון. הגודל של המטריצה ​​הוא 30 מ"מ x 25 מ"מ 5 מ"מ x. חץ לבן ב A מצביע על חור קטן שבו חלבון רקומביננטי מוזרק (שלב 2.2). ראש החץ ב 'מצביע על חריץ שבו חלבון רקומביננטי מוחל לחלופין (שלב 2.2.1). (C, D) מבט תחתון של מטריקס סיליקון. גודלו של אזור הפסים הוא 7 מ"מ x 9 מ"מ. הרוחב של כל פס הוא 90 מיקרומטר. החץ מצביע על תעלה קטנה שדרכו חלבון רקומביננטי מוזרק. (E) איור סכמטי של נוף sagittal על קו האמצע של מטריקס מראה את הקשר בין החור הקטן, הפסים, ואת החריץ. החץ מצביע על i חור njection. ברים סולם הם 500 מיקרומטר AC ו -200 מיקרומטר ד נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. דיסקציה של ההיפוקמפוס עכבר. (א) להציג לראש המוח העוברי עכבר המראה את מיקום החיתוך (קו מקווקו) על ההמיספרות המבודדים כולל ההיפוקמפוס, קליפת המוח, ואת הסטריאטום. (B, C) ​​ההיפוקמפוס המבודד נאסף HBSS לאחר הסרת קרומי המוח. ( נוירונים D) הם מתורבתים על פסים בצלחת 6 ס"מ. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ftp_upload / 54,096 / 54096fig3.jpg "/>
מבחני איור 3. פסים עם Fc המלא FLRT2-Fc ותרבות ניתקת של נוירונים בהיפוקמפוס. נוירונים בהיפוקמפוס ניתקו מעכברי E15.5 היו בתרבית למשך 24 שעות על פסים של Fc המלא (AC) או FLRT2-FC (DF). ( A'-ג ', ד', ו ', ד' '- ו' ') תמונות מוגדלות מן האזורים התאגרף ב (AC, DF, ד' ו-ו '., בהתאמה) (א', א ') פסים שנוצר באמצעות שכותרתו fluorescently Fc (אפור) Fc (שחור) כניסוי שליטה. (ד, ד ', ד' ') שכותרתו fluorescently פסים FLRT2-FC (אפור) לסירוגין עם Fc (שחור). (ב', ב ', ה' , E ', אי' ') מכתים נוגדן אנטי-Tau1 של גופי התא אקסונים של נוירונים בהיפוקמפוס. (C, C', F, F ', ו' ') התמונות של פסים ואת מכתים אנטי Tau1 מוזגו. neurלפיירפוקס 'גופים אקסונים תא נהדפו מאוד מן FLRT2-FC (F, F', ו ''). שים לב אקסונים להפעיל לאורך הגבול לא ייכנסו לשטח FLRT2-FC (ראשי חץ ב F '') ברים .Scale הם 100 מיקרומטר C, C ', F, F' ו -25 מיקרומטר F ''. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר assay פס המשתמשת חלבון רקומביננטי נוירונים ניתק מן ההיפוקמפוס עכבר E15.5. assay זה מאפשר תצפית היעילה של תגובות דוחות, אטרקטיביות, או ניטראליות של נוירונים לחלבון רקומביננטי של עניין להציב דפוס פסים. יתרון עיקרי של פרוטוקול זה הוא השיטה הפשוטה ליצירת הפסים, שבו החלבון מודפס ישירות על גבי המשטח של צלחת פלסטיק, לעומת השיטה המסורתית, המחייב מטריצות מיוחדות, מערכת שאיבה, וקרומי nucleopore 20 , 21. כדי להפוך את פסי החלבון, חלבון רקומביננטי שכותרתו ניתן להזריק דרך חור קטן, או מדגם גדול יותר (~ 100 μl) יכול להיות ממוקם בתוך החריץ על גבי המטריצה, ואחריו השאיפה הזהירה של חיץ עודף חלבונים מאוגדים דרך החור.

יתרון נוסף של שיטה זו הוא כי מספר גדול של נוירונים ניתן מדמיין כמוניסוי ingle, קונוסים צמיחה רבים ניתן לנתח 21 בו זמנית. לעומת זאת, ב assay מפנה קונבנציונאלי, רק נוירון בודד חרוט צמיחה חד הוא מדמיין. FLRT2 המולקולה הדוחה הנקלט על ידי נוירונים, אשר נודדים הרחק פסי FLRT2-Fc 21. מולקולה הכתב כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) ניתן לבטא את הנוירונים לדמיין אותם נגד צבע השטיח ולאפשר תצפית בזמן אמת ללא צורך immunostaining. תגים אחרים כמו דגל, Myc, ו שלו יכולים לשמש במקום בתג Fc, ומזדהים עם הנוגדן אנטי תג שכותרתו המתאים fluorescently (שלב 2.1). כמה חלבונים הידרופובי גבוהים לא יכולים לעשות פס נכון בגלל אגרגציה עצמית. יתר על כן, הפעולה היחסית של משיכה ודחייה בין שני חלבוני יעד שונים ניתן להשוות ידי החלפת חלבון המטרה שנייה על הבקרה Fc פס 20.

ללהגביר את הכדאיות של נוירונים, התאמות בזמן עיכול אנזימטי ועיכוב טריפסין עשוי להיות נחוץ. אם יחס ההישרדות של נוירונים הוא נמוך, לדלל את ריכוז טריפסין או לקצר את זמן עיכול אנזימטי. רמת הלחות של החממה צריכה להישמר כדי למנוע לחץ האוסמוטי הנגרמת אידוי במערכת המלאה לאורך כל תקופת התרבות.

ההדבקה של מטריקס המנה היא גורם חשוב להכנת פסים טובים. דבקות לא נכון לתוצאות משטח צלחת בדפוס פס מאורגן. עם זאת, צפיפות התאים וריכוז המצע הם גם קריטי עבור ניסוי מוצלח. ריכוז חלבון גבוה הפס מומלץ לניתוח מולקולה שעיסוקם דוחה או מושך אינו ידוע. למרות שהראנו פרוטוקול זה באמצעות ניתק נוירונים העיקרי, הוא גם ישים עבור תרבויות organotypic explant 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Violamo  1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA) Nacalai 01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody Thermo Scientific A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody Thermo Scientific A-21203 Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody Chemicon MAB3420 Dilution 1/200
Antifade Thermo Scientific P7481 Alternative mounting media may be used
B27 supplement Thermo Scientific 17504-044 Dilution 1/50
Bovine serum albumin Sigma 01-2030-2
Cell strainer 100 um BD Falcon 352360
Centrifugation machine Kubota 2410
Cover glass 18mmx18mm Matsunami 18x18 mm No. 1
DAKO pen DAKO S2002 Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel Feather 2975#11
FBS Thermo Scientific 10437-028
Fluorecent microscope Nikon E600
Forceps No. 5 Fine Science Tools 11254-20
GlutaMAX Thermo Scientific 35050-061 Dilution 1/100
Hamilton Syringe Hamilton 805N 22 gauge, 50 uL
HBSS Thermo Scientific 14170-112
Human IgG, Fc Fragment Jackson 009-000-008
Laminin Thermo Scientific 23017-015
Neurobasal Thermo Scientific 21103-049
Normal Donkey Serum Jackson 017-000-121
PBS Nacalai 14249-24
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063 Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm Thermo Scientific 150288
Silicone Matrices Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope Olympus SZ61
Tip, 1000 uL Watson 125-1000S
Transparent sticky tape Tesa 57315 Alternative sticky tape may be used
Triton X-100 Sigma T8787
Trypan blue, 0.4% Bio-Rad 145-0013
Trypsin/EDTA Thermo Scientific 25300-054
Culture medium Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, (5600), 1959-1964 (2002).
  2. Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (5), 001941 (2010).
  3. Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403, (6765), 93-98 (2000).
  4. Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29, (2), 441-452 (2001).
  5. Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32, (15), 5209-5215 (2012).
  6. Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185, (10), 6294-6305 (2010).
  7. Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133, (7), 1241-1254 (2008).
  8. Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184, (5), 737-750 (2009).
  9. Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47, (4), 515-528 (2005).
  10. von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. (2007).
  11. Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269, (5224), 664-666 (1995).
  12. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
  13. Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
  14. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2, (5), 1216-1224 (2007).
  15. Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
  16. Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10, (7), 736-741 (2009).
  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139, (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138, (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84, (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30, (14), 2920-2933 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics