Stripe Assay по изучению притягательные или отталкивающие активность белка подложки с использованием диссоциированных нейронах гиппокампа

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yamagishi, S., Kesavamoorthy, G., Bastmeyer, M., Sato, K. Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (112), e54096, doi:10.3791/54096 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Аксонов это процесс , с помощью которого вновь образованные нейроны посылают аксоны к своей цели при разработке системы 1,2 нервной. Развивающиеся аксоны несут в себе высокую двигательная структуру на их кончике называется конус роста. Конус роста ощущает внеклеточные сигналы для навигации путь аксона в. Молекулы Наведение, такие как щели, Semaphorin и Ephrins, могут привлекать или отталкивать аксоны в зависимости от их взаимодействия с соответствующими рецепторами и корецепторами на аксона 1,3,4. Активированные рецепторы передачи сигналов к конусу роста, которые влияют на его организации цитоскелета для аксонов и ростового конуса движений.

Различные методы были разработаны, чтобы оценить действие аттрактанта и репеллента молекул. Химио-аттрактанты и репелленты могут быть введены в рост / культуральной среды с градиентом концентрации (например., Камера Данна или х-горок) 5,6, в сильно концентрированном месте с помощью микро-рipette (например., поворачиваясь анализ) 7 или в гомогенной концентрации путем применения ванны (например., коллапс анализа конус роста) 8,9.

Другие методы включают в тест - полосках или микроконтактной печати (μCP), в котором химио-аттрактант или репеллент наносят на поверхность пластины в качестве подложки 10-12. Thestripe анализ был первоначально разработан Бонхёффера и коллегами в 1987 году для анализа топографического картирования в системе куриных ретино-tectal 13. Оригинальный метод требует вакуумной системы для белков оболочки на поликарбонатных нуклеопорные мембран с использованием полосатых и сложных топологий матриц. В более поздних версиях, рекомбинантные белки были непосредственно напечатаны на поверхности пластины культуры в полосатый узор с использованием узкой щели матрицы кремниевых 14,15. В последнее время различные исследовательские группы успешно применили эту полоса анализа к анализу деятельности молекулы аксонов 16-21.

21. Через 24 ч культуры, как аксоны и клеточные тела нейронов были сильно отталкивается от FLRT2 полос. Окрашивание с антителом анти-TAU1 показали, что ~ 90% нейронов были распределены по регионам с Fc-покрытием, по сравнению с ~ 10% на FLRT2-Fc, что указывает, что FLRT2 имеет сильное отталкивающеефункция для нейронов гиппокампа 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры с участием субъектов животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных путем в Хамамацу школы медицины университета.

1. Получение матриц

  1. Кипятить 4-8 силиконовых матриц в микроволновой печи или на горячей плите в течение 5 мин и дайте им полностью высохнуть в течение 1 ч при ламинарном потоке (полосатая стороной вверх).
    Примечание: Следующие процедуры должны выполняться в соответствии с ламинарным потоком.
  2. Продуть сжатым воздухом или использовать прозрачную липкую ленту, чтобы удалить пыль из полосатой стороны матриц. Держите полосатую сторону чистой, чтобы он мог прочно прилипают к поверхности пластины.
  3. Осторожно поместите матрицы на 6-см пластиковой посуды, нажимая пальцем (одной матрицы на чашку; полоса стороной вниз). Избегайте попадания пузырьков воздуха между матрицей и блюдо. Отметьте расположение полос на нижней стороне культуры блюдо.
  4. Если матрица не может приложить, повторите процедуру с шага 1.2.

2. Генерация и нашивки Laminin покрытие для Neuron культуры

  1. Готовят флуоресцентно меченого рекомбинантного белка (25 мкл каждого для инъекций [стадии 2,2] или 100 мкл каждого для способа размещения [этапе 2.2.1]) путем смешивания с Fc-меченый белок (10-50 мкг / мл) и флуоресцентного dye- конъюгированные антитела против человеческого Fc-антитела (от 1 до 3 соотношение: 30-150 мкг / мл) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS). Затем инкубирование смеси в течение 30 мин при комнатной температуре.
  2. С помощью 22-G шприца, вводят 25 мкл рекомбинантного белка , полученного на предыдущей стадии (2.1) через небольшое отверстие на стороне матрицы (стрелки на рисунке 1А, 1С и 1Е).
    1. В качестве альтернативы, поместите 100 мкл рекомбинантного белка в верхнюю щель матрицы и аспирата приблизительно половину раствора из небольшого отверстия (стрелки на рисунке 1А, 1С и 1Е), таким образом , что рекомбинантный белок остается в полосатой регионах.
  3. Выдержите блюдо в течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
  4. Поместите 300 мкл PBS в верхнюю щель (рис 1б) и аспирата из небольшого отверстия , расположенного на стороне матрицы (стрелки на рисунке 1А, С и Е) для удаления неприкрепленные рекомбинантных белков. Не аспирация PBS полностью, потому что белки высохнет. Повторите этот шаг дважды. (3 раза всего)
  5. Осторожно снимите матрицу и немедленно поместить ~ 100 мкл контрольного белка (10-50 мкг / мл; Fc), чтобы покрыть всю полосатую область, создавая альтернативное покрытие. Затем, инкубировать блюдо в течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
  6. После промывки поверхности посуды три раза PBS, пальто с ~ 100 мкл 20 мкг / мл ламинина в PBS.
    Примечание: Laminin следует оттаивали на льду, чтобы предотвратить затвердевание.
  7. Инкубируйте блюдо в течение 1 ч при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
  8. Промыть поверхности посуды три раза PBS и добавляют культуру Mediит. Поместите блюдо , покрытое культуральной среде в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С до использования.

3. Культивирование нейронах гиппокампа от E15.5 эмбрионов мыши

  1. Эвтаназии мать с помощью цервикальной дислокации и выделить три E15.5 эмбрионов.
  2. Разрежьте кожу и череп сагиттальной на средней линии головы с ножницами, и удалить мозг, используя маленькую ложку. Перенести мозг осторожно к 60-мм чашки Петри, содержащую 3 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS).
  3. Используя скальпель, вырезают полушарий включая кору головного мозга, гиппокампе и стриатуме (рис 2А). Затем, Рассеките из гиппокампа путем тщательного удаления оболочки мозга, и передать отсеченных гиппокампа ткани на 15-мл центрифужную пробирку , содержащую 2 мл раствора HBSS, на льду (рис 2B-C). Соберите 6 гиппокампа из 3-х эмбрионов в трубе, которые достаточны для культивирования нейронов в 8 блюд.
  4. Заменить HРешение ПБС с раствором трипсин / ЭДТА (2 мл) и инкубировать пробирку при 37 ° С в течение 15 мин на водяной бане.
    Примечание: Аспирируйте HBSS без центрифугирования и не сливают раствор HBSS путем наклона трубки.
  5. Нейтрализовать активность трипсина путем добавления 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS).
  6. Центрифуга смесь при 100 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и промыть осадок с 2 мл культуральной среды. Повторите этот шаг еще раз.
  7. Пипетируйте гиппокампы вверх и вниз 10 раз в культуральной среде с использованием 1000 мкл наконечник с большим отверстием (вырезать наконечник), чтобы отделить ткани.
  8. Изменение к обычному (неразрезанные) 1000 мкл кончика и пипеткой диссоциированной ткани вверх и вниз, чтобы получить одной клеточной суспензии.
  9. Отдельные единичные клетки, пропуская их через сетчатый клеточный фильтр 80-100 мкм.
  10. Центрифуга отфильтрованной клеточной суспензии при 150 мкг в течение 5 мин.
  11. Удалить супернатант аспирацией и ресуспендируют ПеллЕТ (нейронов) в 2 мл культуральной среды.
  12. Граф клеток с использованием гемоцитометра с окрашивания трипановым синим, чтобы определить плотность и жизнеспособность. Затем пластины 10000 нейронов в 150 мкл культуральной среды для каждого набора stripes.The подвески должны быть тщательно помещены, чтобы покрыть всю область полосы.

4. Визуализация клеточных тел и аксонов с помощью иммунофлуоресценции Окрашивание с использованием анти-TAU1 антитело

  1. Через 24 ч культивирования, аспирата среду, не нарушая прилипшие клетки, и фиксируют нейроны с предварительно подогретой 4% параформальдегида (PFA) / 4% сахарозы / PBS при комнатной температуре в течение 15 мин.
  2. Промыть поверхности пластины 3 раза PBS. При желании, использовать водоотталкивающий ручку, чтобы нарисовать круг вокруг полосатой области, чтобы уменьшить количество антител, необходимое.
  3. Проницаемыми нейроны с 0,3% тритона Х-100 / PBS в течение 5 мин.
  4. Инкубируйте нейроны с блокирующим раствором, содержащим 3% ослиную сыворотку и 0,1% Тритон Х-100 для30 мин с последующей инкубацией с антителом анти-TAU1 (1: 200) в 1% ослиной сыворотки / 0,1% Тритон Х-100 / PBS / N O при температуре 4 ° С.
  5. Промыть поверхности пластины 3 раза PBS. Инкубируйте нейроны с флуорофором-конъюгированные антитела против мышиного IgG антител в 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) /0.1% Тритона Х-100 / PBS в течение 30 мин.
  6. Промыть поверхности пластины 3 раза PBS. Накройте полосатый область с крышкой х 18 мм стекла 18 мм с использованием 50 мкл antifade раствора. избежать воздушных пузырей, которые мешают визуализации.
  7. Получают флуоресцентные изображения с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием соответствующей системы, например, x10 объектива, наборы фильтров для GFP и RFP, и 1000 мс время экспозиции (рисунок 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Разъединенные нейроны гиппокампа мышей E15.5 высевали и культивировали в течение 24 ч на полосы флуоресцентно меченых управления Fc (рис 3A-C) или FLRT2-Fc (рис 3D-F) , чередующиеся с немеченого управления Fc. В обоих случаях, нейроны были агрегируются и расширили свои аксоны в виде пучков. Об управлении Fc / Fc полосы, нейроны были распределены равномерно по флуоресцентно меченных и не меченных полос, и они расширили свои аксоны в случайных направлениях (рис 3A-C). В отличие от этого, при культивировании на FLRT-2к / Fc полосы, аксоны избежать растущих на регионах FLRT2-Fc. Таким образом, расширяющиеся аксоны были в основном расположены на блоке управления Fc (рис 3D-F). Следует отметить, что обе клеточные тела и аксоны отталкиваются от FLRT2-Fc. Таким образом, аксоны распространяется в направлении , параллельном полос Рисунок 3D '.' - F '' показывает , что аксоны росли вдольграница между контрольной Fc и FLRT2-Fc, но не распространялась на территорию FLRT2.

Рисунок 1
Рисунок 1. Матрица кремния используется для создания полосатую штамп белка. (А, Б) Вид сверху кремниевой матрицы. Размер матрицы составляет 30 мм х 25 мм х 5 мм. Белая стрелка в указывает на небольшое отверстие, где впрыскивают рекомбинантный белок (этап 2.2). Эрроухед в B обозначает щель , где рекомбинантный белок в качестве альтернативы применяется (этап 2.2.1). (C, D) , вид снизу матрицы кремния. Размер полосатой области составляет 7 мм х 9 мм. Ширина каждой полосы составляет 90 мкм. Стрелка указывает на небольшой канал , через который рекомбинантный белок впрыскивается. (Е) Схематическая иллюстрация сагиттальной зрения на средней линии матрицы , показывающей связь между маленьким отверстием, полосы, и щелью. Стрелка указывает на I njection отверстие. Шкала баров 500 мкм переменного тока и 200 мкм в D. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Препарирование гиппокампа мыши. (А) вид сверху мышиных эмбриональных мозга , показывающий линию разреза (пунктирная линия) на изолированном полусфер включая гиппокамп, кору и полосатое тело. (В, С) Выделенный гиппокамп собирается в HBSS после удаления оболочки мозга. ( D) Нейроны культивируют на полосы в 6 см блюдо. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ftp_upload / 54096 / 54096fig3.jpg "/>
Рисунок 3. нашивки пробы с контрольной Fc и FLRT2-Fc и диссоциированного культуры нейронов гиппокампа. Диссоциированные нейроны гиппокампа мышей E15.5 культивировали в течение 24 ч на полосках управления Fc (AC) или FLRT2-Fc (DF). ( А'-C ', D'-F', D '' - F '') Увеличенные изображения из коробочной регионов (AC, DF, и D'-F '., соответственно) (а, а') Stripes генерируется используя флуоресцентную метку Fc (серый) и Fc (черный) в качестве контрольного эксперимента. (D, D ', D' ') флуоресцентно меченных полосы FLRT2-Fc (серая) , чередующиеся с Fc (черный). (B, B', E , Е ', Е' ') анти-TAU1 антитела окрашивание клеточных тел и аксонов нейронов гиппокампа. (C, C', F, F ', F' ') изображения полос и анти-TAU1 окрашивание были объединены. NeurУНС клеточные тела и аксоны сильно отталкивается от FLRT2-Fc (F, F ', F' '). Обратите внимание , что аксоны повернуть вдоль границы и не входить на территорию FLRT2-Fc (Arrowheads в F '') .Scale бары 100 мкм в C, C ', F, F' и 25 мкм в F ''. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра увеличенной версии этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает тест-полосках, который использует рекомбинантный белок и разложенных нейроны из гиппокампа E15.5 мыши. Этот анализ позволяет эффективно наблюдать отталкивающих, привлекательных, или нейтральных ответов нейронов к рекомбинантного белка, представляющего интерес, помещенный в полосатый узор. Основным преимуществом этого протокола является простой способ для формирования полосы, в которых белок непосредственно напечатанным на поверхность пластиковой тарелки, по сравнению с традиционным методом, который требует специальных матриц, вакуумной системы, а нуклеопорные мембрана 20 , 21. Для того, чтобы белковые полосы, меченый рекомбинантный белок может быть введен через небольшое отверстие или большего образца (~ 100 мкл) может быть помещена в прорезь на верхней части матрицы, с последующим тщательным аспирации избыточного буфера и несвязанных белков через отверстие.

Еще одним преимуществом этого метода является то, что большое число нейронов могут быть визуализированы в качествеИнгл эксперимент, и многие конусы роста могут быть проанализированы одновременно 21. В противоположность этому, в обычном поворотном анализе, только один нейрон и одиночный конус роста визуализируется. Отталкивающим молекула FLRT2 воспринимается нейронов, которые мигрируют от FLRT2-Fc полосы 21. Репортерной молекулы, как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или красный флуоресцентный белок (RFP) могут быть выражены в нейронах, чтобы визуализировать их от цвета ковра и позволять наблюдение в реальном времени без необходимости иммунное окрашивание. Другие теги, как FLAG, Мус, и его можно использовать вместо тега Fc, и идентифицированы с соответствующим флуоресцентно меченого анти-таг антитела (этап 2.1). Некоторые высокие гидрофобные белки не могут сделать правильную полосу из-за самоагрегации. Кроме того, относительное действие притяжения и отталкивания между двумя различными белками - мишенями можно сравнить путем замены второй целевой белок для контроля Fc - полосой 20.

кповышения жизнеспособности нейронов, корректировки могут быть необходимы в ферментативной время переваривания и ингибирование трипсина. Если коэффициент выживаемости нейронов низка, разбавить концентрацию трипсина или сократить время ферментативного пищеварения. Уровень влажности инкубатора следует поддерживать, чтобы избежать испарения индуцированных осмотического давления в полной системе в течение всего периода культивирования.

Адгезия матрицы к блюду является важным фактором для подготовки хороших полос. Неправильное присоединение к результатам блюдо поверхности в неорганизованной рисунка полосы. Тем не менее, плотность клеток и концентрации субстрата также имеют важное значение для успешного проведения эксперимента. Более высокая концентрация белка в полосе рекомендуется для анализа молекулу, отталкивающей или привлекательной активности неизвестна. Несмотря на то, мы показали , этот протокол , используя диссоциированных первичные нейроны, он также применим для органотипических эксплантов культур 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Violamo  1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA) Nacalai 01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody Thermo Scientific A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody Thermo Scientific A-21203 Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody Chemicon MAB3420 Dilution 1/200
Antifade Thermo Scientific P7481 Alternative mounting media may be used
B27 supplement Thermo Scientific 17504-044 Dilution 1/50
Bovine serum albumin Sigma 01-2030-2
Cell strainer 100 um BD Falcon 352360
Centrifugation machine Kubota 2410
Cover glass 18mmx18mm Matsunami 18x18 mm No. 1
DAKO pen DAKO S2002 Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel Feather 2975#11
FBS Thermo Scientific 10437-028
Fluorecent microscope Nikon E600
Forceps No. 5 Fine Science Tools 11254-20
GlutaMAX Thermo Scientific 35050-061 Dilution 1/100
Hamilton Syringe Hamilton 805N 22 gauge, 50 uL
HBSS Thermo Scientific 14170-112
Human IgG, Fc Fragment Jackson 009-000-008
Laminin Thermo Scientific 23017-015
Neurobasal Thermo Scientific 21103-049
Normal Donkey Serum Jackson 017-000-121
PBS Nacalai 14249-24
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063 Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm Thermo Scientific 150288
Silicone Matrices Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope Olympus SZ61
Tip, 1000 uL Watson 125-1000S
Transparent sticky tape Tesa 57315 Alternative sticky tape may be used
Triton X-100 Sigma T8787
Trypan blue, 0.4% Bio-Rad 145-0013
Trypsin/EDTA Thermo Scientific 25300-054
Culture medium Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, (5600), 1959-1964 (2002).
  2. Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (5), 001941 (2010).
  3. Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403, (6765), 93-98 (2000).
  4. Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29, (2), 441-452 (2001).
  5. Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32, (15), 5209-5215 (2012).
  6. Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185, (10), 6294-6305 (2010).
  7. Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133, (7), 1241-1254 (2008).
  8. Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184, (5), 737-750 (2009).
  9. Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47, (4), 515-528 (2005).
  10. von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. (2007).
  11. Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269, (5224), 664-666 (1995).
  12. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
  13. Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
  14. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2, (5), 1216-1224 (2007).
  15. Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
  16. Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10, (7), 736-741 (2009).
  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139, (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138, (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84, (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30, (14), 2920-2933 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics