Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo

Neuroscience

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Yamagishi, S., Kesavamoorthy, G., Bastmeyer, M., Sato, K. Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (112), e54096, doi:10.3791/54096 (2016).

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Abstract

Introduction

Orientação Axon é o processo pelo qual os neurónios recentemente formadas enviar axónios para o alvo durante o desenvolvimento do sistema nervoso 1,2. axônios em desenvolvimento realizar uma estrutura altamente móveis em sua ponta chamado cone de crescimento. O cone de crescimento detecta sinais extracelulares para navegar o caminho do axônio. Moléculas de orientação, tais como fenda, semaforina, e Efrinas, pode atrair ou repelir axônios dependendo de sua interação com receptores adequados e co-receptores na axônio 1,3,4. Os receptores activados transferir sinais para o cone de crescimento que afetam sua organização do citoesqueleto para axônio e crescimento de cone movimentos.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para avaliar a acção de moléculas atractivas e repelentes. Quimio-atractores e repelentes pode ser administrado para o meio de crescimento / cultura com uma concentração de gradiente (por ex., Câmara de Dunn ou u-lâminas) 5,6, em um local altamente concentrada por micro-Pipette (por exemplo., ensaio de torneamento) 7 ou a uma concentração homogénea por aplicação de banho (por exemplo., ensaio de colapso do cone de crescimento) 8,9.

Outros métodos incluem um ensaio de listra ou impressão microcontact (μCP), em que um quimio-atractor ou repelente é revestido sobre a superfície de uma placa como um substrato 10-12. Thestripe ensaio foi originalmente desenvolvido por Bonhoeffer e seus colegas em 1987 para analisar o mapeamento topográfico do pintainho sistema retino-tectal 13. O método original necessário um sistema de vácuo para proteínas de revestimento para membranas de policarbonato Nucleopore usando listrado e matrizes em malha. Nas versões mais recentes, as proteínas recombinantes foram directamente impressa sobre a superfície de uma placa de cultura num padrão listrado utilizando matrizes de silício estreita fenda 14,15. Recentemente, vários grupos de pesquisa têm aplicado com sucesso neste ensaio tarja para a análise das actividades de moléculas de orientação axônio 16-21.

21. Após 24 h de cultura, ambos os axónios e corpos celulares dos neurónios foram fortemente repelido das listras FLRT2. A coloração com um anticorpo anti-Tau1 ~ revelou que 90% dos neurónios foram distribuídos nas regiões revestidas com Fc, em comparação com ~ 10% na FLRT2-Fc, indicando que tem uma forte FLRT2 repulsivofunção para os neurônios do hipocampo 21.

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Protocol

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal em Hamamatsu University School of Medicine.

1. Preparação de Matrizes

  1. Ferver 4-8 matrizes de silicone em um forno de microondas ou num prato quente durante 5 minutos e deixar secar completamente durante 1 h sob um fluxo laminar (lado listrado para cima).
    Nota: Os seguintes procedimentos devem ser realizados sob fluxo laminar.
  2. Soprar ar comprimido ou com fita adesiva transparente para remover qualquer poeira do lado listrado das matrizes. Mantenha o lado limpo listrado para que ele possa aderir firmemente à superfície da chapa.
  3. Com cuidado, coloque as matrizes em placas de plástico de 6 cm, pressionando com um dedo (uma matriz por prato; tarja lado de baixo). Evite ficar bolhas de ar entre a matriz eo prato. Marcar a localização das tiras no lado inferior da placa de cultura.
  4. Se a matriz não anexar, repita a partir do passo 1.2.

2. Stripe Geração e laminina Revestimento de Cultura Neuron

  1. Prepare a proteína recombinante marcada com fluorescência (25 ul cada injectável [passo 2.2] ou 100 ul de cada um para o método de colocação [passo 2.2.1]) misturando a proteína Fc-tag (10-50 ug / ml) e uma dye- fluorescente anticorpo anti-Fc humano conjugado (1 a 3 rácio: 30-150 ug / ml) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em seguida, incuba-se a mistura durante 30 min à TA.
  2. Utilizando uma seringa de 22-L, 25 ul de injectar a proteína recombinante foi preparada na etapa anterior (2.1) através do pequeno orifício no lado da matriz (setas na Figura 1A, 1C, 1E e).
    1. Em alternativa, colocar 100 ul da proteína recombinante no topo fenda da matriz e aspirado de cerca de metade da solução do pequeno orifício (setas na figura 1A, 1C e 1E), de modo que a proteína recombinante permanece nas regiões listradas.
  3. Incubar o prato durante 30 miN a 37 ° C numa incubadora de cultura de células.
  4. Coloque 300 ul de PBS na fenda superior (Figura 1B) e aspirado a partir do pequeno orifício localizado no lado da matriz (setas na figura 1A, C e E) para remover as proteínas recombinantes não acopladas. Não aspirar o PBS completamente, porque as proteínas vai secar. Repita esta etapa duas vezes. (3 vezes no total)
  5. Cuidadosamente remover a matriz e colocar imediatamente ~ 100 ul de proteína de controlo (10-50 ug / ml de Fc) para cobrir a área listrada inteira, criando um revestimento alternativo. Em seguida, o prato incubar durante 30 min a 37 ° C na incubadora de cultura de células.
  6. Depois de se lavar a superfície do prato três vezes com PBS, revesti-la com ~ 100 mL de 20 ug / ml em PBS laminina.
    Nota: A laminina devem ser descongeladas em gelo para evitar a solidificação.
  7. Incubar a placa durante 1 hora a 37 ° C na incubadora de cultura de células.
  8. Lavar a superfície do prato três vezes com PBS e adicionar cultura Medium. Colocar a cápsula revestida com meio de cultura numa incubadora de CO2 a 5% a 37 ° C até à sua utilização.

3. A cultura neurônios do hipocampo de embriões de camundongos E15.5

  1. Euthanize mãe via deslocamento cervical e isolar três E15.5 embriões.
  2. Cortar a pele do crânio e sagital na linha média da cabeça com uma tesoura, e remover o cérebro utilizando uma colher pequena. Transferir o cérebro cuidadosamente para um prato de 60 mm de Petri contendo 3 ml de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS).
  3. Utilizando um bisturi, cortar os hemisférios incluindo córtex, hipocampo e corpo estriado (Figura 2A). Em seguida, dissecar a região do hipocampo pela remoção cuidadosa das meninges, e transferir os tecidos do hipocampo dissecados para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 2 ml de solução HBSS, em gelo (Figura 2B-C). Recolhe 6 hipocampos de embriões 3 no tubo, que são suficientes para a cultura de neurónios em 8 pratos.
  4. Substitua o HBSS solução com uma solução de tripsina / EDTA (2 ml) e incuba-se o tubo a 37 ° C durante 15 min num banho de água.
    Nota: Aspirar HBSS sem centrifugação e não decantar a solução de HBSS por inclinação do tubo.
  5. Neutraliza-se a actividade da tripsina por adição de 500 uL de soro fetal de bovino (FBS).
  6. Centrifugar a mistura a 100 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento com 2 mL de meio de cultura. Repita este passo mais uma vez.
  7. Pipet os hipocampos cima e para baixo 10 vezes em meio de cultura, utilizando uma ponta de 1.000 l com um grande furo (cut-ponta) para dissociar o tecido.
  8. Mudar para um regular (sem cortes) ponta de 1.000 mL e pipete o tecido dissociado cima e para baixo para obter uma suspensão de uma única célula.
  9. Separar as células individuais, passando-os através de um filtro de células de malha 80-100 mícrons.
  10. Centrifugar a suspensão de célula única filtrado a 150 xg durante 5 min.
  11. Remover o sobrenadante por aspiração, e ressuspender o Pellet (neurónios) em 2 ml de meio de cultura.
  12. Contar as células utilizando um hemocitómetro, com coloração com azul de tripano para determinar a densidade e viabilidade. Então, placa 10.000 neurônios em 150 mL de meio de cultura para cada conjunto de suspensão stripes.The deve ser cuidadosamente colocada para cobrir a região faixa inteira.

4. Visualização dos corpos celulares e axônios por imunofluorescência Coloração uso de um anti-Tau1 Antibody

  1. Após 24 h de cultura, aspirar o meio, sem perturbar as células aderentes, e fixar os neurónios pré-aquecido com 4% de paraformaldeído (PFA) / 4% de sacarose / PBS a TA durante 15 min.
  2. Lavar a superfície da placa 3 vezes com PBS. Se desejado, utilizar uma caneta repelente de água para desenhar um círculo em torno da região listrado para diminuir a quantidade de anticorpo necessária.
  3. Permeabilizar os neurónios com 0,3% de Triton X-100 / PBS durante 5 min.
  4. Incubar os neurónios com solução de bloqueio que continha 3% de soro de burro e 0,1% de Triton X-100 durante30 min, seguido por incubação com um anticorpo anti-Tau1 (1: 200) em soro de burro a 1% / 0,1% de Triton X-100 / PBS O / N a 4 ° C.
  5. Lavar a superfície da placa 3 vezes com PBS. Incubar os neurónios com um anticorpo IgG anti-ratinho conjugado com fluoróforo em 1% de albumina de soro bovino (BSA) /0.1% de Triton X-100 / PBS durante 30 min.
  6. Lavar a superfície da placa 3 vezes com PBS. Cobrir a região listrado com um x 18 mm tampa de vidro 18 mm, utilizando 50 ul de antifade solução. evitar bolhas de ar, os quais interferem com a imagem latente.
  7. Obtenção de imagens fluorescentes com um microscópio de fluorescência utilizando o sistema apropriado, por exemplo, x10 lente objectiva, conjuntos de filtros para GFP e RFP, e tempo de exposição de 1000 mseg (Figura 3).

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Representative Results

Neurônios do hipocampo dissociada de camundongos E15.5 foram semeados e cultivados por 24 h em listras de fluorescente etiquetado controle Fc (Figura 3A-C) ou FLRT2-Fc (Figura 3D-F) alternando com Fc não marcado controle. Em ambos os casos, os neurônios foram agregadas e estendeu seus axônios como pacotes. No controle listras Fc / Fc, os neurônios foram distribuídos uniformemente sobre as listras fluorescente etiquetado e não marcadas, e eles estenderam seus axônios em direções aleatórias (Figura 3A-C). Em contraste, quando cultivadas em listras FLRT-2Fc / Fc, os axónios em crescimento evitados nas regiões FLRT2-Fc. Assim, os axónios que se estendem estavam localizados principalmente na Fc de controlo (Figura 3D-F). Notavelmente, ambos os corpos celulares e axônios foram repelidos do FLRT2-Fc. Assim, os axónios estendidos numa direcção paralela às faixas Figura 3D '.' - F '' mostra que os axónios cresceu ao longoa fronteira entre Fc controle e FLRT2-Fc mas não se estendia para o território FLRT2.

figura 1
Figura 1. Silicon Matrix usado para criar o selo de proteína listrado. (A, B) Vista de cima da matriz de silicone. O tamanho da matriz de 30 mm x 25 mm x 5 mm. seta branca em um indica um pequeno buraco onde a proteína recombinante é injetado (passo 2.2). Arrowhead em B indica uma fenda onde a proteína recombinante é alternativamente aplicada (passo 2.2.1). (C, D) Vista inferior da matriz de silicone. O tamanho da região listrado é de 7 mm x 9 mm. A largura de cada faixa é de 90 mm. A seta indica um pequeno canal através do qual a proteína recombinante é injectado. (E) Ilustração esquemática da vista sagital na linha média da matriz que mostra a ligação entre o furo pequeno, as tiras, e a fenda. A seta indica o I buraco njection. Barras de escala são 500 mm no AC e 200 mm em D. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Dissecção do hipocampo do rato. (A) Vista de cima de rato cérebro embrionário que mostra a posição de corte (linha a tracejado) sobre os hemisférios isolados incluindo o hipocampo, no córtex e no estriado. (B, C) ​​O hipocampo isolado é recolhido em HBSS após a remoção das meninges. ( D) os neurônios são cultivadas nas listras em um de 6 cm prato. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Os ensaios da listra com Fc controle e FLRT2-Fc e uma cultura dissociada de neurônios do hipocampo. Neurónios do hipocampo dissociada de camundongos E15.5 foram cultivadas por 24 h em listras de Fc de controlo (AC) ou FLRT2-Fc (DF). ( A'-C ', D-M', D '' - f '') a partir de imagens ampliadas as regiões enquadradas em (AC, DF, e D'-F '., respectivamente) (a, a') das listras gerado usando fluorescente etiquetado Fc (cinza) e Fc (preto) como um experimento de controle. (D, D ', D' ') listras FLRT2-Fc marcado por fluorescência (cinza) alternando com Fc (preto). (B, B', e , e ', e' ') anti-Tau1 coloração de anticorpos dos corpos celulares e axónios dos neurónios do hipocampo. (C, C', F, F ', F' ') as imagens das listras e o Tau1 anti-coloração foram fundidas. o neurons 'corpos celulares e axônios foram fortemente repelida pelo FLRT2-Fc (F, F', F ''). Note-se que os axônios transformar ao longo da fronteira e não entrar no território FLRT2-Fc (pontas de seta em F '') bares .Scale são 100 mm em C, C ', F, F' e 25 mm na F ''. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo descreve um ensaio de faixa que usa proteína recombinante e os neurónios dissociados a partir de hipocampo de rato E15.5. Este ensaio permite a observação de respostas repulsivas eficiente, atraentes, ou neutras de neurónios para uma proteína recombinante de interesse colocado num padrão às riscas. Uma grande vantagem deste protocolo é o método simples para gerar as tiras, em que a proteína está directamente impressos sobre a superfície de um prato de plástico, em comparação com o método tradicional, o que requer matrizes especiais, um sistema de vácuo, e uma membrana de Nucleopore 20 , 21. Para fazer com que as faixas de proteína, a proteína recombinante marcada pode ser injectado através de um pequeno orifício, ou uma amostra maior (~ 100 mL) pode ser colocado na fenda em cima da matriz, seguida da aspiração cuidadosa de excesso de tampão e as proteínas não ligadas através do orifício.

Outra vantagem deste método é que um grande número de neurónios pode ser visualizado como emexperimento ingle, e muitas cones de crescimento podem ser analisadas simultaneamente 21. Em contraste, num ensaio convencional de viragem, apenas um único neurónio e do cone de crescimento único é visualizada. A molécula FLRT2 repulsiva é detectado pelos neurônios, que migram longe de listras FLRT2-Fc 21. Uma molécula repórter como a proteína verde fluorescente (GFP) ou a proteína fluorescente vermelha (RFP) pode ser expressa nos neurónios visualizá-los contra a cor do tapete e permitir a observação em tempo real sem a necessidade para a imunocoloração. Outras marcas como FLAG, Myc, e Sua pode ser usado em vez da marca Fc, e identificado com o anticorpo anti-tag apropriada fluorescente etiquetado (passo 2.1). Algumas proteínas hidrofóbicas elevadas não pode fazer tarja apropriada por causa da auto-agregação. Além disso, a acção relativa de atracção e repulsão entre duas proteínas alvo diferentes podem ser comparados por substituição de uma segunda proteína alvo para o controlo Fc listra 20.

Paraaumentar a viabilidade dos neurónios, ajustes no tempo de digestão enzimática e a inibição da tripsina podem ser necessários. Se a taxa de sobrevivência de neurónios é baixo, diluir a concentração de tripsina ou encurtar o tempo de digestão enzimática. O nível de humidade da incubadora deve ser mantida para evitar a pressão osmótica induzida por evaporação no sistema completo ao longo do período de cultura.

A aderência da matriz ao prato é um factor importante para a preparação de boas listras. aderência inadequada aos resultados de superfície prato em um padrão de listras desorganizado. No entanto, a densidade de células e concentração de substrato, também são críticos para uma experiência de sucesso. Uma concentração de proteína mais elevada na faixa é recomendado para análise de uma molécula cuja actividade repulsiva ou atraente é desconhecido. Embora tenhamos demonstrado esse protocolo usando neurônios primários dissociados, também é aplicável para culturas de explantes organotípicas 15.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml centrifuge tube Violamo  1-3500-01
4% Paraformaldehyde (PFA) Nacalai 01954-85
Alexa Fluor 488 Goat anti-human IgG antibody Thermo Scientific A11013
Alexa Fluor 594 Donkey anti-mouse IgG antibody Thermo Scientific A-21203 Dilution 1/500
Anti-Tau1 antibody Chemicon MAB3420 Dilution 1/200
Antifade Thermo Scientific P7481 Alternative mounting media may be used
B27 supplement Thermo Scientific 17504-044 Dilution 1/50
Bovine serum albumin Sigma 01-2030-2
Cell strainer 100 um BD Falcon 352360
Centrifugation machine Kubota 2410
Cover glass 18mmx18mm Matsunami 18x18 mm No. 1
DAKO pen DAKO S2002 Alternative water-repellent pen may be used
Disposable scalpel Feather 2975#11
FBS Thermo Scientific 10437-028
Fluorecent microscope Nikon E600
Forceps No. 5 Fine Science Tools 11254-20
GlutaMAX Thermo Scientific 35050-061 Dilution 1/100
Hamilton Syringe Hamilton 805N 22 gauge, 50 uL
HBSS Thermo Scientific 14170-112
Human IgG, Fc Fragment Jackson 009-000-008
Laminin Thermo Scientific 23017-015
Neurobasal Thermo Scientific 21103-049
Normal Donkey Serum Jackson 017-000-121
PBS Nacalai 14249-24
Penicillin-Streptomycin Thermo Scientific 15070-063 Dilution 1/100
Plastic culture dish, 60 mm Thermo Scientific 150288
Silicone Matrices Available and purchasable from Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
Stereo Microscope Olympus SZ61
Tip, 1000 uL Watson 125-1000S
Transparent sticky tape Tesa 57315 Alternative sticky tape may be used
Triton X-100 Sigma T8787
Trypan blue, 0.4% Bio-Rad 145-0013
Trypsin/EDTA Thermo Scientific 25300-054
Culture medium Neurobasal supplemented with B27, GlutaMAX and Penicillin-Streptomycin.

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References

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