Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren

Neuroscience

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Yamagishi, S., Kesavamoorthy, G., Bastmeyer, M., Sato, K. Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (112), e54096, doi:10.3791/54096 (2016).

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Abstract

Introduction

Axon Führung ist der Prozess , durch den neu gebildeten Neuronen Axone zu ihrem Ziel bei der Entwicklung des Nervensystems 1,2 senden. Die Entwicklung Axone tragen eine sehr bewegliche Struktur an ihrer Spitze der Wachstumskegel genannt. Der Wachstumskegel spürt extrazelluläre Signale des Axons in den Weg zu navigieren. Guidance Moleküle, wie Spalt, Semaphorin und Ephrinen kann Axone in Abhängigkeit von ihrer Wechselwirkung mit geeigneten Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf der Axon 1,3,4 anziehen oder abstoßen. Die aktivierten Rezeptoren übertragen Signale an den Wachstumskegel, der seine Organisation des Zytoskeletts für Axon und wachstums Kegel Bewegungen beeinflussen.

Verschiedene Verfahren wurden entwickelt, um die Wirkung der Lockstoff und abweisende Moleküle zu bewerten. Chemo-Lockstoffen und Repellentien können mit einem Gradienten - Konzentration (z. B. Dunn Kammer oder μ-Dias) 5,6, in einer hochkonzentrierten Stelle von Mikro-p in das Wachstum / Kulturmedium verabreicht werdenipette (z. B. Drehen assay) 7 oder mit einer homogenen Konzentration von Badanwendung (z. B. Wachstumskegel collapse assay) 8,9.

Andere Verfahren umfassen ein Streifentest oder Mikrokontakt- Drucken ( & mgr ; CP), in dem eine chemo-Lockstoff oder Repellent auf der Oberfläche einer Platte als Substrat 10-12 beschichtet ist. Thestripe Test wurde ursprünglich von Bonhoeffer und Kollegen im Jahr 1987 entwickelte 13 topographische Kartierung in den Küken retino-tectal System zu analysieren. Die ursprüngliche Methode benötigt, um ein Vakuumsystem zur Beschichtung von Proteinen auf Polycarbonat Nukleopore Membranen mit gestreiften und vermaschten Matrizen. In späteren Versionen wurden die rekombinanten Proteine ​​auf der Oberfläche einer Kulturplatte in einem Streifenmuster mit schmalen Schlitz Silizium - Matrizen 14,15 direkt gedruckt. In jüngster Zeit haben verschiedene Forschergruppen erfolgreich angewendet diesen Streifen - Assay auf die Analyse von Axon Führung Molekülaktivitäten 16-21.

21 kultiviert. Nach 24 h der Kultur, sowohl die Axone und Zellkörper der Neuronen wurden aus den FLRT2 Streifen stark abgestoßen. Anfärbung mit einem Antikörper anti-Tau1 ergab, dass ~ 90% der Neuronen auf der Fc-beschichteten Bereiche verteilt wurden, im Vergleich zu ~ 10% auf die FLRT2-Fc, das anzeigt, daß eine starke Abstoßungs FLRT2 hatFunktion für Neuronen im Hippocampus 21.

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Protocol

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an Hamamatsu University School of Medicine zugelassen.

1. Herstellung von Matrices

  1. Sieden 4-8 Silikon-Matrices in einer Mikrowelle oder auf einer heißen Platte für 5 min und lassen sie für 1 h unter laminaren Strömungs (striped Seite nach oben) vollständig trocknen.
    Hinweis: Die folgenden Verfahren sollten unter laminaren Strömung durchgeführt werden.
  2. Preßluft oder verwenden transparente Klebeband Staub von der gestreiften Seite der Matrizen zu entfernen. Halten Sie die gestreifte Seite sauber, so dass es fest an der Plattenoberfläche haften.
  3. Vorsichtig die Matrizen auf 6 cm Plastikschalen, indem sie mit einem Finger (eine Matrix pro Schale; Streifen Seite nach unten) drücken. Vermeiden Sie Luftblasen zwischen der Matrix und zu dem Teller. Markieren die Lage der Streifen auf der Unterseite der Kulturschale.
  4. Wenn die Matrix zu befestigen fehlschlägt, wiederholen Sie die Schritte 1.2.

2. Streifen Erzeugung und Laminin Beschichtung für Neuron Kultur

  1. Bereiten fluoreszierend markiertes rekombinantes Protein (25 & mgr; l jeder Injektions [Schritt 2.2] bzw. 100 & mgr; l jeweils für die Platzierungsmethode [Schritt 2.2.1]) durch Mischen des Fc-tagged Protein (10-50 ug / ml) und einen fluoreszierenden Farbstoff konjugierten anti-human Fc Antikörper (1 bis 3 Verhältnis: 30-150 & mgr; g / ml) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Dann Inkubieren der Mischung für 30 min bei RT.
  2. Verwendung einer 22-G - Spritze, injizieren 25 & mgr; l des rekombinanten Proteins im vorherigen Schritt (2.1) durch das kleine Loch auf der Seite der Matrix (Pfeile in 1A, 1C und 1E).
    1. Alternativ setzen 100 ul des rekombinanten Proteins in den oberen Schlitz der Matrix und Aspirat etwa die Hälfte der Lösung aus dem kleinen Loch (Pfeile in 1A, 1C und 1E), so daß das rekombinante Protein bleibt in den Streifenbereichen.
  3. Inkubieren Sie die Schale für 30 min bei 37 ° C in einem Zellkulturbrutschrank.
  4. Platzieren 300 ul PBS in den oberen Schlitz (1B) und Aspirat aus dem kleinen Loch auf der Seite der Matrix angeordnet (Pfeile in Figur 1A, C und E) zu entfernen unattached rekombinanter Proteine. Sie nicht das PBS vollständig absaugen, weil die Proteine ​​trocken wird. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. (3-mal insgesamt)
  5. Vorsichtig die Matrix zu entfernen und sofort platzieren ~ 100 ul Kontrollprotein (10-50 ug / ml; Fc) den gesamten Streifenbereich abzudecken, eine alternative Beschichtung zu schaffen. Dann brüten die Schale für 30 min bei 37 ° C in der Zellkultur-Inkubator.
  6. Nach der Geschirroberfläche dreimal Waschen mit PBS, streicht es mit ~ 100 ul von 20 ug / ml Laminin in PBS.
    Hinweis: Laminin sollte auf Eis aufgetaut werden Erstarrung zu verhindern.
  7. Inkubiere die Schale für 1 h bei 37 ° C in der Zellkultur-Inkubator.
  8. Waschen Sie die Geschirroberfläche dreimal mit PBS und Kultur medi hinzufügenÄh. Legen Sie die beschichtete Schale mit Kulturmedium in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C bis zur Verwendung.

3. Anzucht Neuronen im Hippocampus von E15.5 Maus Embryonen

  1. Euthanize Mutter über Genickbruch und zu isolieren, drei E15.5 Embryonen.
  2. Schneiden Sie die Haut und Schädel sagital an der Mittellinie des Kopfes mit einer Schere, und entfernen Sie das Gehirn einen kleinen Löffel. Übertragen, das Gehirn vorsichtig zu einer 60-mm-Petrischale mit 3 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
  3. Mit einem Skalpell ausgeschnitten die Hemisphären einschließlich Cortex, Hippocampus und Striatum (2A). Dann sezieren aus dem Hippocampus - Region durch sorgfältig die Meningen zu entfernen, und übertragen Sie die seziert Hippocampus - Gewebe in ein 15-ml - Zentrifugenröhrchen mit 2 ml HBSS - Lösung, auf Eis (2B-C). Sammelt 6 Hippocampi von 3 Embryonen in der Röhre, die zum Züchten von Neuronen in 8 Geschirr ausreichend sind.
  4. Ersetzen Sie die HBSS-Lösung mit Trypsin / EDTA-Lösung (2 ml) und das Röhrchen bei 37 ° C für 15 min in einem Wasserbad inkubiert.
    Hinweis: Aspirate HBSS ohne Zentrifugation und nicht die HBSS-Lösung dekantieren, indem das Röhrchen Neigen.
  5. Neutralisieren des Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 500 ul fötales Rinderserum (FBS).
  6. Zentrifugieren der Mischung bei 100 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und wäscht das Pellet mit 2 ml Kulturmedium. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
  7. Pipettieren die hippocampi nach oben und unten 10-mal in Kulturmedium, das eine 1000-ul Spitze mit einem großen Loch mit (Cut-Spitze), um das Gewebe zu distanzieren.
  8. Wechseln Sie zu einem regelmäßigen (uncut) 1000-ul Spitze und pipettieren die dissoziierten up Gewebe und unten eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
  9. Trennen Sie die einzelnen Zellen, indem sie durch eine 80-100-um-Mesh-Zelle Sieb vorbei.
  10. Zentrifugieren Sie die gefilterte Einzelzellsuspension bei 150 g für 5 min.
  11. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und resuspendieren Pellet (Neuronen) in 2 ml Kulturmedium.
  12. Zählen Sie die Zellen einer Zählkammer mit Trypan-Blau-Färbung mit der Dichte und die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Dann Platte 10.000 Neuronen in 150 ul Kulturmedium für jede Gruppe von stripes.The Suspension sollte sorgfältig den gesamten Streifenbereich abzudecken platziert werden.

4. Visualisierung von Zellkörper und Axone durch Immunfluoreszenzanfärbung unter Verwendung eines Anti-Tau1 Antikörper

  1. Nach 24 Stunden Kultur absaugen Medium ohne die anhaftenden Zellen zu stören, und befestigen Sie die Neuronen, die mit vorgewärmter 4% Paraformaldehyd (PFA) / 4% Saccharose / PBS bei RT für 15 min.
  2. Waschen Sie die Plattenoberfläche 3-mal mit PBS. Falls gewünscht, verwenden Sie einen wasserabstoßenden Stift einen Kreis um den gestreiften Bereich zu ziehen benötigt, um die Menge an Antikörper zu verringern.
  3. Permeabilisierung die Neuronen mit 0,3% Triton X-100/5 min PBS.
  4. Inkubieren der Neuronen mit Blocking-Lösung enthaltend 3% Eselserum und 0,1% Triton X-100 für30 min, gefolgt von einer Inkubation mit einem Anti-Tau1 Antikörper (1: 200) in 1% Eselsserum / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N bei 4 ° C.
  5. Waschen Sie die Plattenoberfläche 3-mal mit PBS. Inkubieren der Neuronen mit einem Fluorophor-konjugierten Anti-Maus-IgG-Antikörper in 1% Rinderserumalbumin (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS für 30 min.
  6. Waschen Sie die Plattenoberfläche 3-mal mit PBS. Decken Sie den Streifenbereich mit einer 18 mm x 18 mm Deckglas mit 50 ul Antifade-Lösung. vermeiden Luftblasen, die mit der Abbildungs ​​stören.
  7. Erhalten Fluoreszenzbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop das entsprechende System, beispielsweise x10 Objektivlinse, Filtersätze für GFP und RFP und 1000 msec Belichtungszeit (Abbildung 3).

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Representative Results

Dissociated Neuronen im Hippocampus von E15.5 Mäusen wurden plattiert und für 24 h auf Streifen von fluoreszenzmarkierten Kontroll - Fc (3A-C) oder FLRT2-Fc (3D-F) mit nicht-markierten Kontroll - Fc abwechseln. In beiden Fällen waren die Neuronen aggregiert und erweitert ihre Axone als Bündel. Auf der Kontroll - Fc / Fc Streifen wurden die Neuronen gleichmäßig auf die fluoreszenzmarkierten und nicht-markierten Streifen verteilt, und sie erweitert ihre Axone in zufällige Richtungen (3A-C). Im Gegensatz dazu, wenn die Kultur auf FLRT-2k / Fc Streifen, vermied die Axone auf den FLRT2-Fc-Regionen wachsen. So wurden die Verlängerung Axone hauptsächlich auf der Steuer Fc befindet (Abbildung 3D-F). Bemerkenswert ist, sowohl die Zellkörper und Axone wurden aus dem FLRT2-Fc abgestoßen. So wird in einer Richtung parallel verlängert die Axone zu den Streifen Figur 3D '.' - F '' zeigt , dass die Axone entlang wuchsdie Grenze zwischen Kontroll-Fc und FLRT2-Fc aber erstreckte sich nicht in das FLRT2 Gebiet.

Abbildung 1
Abbildung 1. Siliziummatrix verwendet , um die gestreifte Protein Stempel zu erstellen. (A, B) Draufsicht der Siliziummatrix. Die Größe der Matrix beträgt 30 mm x 25 mm x 5 mm. Weißer Pfeil in A zeigt ein kleines Loch, wo das rekombinante Protein injiziert wird (Schritt 2.2). Pfeilspitze in B zeigt einen Schlitz in dem das rekombinante Protein alternativ angewandt (Schritt 2.2.1). (C, D) Unterseite der Siliziummatrix. Die Größe des gestreiften Bereich ist 7 mm x 9 mm. Die Breite jedes Streifens beträgt 90 & mgr; m. Pfeil gibt einen kleinen Kanal , durch die das rekombinante Protein injiziert wird. (E) Schematische Darstellung der sagittalen Ansicht an der Mittellinie der Matrix , die Verbindung zwischen dem kleinen Loch zeigt, wobei der Streifen und dem Schlitz. Der Pfeil zeigt die i njection Loch. Maßstabsbalken sind 500 & mgr; m in AC und 200 & mgr; m in D. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Dissektion der Maus Hippocampus. (A) Draufsicht von embryonalen Gehirn der Maus zeigt die Schnittposition (gestrichelte Linie) auf den isolierten Hemisphären einschließlich des Hippocampus, Cortex und Striatum. (B, C) ​​Das isolierte Hippocampus wird in HBSS gesammelt , nachdem die Meningen zu entfernen. ( D) Neurone kultiviert auf den Streifen in einem 6-cm - Schale. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Stripe Assays mit Kontroll - Fc und FLRT2-Fc und einer dissoziierten Kultur von Hippocampus - Neuronen. Dissoziierte hippocampalen Neuronen aus E15.5 - Mäusen wurden für 24 h auf Streifen von Kontroll - Fc (AC) oder FLRT2-Fc (DF). ( A'-C ', D'-F', D '' - F '') Vergrößerte Bilder aus den boxed Regionen (AC, DF, und D'-F '., jeweils) (A, A') Streifen erzeugt fluoreszenzmarkierte Fc (grau) und Fc (schwarz) als Kontrollversuch verwendet wird . (D, D ', D' ') fluoreszenzmarkierte FLRT2-Fc - Streifen (grau) im Wechsel mit Fc (schwarz). (B, B', E , E ', E' ') Anti-Tau1 Antikörper - Färbung der Zellkörper und Axone der Neuronen des Hippocampus. (C, C', F, F ', F' ') die Bilder der Streifen und die anti-Tau1 Färbungs wurden fusioniert. Die neurons '(, F' 'Zellkörper und Axone wurden aus dem FLRT2-Fc - F, F) stark abgestoßen ". Beachten Sie, dass Axone drehen entlang der Grenze und geben Sie nicht die FLRT2-Fc - Gebiet (Pfeilspitzen in F '') .Scale Bars sind 100 & mgr; m in C, C ', F, F' und 25 & mgr; m in F ''. Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt einen Streifen Assay, rekombinantes Protein und dissoziierte Neuronen aus dem Hippocampus E15.5 Maus verwendet. Dieser Assay ermöglicht die effiziente Beobachtung repulsive, attraktiv, oder neutrale Antworten von Neuronen auf ein rekombinantes Protein von Interesse in einem gestreiften Muster angeordnet. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls ist die einfache Methode für die Streifen zu erzeugen, in dem das Protein direkt auf die Oberfläche einer Kunststoffschale aufgedruckt ist, im Vergleich zu dem traditionellen Verfahren, die spezielle Matrices, ein Vakuumsystem erfordert und eine Nucleopore - Membran 20 , 21. Um die Proteinstreifen zu machen, kann das markierte rekombinante Protein durch ein kleines Loch injiziert werden oder eine größere Probe (~ 100 & mgr; l) in den Schlitz auf der Oberseite der Matrix, gefolgt von der sorgfältigen Absaugung von überschüssigem Puffer und ungebundene Proteine ​​gelegt werden durch das Loch.

Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass eine große Anzahl von Neuronen in visualisiert werden kann, wieingle Experiment und viele Wachstumskegel 21 können gleichzeitig analysiert werden. Im Gegensatz dazu wird in einem herkömmlichen Dreh Assay nur ein einziges Neuron und Einzelwachstumskegel visualisiert. Die abstoßende Molekül FLRT2 wird von Neuronen gemessen wird , die Migration weg von FLRT2-Fc - Streifen 21. Ein Reportermolekül wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) oder rot fluoreszierendes Protein (RFP) in den Neuronen exprimiert werden, um sie gegen die Teppichfarbe sichtbar zu machen und ohne die Notwendigkeit einer Immunofärbung Echtzeit-Beobachtung zu ermöglichen. Andere Tags wie FLAG, Myc und sein kann mit dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Anti-Markierungs-Antikörper (Schritt 2.1) anstelle des Fc-Tag und identifiziert werden. Einige hohe hydrophobe Proteine ​​können nicht richtig Streifen zu machen, weil der Selbstaggregation. Weiterhin kann die relative Wirkung von Anziehung und Abstoßung zwischen zwei verschiedenen Zielproteinen verglichen werden , indem eine zweite Zielprotein für die Steuerung Fc Streifen 20 ersetzt wird .

Nacherhöhen die Lebensfähigkeit der Neuronen, Anpassungen bei der enzymatischen Digestionszeit und Trypsin-Hemmung kann erforderlich sein. Wenn die Überlebensrate von Neuronen niedrig ist, verdünnt die Konzentration von Trypsin oder die enzymatische Verdauung Zeit zu verkürzen. Der Feuchtigkeitsgehalt des Inkubators sollte Verdampfung induzierter osmotischer Druck im Gesamtsystem zu vermeiden, in der gesamten Kulturdauer aufrecht erhalten werden.

Die Adhäsion der Matrix an der Schale ist ein wichtiger Faktor für eine gute Streifen vorbereitet. Unsachgemäße Einhaltung der Geschirroberfläche führt zu einem unorganisierten Streifenmuster. Jedoch sind die Dichte der Zellen und der Konzentration des Substrats auch entscheidend für ein erfolgreiches Experiment. Eine höhere Proteinkonzentration in dem Streifen wird zur Analyse eines Moleküls, dessen Aktivität abstoßend oder anziehend empfohlen ist unbekannt. Obwohl wir dieses Protokoll verwenden dissoziiert primären Neuronen gezeigt haben, ist es auch anwendbar für organotypischen Explantatkulturen 15.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Violamo  1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA) Nacalai 01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody Thermo Scientific A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody Thermo Scientific A-21203 Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody Chemicon MAB3420 Dilution 1/200
Antifade Thermo Scientific P7481 Alternative mounting media may be used
B27 supplement Thermo Scientific 17504-044 Dilution 1/50
Bovine serum albumin Sigma 01-2030-2
Cell strainer 100 um BD Falcon 352360
Centrifugation machine Kubota 2410
Cover glass 18mmx18mm Matsunami 18x18 mm No. 1
DAKO pen DAKO S2002 Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel Feather 2975#11
FBS Thermo Scientific 10437-028
Fluorecent microscope Nikon E600
Forceps No. 5 Fine Science Tools 11254-20
GlutaMAX Thermo Scientific 35050-061 Dilution 1/100
Hamilton Syringe Hamilton 805N 22 gauge, 50 uL
HBSS Thermo Scientific 14170-112
Human IgG, Fc Fragment Jackson 009-000-008
Laminin Thermo Scientific 23017-015
Neurobasal Thermo Scientific 21103-049
Normal Donkey Serum Jackson 017-000-121
PBS Nacalai 14249-24
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063 Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm Thermo Scientific 150288
Silicone Matrices Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope Olympus SZ61
Tip, 1000 uL Watson 125-1000S
Transparent sticky tape Tesa 57315 Alternative sticky tape may be used
Triton X-100 Sigma T8787
Trypan blue, 0.4% Bio-Rad 145-0013
Trypsin/EDTA Thermo Scientific 25300-054
Culture medium Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.

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References

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