प्ररूपी और सक्रिय विनियामक टी कोशिकाओं के कार्यात्मक विश्लेषण क्रोनिक लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनेंनजाइटिस वायरस से संक्रमित चूहों से अलग

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

विनियामक टी (टी रेग) कोशिकाओं है, जो एक प्रतिलेखन कारक के रूप में Foxp3 एक्सप्रेस, सीडी 4+ टी कोशिकाओं का उपसमुच्चय है। टी कोशिकाओं reg प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विनियमन के द्वारा प्रतिरक्षा सहिष्णुता और homeostasis रखरखाव करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। टी reg कोशिकाओं की प्राथमिक भूमिका प्रेरक टी टी (EFF) कोशिकाओं के प्रसार को और ऐसे IFN-γ, TNF-α, और आईएल -2 के रूप में साइटोकिन्स के उत्पादन को दबाने के लिए है। यह दिखा दिया है कि टी कोशिकाओं reg 'टी eff कोशिकाओं के कार्य को बाधित करने की क्षमता लगातार रोगज़नक़ संक्रमण और कैंसर के विकास के दौरान बढ़ाया है। आराम या सूजन की शर्तों के तहत टी reg कोशिकाओं के समारोह, इन विट्रो दमन माउस या मानव टी reg कोशिकाओं का उपयोग assays की एक किस्म तैयार किया गया है स्पष्ट करने के लिए। इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य phenotype और आराम के बीच दमनकारी समारोह में मतभेद और सक्रिय टी reg तुलना करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए हैकोशिकाओं। सक्रिय टी reg कोशिकाओं को अलग करने के लिए, चूहों LCMV की एक पुरानी तनाव लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनेंनजाइटिस वायरस (LCMV) क्लोन 13 (CL13) से संक्रमित थे। LCMV CL13 संक्रमित चूहों की तिल्ली से अलग टी reg कोशिकाओं टी reg भोले चूहों से अलग कक्षों आराम के साथ तुलना में दोनों सक्रिय phenotype और बढ़ाया दमनकारी गतिविधि का प्रदर्शन किया। यहाँ, हम टी कोशिकाओं reg आराम से सक्रिय टी कोशिकाओं reg भेद करने के लिए पूर्व vivo phenotype के विश्लेषण के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन। इसके अलावा, हम पूरी तरह से सक्रिय टी reg कोशिकाओं की दमनकारी गतिविधि की माप के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Introduction

विनियामक टी (टी रेग) कोशिकाओं को उनके विकास और समारोह 1 के लिए एक प्रतिलेखन कारक के रूप में forkhead बॉक्स पी 3 (Foxp3) व्यक्त करते हैं। इसके अतिरिक्त, टी reg कोशिकाओं CD25 2, लिम्फोसाइट सक्रियण जीन 3 (अंतराल 3) 3, glucocorticoid प्रेरित ट्यूमर परिगलन कारक रिसेप्टर 4, और साइटोटोक्सिक के रूप में विभिन्न अन्य अणुओं को व्यक्त टी लिम्फोसाइट जुड़े प्रोटीन 4 (CTLA-4) 5 उनकी सतह या intracellular क्षेत्र पर। जैसे वायरस 6,7, 8,9 बैक्टीरिया और परजीवी 10-12, या कैंसर के विकास 13,14 के पाठ्यक्रम के रूप में रोगाणुओं की विभिन्न प्रकार के साथ पुराने संक्रमण के दौरान, टी कोशिकाओं को सक्रिय reg कोशिकाओं में विभेदित हो जाते हैं, बढ़ाया दमनकारी समारोह प्रदर्शित लक्षित करने प्रेरक सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी कोशिकाओं। कागज के एक नंबर सुझाव दिया है कि विस्तार किया है और सक्रिय टी कोशिकाओं reg बिगड़ा सीडी 8 + टी सेल respons के लिए योगदानदोस्त रेट्रोवायरस (FV) संक्रमण 15-17 दौरान ई। FV प्रेरित टी कोशिकाओं reg IFN-γ या granzyme बी अभिव्यक्ति और सीडी 8 + टी कोशिकाओं 15-17 के साइटोटोक्सिक जेट रोकना। इसके अलावा, एक दाद सिंप्लेक्स वायरस के संक्रमण मॉडल में, यह सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं की reg कि कमी की सूचना मिली थी वायरस-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं और immunopathogenic सीडी 4+ टी कोशिकाओं 18-20 की घुसपैठ से गंभीर ऊतकों को नुकसान के विस्तार में हुई।

लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनेंनजाइटिस वायरस का क्लोन 13 तनाव के साथ लंबे समय से संक्रमित चूहों (LCMV CL13) 21-24 व्यापक रूप से पुरानी वायरस के संक्रमण के दौरान phenotype और प्रेरक टी कोशिकाओं (टी EFF) और टी reg कोशिकाओं के समारोह को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। लगातार LCMV संक्रमण के दौरान, वायरस विशेष टी कोशिकाओं eff उत्तरोत्तर उनकी प्रेरक समारोह खोना और थक टी (टी exh) कोशिकाओं हो जाते हैं। दूसरी ओर, टी परreg कोशिकाओं वायरस विशेष टी सेल प्रतिक्रिया 25 को दबाने के लिए उनकी क्षमता को सुदृढ़। टी eff कोशिकाओं के कामकाज की क्षमता में कमी ऐसी टी eff कोशिकाओं पर निरोधात्मक रिसेप्टर्स की अपरेगुलेशन, प्रतिजन कोशिकाओं पेश की बदल समारोह, immunoregulatory साइटोकिन्स के उत्पादन, और वृद्धि की आवृत्ति या टी reg की बढ़ी समारोह के रूप में कई कारकों से समझाया जा सकता है कोशिकाओं को 26। टी सेल दमन में शामिल कारकों के अलावा, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु प्रोटीन -1 (पीडी -1) -expressing टी exh कोशिकाओं और टी कोशिकाओं reg व्यापक रूप से प्रतिजन दृढ़ता और दमनकारी पर्यावरण की पहचान के रूप में माना गया है। हाल ही में, यह बताया कि पीडी -1 मार्ग और टी reg कोशिकाओं के पृथक की नाकाबंदी बढ़ाया टी सेल समारोह के लिए नेतृत्व और LCMV पुराने संक्रमण 27 के दौरान वायरल लोड कम था। इसके अलावा, टी कोशिकाओं reg LCMV 23,25 के साथ चूहों के पुराने संक्रमण के दौरान सक्रिय रहे हैं 25 को मजबूत किया है। पीडी -1 अत्यधिक टी reg कोशिकाओं पर साथ ही टी कोशिकाओं exh व्यक्त किया है, और पीडी -1 टी reg कोशिकाओं द्वारा व्यक्त के स्तर पर उनकी दमनकारी समारोह की ताकत टी सेल प्रसार 25 को बाधित करने के साथ संबद्ध।

यहाँ, हम सक्रिय टी reg LCMV CL13 और आराम टी reg भोले चूहों से अलग कोशिकाओं से संक्रमित चूहों से अलग कक्षों की विशेषताओं की तुलना करने के लिए एक विधि का वर्णन। इसके अलावा, हम प्रक्रियाओं को सक्रिय टी reg कोशिकाओं को अलग किया और उनकी पूर्व vivo phenotype की जांच के साथ-साथ इन विट्रो में उनकी दमनकारी गतिविधि को मापने के लिए की एक श्रृंखला समझाओ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस अध्ययन में, चूहों Yonsei विश्वविद्यालय के Yonsei प्रयोगशाला पशु रिसर्च सेंटर की एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त सुविधा में बनाए रखा गया। सभी पशु प्रयोगों Yonsei विश्वविद्यालय में Yonsei प्रयोगशाला पशु अनुसंधान केन्द्र के अंतर्राष्ट्रीय पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग कोरियाई खाद्य एवं औषधि प्रशासन के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया।

1. समाधान की तैयारी

  1. RPMI में 1% से 2% और पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन करने के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) गिराए द्वारा 2% RPMI मीडिया तैयार
  2. पूरा RPMI मीडिया तैयार करें। RPMI करने के लिए मीडिया FBS की 10%, पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन का 1%, एल glutamine के 1%, और 50 माइक्रोन के 2-मर्केप्टोइथेनाल जोड़ें।
  3. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) बफर तैयार करें। FBS के 2% के साथ तो, पूरक फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) ऐसा करने के लिए।
  4. टी सेल अलगाव बफर तैयार करें। ऐसा करने के लिए, FBS के 2% और 2 मिमी ethylenediaminetetraa साथ पीबीएस के पूरकCETIC एसिड।

2. प्लीहा लिम्फोसाइटों के अलगाव

  1. के रूप में पहले 19 में वर्णित भोले या LCMV CL13 संक्रमित चूहों से spleens निकालें और उन्हें 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री 2% RPMI मीडिया के 10 मिलीग्राम से युक्त व्यंजन में जगह है।
    नोट: इस अध्ययन प्रयोगों में, 6 सप्ताह पुरानी करने के लिए 5 C57B1L / 6J मादा चूहों पूंछ नस के माध्यम से नसों में इंजेक्शन के माध्यम से 2 एक्स 10 6 पट्टिका के गठन LCMV CL13 की इकाइयों (pfu) प्राप्त किया। दिन के 16 के बाद संक्रमण (16 डी पीआई) 25 में चूहों बलिदान। विश्लेषण जीई मिलान भोले चूहों में एक ही दिन पर थे।
  2. एक सेल झरनी एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें और 2% RPMI मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ यह कुल्ला। 70 माइक्रोन सेल झरनी पर तिल्ली प्लेस और एक सिरिंज के सवार का उपयोग कर पीस। 2% RPMI मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ सेल झरनी कुल्ला और 50 मिलीलीटर ट्यूब से हटा दें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर 2% RPMI मीडिया और सेंट्रीफ्यूज के साथ ट्यूब भरें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और resuspendएसीके lysing बफर के 1 मिलीलीटर में सेल गोली। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर नमूने सेते हैं।
    नोट: एसीके lysing बफर की मात्रा ऊपर संकेत एक तिल्ली लिए है। जमा तिल्ली के नमूने के लिए तदनुसार मात्रा पैमाने पर।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर 2% RPMI मीडिया और सेंट्रीफ्यूज के साथ ट्यूब भरें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूरा RPMI मीडिया में 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर कोशिकाओं resuspend।
    नोट: जीवित कोशिका गिनती, trypan नीले और केवल कोशिकाओं है कि hemocytometer का उपयोग दाग नहीं कर रहे हैं रहते हैं गिनती के साथ दाग कोशिकाओं के लिए।

3. प्लीहा परम्परागत टी (टी कनव) कोशिकाओं और टी reg प्रकोष्ठों के phenotyping

नोट: टी reg सेल अलगाव से पहले, विभिन्न एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को धुंधला हो जाना और प्रवाह cytometry द्वारा उन्हें विश्लेषण करके भोले या संक्रमित चूहों से अलग प्लीहा लिम्फोसाइटों के phenotype जांच करते हैं।

  1. कोशिकाओं के 50 μl स्थानांतरणएक नई यू नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में कुल प्लीहा लिम्फोसाइटों के बीच (5 x 10 5 कोशिकाओं) और अच्छी तरह से प्रति FACS बफर के 150 μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र।
  2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। सेल गोली आंदोलन और अच्छी तरह से प्रति FACS बफर के 200 μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस (2 बार) पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र।
  3. निम्नलिखित एंटीबॉडी और अभिकर्मकों के साथ अच्छी तरह से प्रति FACS बफर के 50 μl में धुंधला कोशिका की सतह मार्करों के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें। विरोधी CD4 बैंगनी डाई, विरोधी CD25 हरे रंग, विरोधी पीडी -1 बैंगनी डाई, विरोधी सीडी 8 PerCP-Cy5.5 डाई और सेल व्यवहार्यता का पता लगाने अभिकर्मक लगभग अवरक्त (आईआर) फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाशील डाई।
    नोट: आगे सक्रिय टी reg कोशिकाओं के phenotype का विश्लेषण करने के लिए, विरोधी CD103 23,25 कोशिका की सतह मार्कर धुंधला के लिए जोड़ा जा सकता है।
  4. अच्छी तरह से प्रति एंटीबॉडी कॉकटेल के 50 μl के साथ सेल गोली Resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए सेते हैं। कोशिकाओं के साथ दो बार धो4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा FACS बफर।
  5. अंतिम चरण धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला छानना और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार निर्धारण बफर के 100 μl के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक।
  6. कोशिकाओं में दो बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर permeabilization धोने बफर (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार) centrifugation द्वारा के साथ धोएं।
  7. intracellular Foxp3 धुंधला के लिए एंटीबॉडी समाधान तैयार है, और विरोधी Foxp3 एंटीबॉडी समाधान के 50 μl के साथ सेल गोली resuspend।
    नोट: आगे टी कनव और टी कोशिकाओं reg, विरोधी CTLA इस कदम पर जोड़ा जा सकता है के phenotypes का विश्लेषण करने के लिए।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए सेते हैं और 3.6 चरण दोहराएँ। अंतिम चरण धोने के बाद, FACS बफर के 200 μl में सेल गोली resuspend और 25 प्रवाह द्वारा कोशिकाओं के phenotype जांच करते हैं।
  9. गेट जीवित कोशिका आबादीtion। LCMV CL13 संक्रमण के दौरान टी कनव कोशिकाओं के phenotypes का विश्लेषण करने के लिए, Foxp3 की आवृत्ति की जांच - पीडी -1 + सीडी 4+ या सीडी 8 + टी कोशिकाओं के बीच कोशिकाओं।
    नोट: प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर, Foxp3 का प्रतिशत - पीडी -1 + LCMV CL13 के साथ 16 डी गड़बड़ी पर दोनों सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी सेल आबादी में 50% से अधिक है।
    1. आवृत्ति और टी reg कोशिकाओं के phenotypes का विश्लेषण करने के लिए, सीडी 4+ टी कोशिकाओं के बीच Foxp3 + या Foxp3 + पीडी -1 + कोशिकाओं की आवृत्तियों की जांच।
      नोट: प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर, Foxp3 + या Foxp3 + पीडी -1 + कोशिकाओं का प्रतिशत सीडी 4+ टी सेल की आबादी में 20% से अधिक, क्रमशः है।

4. सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं के अलगाव reg

नोट: सभी अभिकर्मकों की मात्रा नीचे संकेत एक के लिए कर रहे1 10 x 7 कुल splenocytes की सेल नंबर शुरू।

  1. धारा 2 अनुभवहीन और LCMV लंबे समय से संक्रमित चूहों का उपयोग करने में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को तैयार। टी सेल अलगाव बफर के 10 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूरी तरह से बफर के 40 μl में सेल गोली resuspend।
  2. सीडी 4+ टी सेल चुंबकीय सेल जुदाई प्रणाली का उपयोग संवर्धन के लिए, बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के 10 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. बफर के 30 μl, गैर सीडी 4+ टी कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए विरोधी बायोटिन सूक्ष्म मोती के 20 μl और CD25 + कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए CD25 पीई एंटीबॉडी के 10 μl जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और अंधेरे में 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें और सेल मलबे को हटाने के लिए एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती हैं। कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा धो लें।सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूरी तरह से अप करने के लिए 1.25 x 10 8 कोशिकाओं के घनत्व पर 500 μl बफर में सेल गोली resuspend।
  5. स्तंभ पर कोशिकाओं को लागू करें और लेबल हटाया गया कोशिकाओं है कि स्तंभ के माध्यम से पारित इकट्ठा। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर बफर और सेंट्रीफ्यूज के 2 मिलीलीटर जोड़कर स्तंभ धो लें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूरी तरह से बफर के 90 μl में पृथक सीडी 4+ टी कोशिकाओं resuspend।
  6. CD25 + कोशिकाओं के चुंबकीय लेबलिंग के लिए, विरोधी पीई microbeads के 10 μl जोड़ने के मिश्रण अच्छी तरह से, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा धो लें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूरी तरह से अप करने के लिए 1 एक्स 10 8 कोशिकाओं के घनत्व पर बफर के 500 μl में सेल गोली resuspend।
  8. सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं reg को समृद्ध करने के लिए, सकारात्मक चयन के लिए स्तंभ पर कोशिकाओं लागू होते हैं, और colum धोनेबफर के 2 मिलीलीटर जोड़कर एन। धोने तीन बार दोहराएँ।
  9. जब स्तंभ अंतिम चरण धोने के बाद खाली है, स्तंभ पर बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और बाहर निकलवाने चुंबकीय लेबल सीडी 4 + CD25 + सवार का उपयोग कोशिकाओं।
  10. दोहराएँ कदम 4.8-4.9 पृथक सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं reg की शुद्धता बढ़ाने के लिए। FACS बफर के साथ कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा धो लें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूरा RPMI मीडिया में 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में पृथक सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं resuspend reg।
  11. पृथक-सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं reg की शुद्धता की जांच करने के लिए, कुल पृथक-सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं reg से 2 x 10 5 कोशिकाओं का उपयोग करें। FACS बफर के 50 μl विरोधी CD4 FITC युक्त और सेल व्यवहार्यता पास आईआर फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाशील डाई अभिकर्मक का पता लगाने के साथ कोशिकाओं दाग।
    नोट: CD25 पहले से अलगाव के दौरान पीई के साथ चिह्नित किया गया।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए सेते हैं। FACS बफर के साथ कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा धो लें। धोने के बाद, FACS बफर के 100 μl में सेल गोली resuspend और प्रवाह cytometry द्वारा पवित्रता की जाँच करें।
  13. गेट रहते सेल आबादी। टी reg कोशिकाओं की पवित्रता का विश्लेषण करने के लिए, सीडी 4 + CD25 + कोशिकाओं का प्रतिशत की पुष्टि करें।
    नोट: प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर शुद्ध कोशिकाओं के बीच सीडी 4 + CD25 + कोशिकाओं के प्रतिशत के बारे में 80% से अधिक है।

5. सीडी 8 + टी कोशिकाओं और सीडी 8 + टी कोशिकाओं की लेबलिंग का अलगाव

नोट: सभी अभिकर्मकों की मात्रा नीचे संकेत 1 10 x 7 कुल splenocytes की एक प्रारंभिक सेल नंबर के लिए कर रहे हैं।

  1. धारा 2 में वर्णित के रूप में भोले चूहों का उपयोग कोशिकाओं को तैयार है। टी सेल अलगाव शौकीन के 10 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लेंइंजी। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से त्यागें, और बफर के 40 μl में सेल गोली resuspend।
  2. सीडी 8 + टी सेल चुंबकीय सेल जुदाई प्रणाली का उपयोग करते हुए अलगाव के लिए, गैर सीडी 8 + टी सेल लेबलिंग के लिए बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के 10 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. बफर के 30 μl और विरोधी बायोटिन microbeads के 20 μl जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. स्तंभ पर कोशिकाओं को लागू करें और लेबल हटाया गया कोशिकाओं है कि स्तंभ के माध्यम से पारित इकट्ठा। तीन बार बफर के 2 मिलीलीटर जोड़कर स्तंभ धो लें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूरी तरह से बफर के 2 मिलीलीटर में पृथक सीडी 8 + टी कोशिकाओं resuspend।
  6. अलग कक्षों की शुद्धता की जांच करने के लिए, FACS बफर में एंटीबॉडी समाधान के 50 μl तैयार करते हैं। 2 एक्स 10 5 अलग सीडी 8 + टी सेल के बीच में कोशिकाओं Resuspendएंटीबॉडी समाधान के 50 μl में रास।
    नोट: एंटीबॉडी समाधान तैयार करने के लिए, विरोधी सीडी 8 FITC जोड़ने के लिए, और सेल व्यवहार्यता का पता लगाने अभिकर्मक (पास आईआर फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाशील डाई) FACS बफर में।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए सेते हैं। FACS बफर के साथ कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा धो लें। धोने के बाद, FACS बफर के 100 μl में सेल गोली resuspend, और प्रवाह cytometry द्वारा कोशिकाओं की शुद्धता की जाँच करें।
  8. गेट रहते सेल आबादी। सीडी 8 + टी कोशिकाओं की शुद्धता की जांच करने के लिए, सीडी 8 + टी कोशिकाओं का प्रतिशत की पुष्टि करें।
    नोट: प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर शुद्ध कोशिकाओं के बीच सीडी 8 + कोशिकाओं का प्रतिशत लगभग 90% से अधिक है।
  9. पृथक सीडी 8 + टी कोशिकाओं को पीबीएस जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। पीबीएस में 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में पृथक सीडी 8 + टी कोशिकाओं Resuspend।
  10. सीडी 8 + टी सीई लेबल करने के लिएइन विट्रो दमन परख के लिए lls, पीबीएस में सेल प्रसार ट्रैकिंग बैंगनी डाई पतला आरटी पर 5 माइक्रोन की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए।
    नोट: सेल प्रसार ट्रैकिंग बैंगनी अध्ययन में इस्तेमाल डाई की अनुमानित उत्तेजना और उत्सर्जन चोटियों 405 और 450 एनएम, क्रमशः रहे हैं।
  11. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल प्रसार ट्रैकिंग बैंगनी डाई (5 सुक्ष्ममापी) और सेल निलंबन (सीडी 8 + टी कोशिकाओं की 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल) की अच्छी तरह से बराबर मात्रा मिक्स, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट पर सेते हैं। ट्यूब भंवर हर 10 मिनट।
  12. ठंड पूरा RPMI मीडिया के साथ ट्यूब भरने, और आरटी पर 10 मिनट के लिए ट्यूब छोड़ दें। आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से त्यागें, और पूर्व गर्म पूरा RPMI मीडिया के साथ 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में कोशिकाओं resuspend। आरटी पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।

6. इन विट्रो दमन परख सीडी 4 + CD25 + टी <का उपयोग स्थापनाउप> reg और सीडी 8 + टी कोशिकाओं

  1. विरोधी CD3 / CD28 लेपित माला तैयार करने के लिए, (2.5 μl / 1 x 10 5 कोशिकाओं) ट्यूब के एक 15 मिलीलीटर करने के लिए चुंबकीय मोतियों की उचित मात्रा हस्तांतरण। पीबीएस के एक बराबर मात्रा और मिश्रण जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा धो और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। पूरा मीडिया में चुंबकीय मोती (50 μl / अच्छी तरह से) पतला।
  2. अशेष 50 सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं की reg μl प्रति यू नीचे 96 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से (1 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से)। प्रत्युत्तर टी (टी resp) के रूप में सीडी 8 + टी कोशिकाओं कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से (1 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) के 50 μl जोड़ें। अच्छी तरह से प्रति में पतला विरोधी CD3 / CD28 लिपटे मोतियों के 50 μl जोड़ें।
    नोट: नियंत्रण कुओं की स्थापना इस कदम, लेबल और इस प्रकार है: कोई विरोधी CD3 / CD28 लिपटे मोतियों के साथ "unstimulated सीडी 8 + टी सेल केवल"; विरोधी CD3 / CD28 लिपटे मोतियों के साथ "केवल सीडी 8 + टी सेल"; "सीडी 8 + टी सेल केवल"विरोधी CD3 / CD28 लिपटे मोतियों के साथ;"। टी reg सेल विरोधी CD3 / CD28 लिपटे मोतियों के साथ ही "टी reg कोशिकाओं टी का एक अलग अनुपात में पूरा मीडिया और सह-सुसंस्कृत टी resp कोशिकाओं के साथ से पतला किया जा सकता resp कोशिकाओं: टी ​​reg कोशिकाओं (1: 0.25-1: 1)।
  3. 200 μl की कुल मात्रा के सभी कुओं में 50 μl या मीडिया की उचित मात्रा में जोड़ें। पन्नी के साथ कवर प्लेट और 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते हैं।

7. सीडी 8 के विश्लेषण + टी सेल प्रसार और साइटोकाइन उत्पादन सीडी 8 + टी कोशिकाओं से

  1. साइटोकाइन उत्पादन विश्लेषण के लिए, संस्कृति के 3 दिन बाद, एक और अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक की सतह पर तैरनेवाला अलग और एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: सतह पर तैरनेवाला aliquoted और -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। इस प्रयोग में, विरोधी माउस IFN-γ एंटीबॉडी लेपित प्लेट IFN-γ उत्पादन समझौते पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया थानिर्माता प्रोटोकॉल के लिए हैैं। एक एकल कोशिका के स्तर पर सीडी 8 + टी कोशिकाओं proliferating के IFN-γ उत्पादन का निर्धारण करने के लिए, intracellular साइटोकाइन धुंधला किया जा सकता है।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला अलग होने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस (3 बार) पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर FACS बफर और सेंट्रीफ्यूज के साथ कोशिकाओं से युक्त प्लेट धो लें।
  3. धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें। प्रचूर मात्रा में सीडी 8 + टी कोशिकाओं के धुंधला के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल के 50 μl के साथ सेल गोली Resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करने के लिए, FACS बफर में विरोधी CD4 FITC, विरोधी सीडी 8 PerCP-Cy5.5, और सेल व्यवहार्यता का पता लगाने अभिकर्मक (पास आईआर फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाशील डाई) जोड़ें।
    नोट: इस तरह के CD44 या CD69 के रूप में विभिन्न मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी सीडी 8 + टी कोशिकाओं की सक्रियता इस बात की पुष्टि करने के लिए अन्य एंटीबॉडी के साथ जोड़ा जा सकता है। याद रखें कि सीडी 8 + टी कोशिकाओं को पहले से ही सेल प्रसार ट्रैकिंग वी के साथ चिह्नित किया गया हैचरण 5.10 पर iolet डाई।
  4. दो बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा धो लें। अंतिम चरण धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और निर्धारण बफर के 100 μl के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक।
  5. दो बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा धो लें। FACS बफर के 200 μl के साथ कोशिकाओं resuspend और प्रवाह cytometry द्वारा सेल प्रसार ट्रैकिंग बैंगनी डाई लेबल सीडी 8 + टी कोशिकाओं के प्रसार को मापने।
    1. गेट जीवित कोशिकाओं के बीच सीडी 8 + टी सेल की आबादी। सेल प्रसार ट्रैकिंग बैंगनी डाई और निम्न समीकरण के अनुसार सीडी 8 + टी सेल कमजोर पड़ने के कमजोर पड़ने के हिसाब से बांटा और अविभाजित कोशिकाओं के प्रतिशत के उपाय। % निषेध = [(टी reg कोशिकाओं के अभाव में प्रचूर मात्रा में सीडी 8 + टी कोशिकाओं की% - टी reg कोशिकाओं की उपस्थिति में प्रचूर मात्रा में सीडी 8 + टी कोशिकाओं की%) / (प्रचूर मात्रा में सीडी 8 + टी कोशिकाओं की%टी reg कोशिकाओं के अभाव)] x 100 आगे सॉफ्टवेयर 25 प्रवाह cytometry का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम उन्हें नसों के LCMV CL13 के 2 एक्स 10 6 pfu के साथ इंजेक्शन लगाने के द्वारा लगातार वायरस के संक्रमण के साथ चूहों उत्पन्न। टी reg कोशिकाओं और पुरानी वायरस के संक्रमण के दौरान टी कोशिकाओं में कनव प्ररूपी परिवर्तन की जांच करने के लिए, भोले और संक्रमित चूहों से प्राप्त प्लीहा लिम्फोसाइट विभिन्न एंटीबॉडी के साथ दाग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया। सीडी 4+ टी कनव (चित्रा 1 ए, ऊपरी पैनल) और Foxp3 - - सीडी 8 + टी कनव (चित्रा 1 बी, ऊपरी पैनल) कोशिकाओं 16 डी गड़बड़ी पर, पीडी -1 दोनों Foxp3 में upregulated था। Foxp3 + सीडी 4+ टी कोशिकाओं की आवृत्ति reg भोले चूहों (चित्रा 1 ए) की तुलना में LCMV CL13 संक्रमित चूहों में दो गुना अधिक था। विशेष रूप से, Foxp3 + सीडी 4+ टी कोशिकाओं reg के सबसे सक्रिय phenotype प्रदर्शित, के उच्च स्तर व्यक्तपीडी -1 इस समय बिंदु (चित्रा 1 ए) पर।

इन विट्रो दमन परख के लिए, सीडी 8 + टी कोशिकाओं और कनव सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं reg की काफी संख्या में आवश्यक थे। 1 10 x 7 सेल प्रसार ट्रैकिंग बैंगनी डाई लेबल सीडी 8 + टी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, भोले चूहों के दो spleens से splenocytes जमा थे। 2 एक्स 10 6 या 3 एक्स 10 सीडी 4 + CD25 + टी कोशिकाओं reg के 6 प्राप्त करने के लिए, भोले और LCMV CL13 संक्रमित चूहों से कम से कम तीन spleens, क्रमशः, जमा थे। टी resp कोशिकाओं के रूप में सीडी 8 + टी कोशिकाओं अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं (2A चित्रा) के साथ महत्वपूर्ण संदूषण के बिना सफलतापूर्वक अलग हो गए थे। टी reg कोशिकाओं को भी 80% से अधिक शुद्धता (चित्रा 2 बी) के साथ CD25 + सीडी 4+ टी कोशिकाओं की एक प्रमुख आबादी के साथ, अलग किया जा सकता है।

भोले और पुरानी टी reg कोशिकाओं की दमनकारी समारोह की तुलना करने के लिए, अलग-थलग टी reg और टी resp कोशिकाओं को एक साथ उत्तेजना के तहत विरोधी CD3 / CD28 लिपटे मोतियों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए incubated रहे थे। सीडी 8 + टी resp सेल प्रसार के निषेध% एक टी reg सेल Dese निर्भर तरीके (चित्रा 3 ए) में वृद्धि की गई थी। जब सीडी 8 + टी कोशिकाओं resp 1 के अनुपात में पुरानी टी reg कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत थे: 1, सीडी 8 + टी resp कोशिकाओं के प्रसार को काफी हिचकते थे (चित्रा 3 बी)। सीडी 8 + टी कोशिकाओं द्वारा resp IFN-γ उत्पादन जब सीडी 8 + टी कोशिकाओं resp लंबे समय से संक्रमित चूहों से नहीं बल्कि एक टी reg में भोले चूहों से टी कोशिकाओं reg आराम के साथ सक्रिय टी reg कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत थे भी काफी हिचकते थे (चित्रा 3 सी)।

आकृति 1
चित्रा 1: 16 घ पीआई (ए) पीडी -1 या CD25 Foxp3 पर की अभिव्यक्ति पर भोले चूहों या LCMV CL13 संक्रमित चूहों की तिल्ली में सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी कोशिकाओं की phenotypes - सीडी 4+ टी कनव और Foxp3 + सीडी 4+ टी reg कोशिकाओं। (बी) Foxp3 पर पीडी -1 या CD25 की अभिव्यक्ति - सीडी 8 + टी कोशिकाओं कनव। प्लीहा लिम्फोसाइट सीडी 4, सीडी 8, CD25, पीडी -1, और Foxp3 खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। डेटा, तीन स्वतंत्र अनुभवों के प्रतिनिधि हैं। पैनल एक 25 एक संदर्भ के रूप से संशोधित किया गया है। क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र 2
चित्रा 2: टी resp भोले चूहों और टी कोशिकाओं reg भोले या LCMV CL13 संक्रमित चूहों से अलग से अलग कक्षों की purities (ए) अलगाव के बाद सीडी 8 + टी कोशिकाओं का प्रतिशत।। (बी) के अलगाव के बाद CD25 व्यक्त सीडी 4+ टी कोशिकाओं का प्रतिशत reg। (बी) में प्रत्येक चक्र CD4 और CD25 की अभिव्यक्ति के स्तर से निर्धारित किया गया था। डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लेस / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg "/>
चित्रा 3: सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया पर सक्रिय टी reg कोशिकाओं के प्रभाव (एक) सीडी 8 + टी कोशिकाओं एक टी reg सेल खुराक पर निर्भर ढंग से टी reg कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत का% निषेध।। (बी) 1 में सीडी 8 + टी कोशिकाओं टी reg कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत का प्रसार: 1 अनुपात। (सी) IFN-γ सीडी 8 + टी कोशिकाओं एक टी reg सेल खुराक पर निर्भर ढंग से टी reg कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत का उत्पादन। सीडी 8 + टी कोशिकाओं के प्रसार को प्रचूर मात्रा में सीडी 8 + टी कोशिकाओं और IFN-γ स्राव में सेल प्रसार ट्रैकिंग बैंगनी डाई के कमजोर पड़ने से मापा गया था एलिसा द्वारा मूल्यांकन किया गया था। सेल प्रसार ट्रैकिंग बैंगनी डाई लेबल सीडी 8 + टी कोशिकाओं अनुपस्थिति या टी की उपस्थिति में 3 दिनों के लिए विरोधी CD3 / CD28 लिपटे मोतियों साथ प्रेरित किया गया + टी कोशिकाओं के साथ और टी reg कोशिकाओं के बिना, क्रमशः सह सुसंस्कृत के प्रसार प्रतिशत से संकेत मिलता है। हिस्टोग्राम में भरा ग्रे चोटियों सीडी 8 + टी कोशिकाओं टी कोशिकाओं के बिना reg सह सुसंस्कृत के प्रसार का संकेत मिलता है। प्रत्येक समूह triplicates में डिजाइन किया गया था। सलाखों मतलब + SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा एक संदर्भ के रूप में 25 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हालांकि केवल टी reg कोशिकाओं की एक छोटी संख्या चूहों और इंसानों में मौजूद हैं, यह रूप में वे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित करने और प्रतिरक्षा सहिष्णुता बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं उनके कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। टी की संख्या और दमनकारी कार्यों के लिए एक पुरानी वायरस के संक्रमण 15-20 के साथ ही कैंसर की प्रगति 13,14 के दौरान कोशिकाओं बढ़ जाती है Reg। यह शायद जारी रखा प्रतिजन उत्तेजना के कारण है। टी reg कोशिकाओं प्रतिजन दृढ़ता और रोग के विकास के तहत समारोह का मूल्यांकन करने के लिए, उनकी दमनकारी गतिविधि मापा जाना चाहिए।

यहाँ, हम टी reg कोशिकाओं के पूर्व vivo phenotype विश्लेषण और सीडी 8 + टी कोशिकाओं और टी reg कोशिकाओं की इन विट्रो सह संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर अपने दमनकारी गतिविधि को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। वर्तमान प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम विश्लेषण और टी reg कोशिकाओं के अलगाव हैं। लाइव और हौसले से पृथक टी इन विट्रो में स्पष्ट दमनकारी सक्रियता दिखाई। हम यह भी एक पुरानी वायरस के संक्रमण के दौरान टी कनव और टी reg कोशिकाओं के phenotypes की जांच की। टी कोशिकाओं कनव, यानी, Foxp3 - सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी कोशिकाओं पुरानी वायरस के संक्रमण (चित्रा 1) के बाद सेलुलर गतिविधि में कमी देखी गई। पीडी -1 अभिव्यक्ति दोनों टी कनव सेल आबादी में upregulated था। टी reg सेल संख्या में वृद्धि और अप-विनियमन पीडी -1 अभिव्यक्ति की एक पुरानी वायरस के संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की पहचान कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, टिम-3 और CTLA-4 के रूप में अन्य निरोधात्मक रिसेप्टर्स के लिए विरोधी निकायों choric वायरस के संक्रमण के बाद FACS द्वारा टी सेल phenotype जांच करने के लिए पीडी -1 के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है।

आदेश दमनकारी गतिविधि की जांच करने के लिए, टी resp कोशिकाओं और टी कोशिकाओं reg टी reg के साथ 1 1 करने के लिए सह संस्कृति के अनुपात में सह-सुसंस्कृत थेलंबे समय से संक्रमित चूहों से कोशिकाओं को काफी सीडी 8 + टी सेल प्रसार और IFN-γ स्राव कम जब भोले चूहों से टी reg कोशिकाओं की तुलना में। इसका मतलब है कि सीडी 8 + टी कोशिकाओं टी reg कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत के प्रसार और साइटोकाइन उत्पादन व्युत्क्रमानुपाती टी reg कोशिकाओं की दमनकारी समारोह से संबंधित हैं। हालांकि इस प्रोटोकॉल टी reg सेल अलगाव, गैर टी reg कोशिकाओं के साथ संदूषण के लिए एक चुंबकीय सेल जुदाई प्रणाली के उपयोग की सिफारिश की संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता। टी reg Foxp3-GFP संवाददाता चूहों 28-30 से प्राप्त कोशिकाओं, बेहतर उम्मीदवार सही चुंबकीय सेल जुदाई प्रणाली की तुलना में टी reg कोशिकाओं के समारोह की जांच कर रहे हैं के रूप में CD25 अक्सर सक्रिय सीडी 4+ टी कनव के साथ ही टी कोशिकाओं पर reg overexpressed है।

टी reg कोशिकाओं की दमनकारी समारोह विभिन्न इन विट्रो द्वारा मूल्यांकन किया गया हैदमन assays 16,28,31-34। इन विट्रो दमन परख का लाभ यह है कि यह सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया के निषेध पर टी reg कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रभाव का मूल्यांकन करता है, क्योंकि केवल टी resp कोशिकाओं टी reg कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत हो रहा है। सीडी 8 + टी कोशिकाओं के अलावा, CD25 - सीडी 4+ टी कोशिकाओं टी कोशिकाओं resp 25 के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। इस तरह के वृक्ष के समान कोशिकाओं या प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के रूप में टी reg या प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर टी कनव कोशिकाओं के प्रभाव प्रयोगात्मक स्थिति बदलती द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।

ऐसे CD103 35, अंतराल 3 36 के रूप में अणुओं, ए repetitions ग्लाइकोप्रोटीन 37 प्रमुख, CD43 38, CD11a 38, या हत्यारा सेल लेक्टिन की तरह रिसेप्टर उपप्रजाति जी सदस्य 1 38 विशिष्ट रोगों में सक्रिय टी reg कोशिकाओं के मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक के रूप में पीडी -1 इस्तेमाल कियासूचक पुरानी वायरस के संक्रमण के दौरान टी कोशिकाओं को सक्रिय reg की पहचान। इस प्रोटोकॉल विशेष परिस्थितियों में टी reg कोशिकाओं के बहुमुखी विश्लेषण (प्ररूपी और कार्यात्मक) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072
Cell strainer, 70 mm BD Biosciences 352350
Cell strainer, 40 mm BD Biosciences 352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1x) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences
Flowjo TreeStar
Hematocytomer Marienfeld superior

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299, (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155, (3), 1151-1164 (1995).
  3. Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21, (4), 503-513 (2004).
  4. McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16, (2), 311-323 (2002).
  5. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192, (2), 303-310 (2000).
  6. Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107, (11), 4424-4432 (2006).
  7. Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174, (6), 3143-3147 (2005).
  8. Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123, (1), 50-59 (2007).
  9. Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207, (7), 1409-1420 (2010).
  10. Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420, (6915), 502-507 (2002).
  11. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207, (11), 2331-2341 (2010).
  12. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33, (4), 181-189 (2012).
  13. You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182, (10), 6160-6167 (2009).
  14. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10, (9), 942-949 (2004).
  15. Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20, (3), 293-303 (2004).
  16. Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176, (6), 3342-3349 (2006).
  17. Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, (16), 9226-9230 (2001).
  18. Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198, (6), 889-901 (2003).
  19. Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172, (7), 4123-4132 (2004).
  20. Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189, (12), 5924-5933 (2012).
  21. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, (4), 670-684 (2007).
  22. Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (33), 14733-14738 (2010).
  23. Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (9), 3677-3682 (2011).
  24. Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10, (1), 29-37 (2009).
  25. Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194, (12), 5801-5811 (2015).
  26. Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138, (1), 30-50 (2009).
  27. Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211, (9), 1905-1918 (2014).
  28. Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12, (10), 1002-1009 (2011).
  29. Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18, (10), 1525-1530 (2012).
  30. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209, (10), 1713-1722 (2012).
  31. Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119, (22), 5155-5163 (2012).
  32. Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79, (12), 7852-7859 (2005).
  33. Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2, (269), (2011).
  34. Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119, (9), 2590-2600 (2009).
  35. Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118, (6), 1342-1349 (2006).
  36. Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184, (11), 6545-6551 (2010).
  37. Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13439-13444 (2009).
  38. Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190, (11), 5485-5495 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics