Analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T activées Regulatory Isolés de chorioméningite lymphocytaire Souris infectées par le virus chroniques

Immunology and Infection

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Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

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Abstract

Cellules régulatrices T (T reg), qui expriment Foxp3 comme un facteur de transcription, sont des sous - ensembles de cellules T CD4 +. Lymphocytes T reg jouent un rôle crucial dans la tolérance immunitaire et le maintien de l' homéostasie en régulant la réponse immunitaire. Le rôle principal des cellules T reg est de supprimer la prolifération des T effecteurs (Teff) des cellules et la production de cytokines telles que l' IFN-γ, le TNF-α et IL-2. Il a été démontré que la capacité des cellules T Reg pour inhiber la fonction des cellules T eff est augmentée au cours de l' infection par le pathogène persistant et le développement du cancer. Afin de clarifier la fonction des cellules T reg sous repos ou enflammées conditions, une variété de tests in vitro de suppression en utilisant des cellules reg souris ou T humains ont été mis au point. L'objectif principal de cette étude est de développer une méthode pour comparer les différences dans le phénotype et la fonction suppressive entre repos et T reg activécellules. D'isoler des cellules T activées reg, les souris ont été infectées avec le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) , le clone 13 (CL13), une souche de LCMV chronique. Lymphocytes T reg isolés de la rate des souris infectées par LCMV-CL13 présentaient à la fois le phénotype activé et l' activité suppressive accrue par rapport aux cellules T au repos reg isolées à partir de souris naïves. Ici, nous décrivons le protocole de base pour une analyse ex vivo de phénotype de distinguer les cellules reg T activées à partir de cellules au repos T reg. En outre, on décrit un protocole pour la mesure de l'activité suppressive des cellules T reg complètement activés.

Introduction

Cellules régulatrices T (T reg) expriment forkhead box P3 (Foxp3) en tant que facteur de transcription pour leur développement et la fonction 1. En outre, les cellules T reg expriment diverses autres molécules telles que CD25 2, le gène lymphocyte activation 3 (LAG-3) 3, d'une tumeur du récepteur du facteur de nécrose induite par glucocorticoïde-4 et des lymphocytes T cytotoxiques-associated protein 4 (CTLA-4) 5 sur leur surface ou la région intracellulaire. Au cours de l' infection chronique par divers types d'organismes pathogènes tels que les virus, les bactéries 6,7 à 8,9 et les parasites 10-12, ou dans le cadre du développement du cancer 13,14, les cellules T reg se différencient en cellules activées, l' affichage amélioré la fonction suppressive des cellules effectrices CD4 + et de ciblage T CD8 +. Un certain nombre d'articles ont suggéré que les cellules T reg élargies et activées contribuent aux responsab dépréciés de lymphocytes T CD8 +e pendant ami retrovirus (FV) infection 15-17. Cellules T reg FV-induites inhibent l' IFN-γ ou l' expression du granzyme B et réactivité cytotoxique des cellules T CD8 + 15-17. En outre, dans un modèle d'infection par le virus de l' herpès simplex, il a été rapporté que l' épuisement des cellules reg CD4 + CD25 + T conduit à l' expansion de cellules T CD8 + spécifiques du virus et de graves lésions tissulaires par une infiltration de cellules T CD4 + immunopathogènes 18-20.

Les souris infectées de manière chronique avec la souche 13 clone du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV CL13) 21-24 ont été largement utilisés pour caractériser le phénotype et la fonction des cellules T effectrices (T eff) et des cellules T reg durant une infection virale chronique. Au cours de l' infection par LCMV persistante, les cellules eff spécifique du virus T perdent progressivement leur fonction d'effecteur et deviennent des cellules épuisées T (T exh). D'un autre côté, Tcellules reg renforcent leur capacité à supprimer la réponse cellulaire spécifique du virus T 25. La diminution de la capacité de fonctionnement des cellules eff T peut être expliquée par plusieurs facteurs tels que la régulation positive des récepteurs inhibiteurs sur les cellules eff T, la fonction altérée des cellules présentatrices d'antigène, la production de cytokines immunorégulatrices, et augmentation de la fréquence ou de la fonction améliorée de T reg cellules 26. Parmi les facteurs impliqués dans la suppression des cellules T, la mort cellulaire programmée protein-1 (PD-1) exprimant les cellules éch T et les cellules T reg ont été largement considérées comme les caractéristiques de l' antigène de persistance et de l' environnement suppressive. Récemment, il a été signalé que le blocage de la voie PD-1 et l' ablation des cellules T reg conduit à l' amélioration de la fonction des cellules T et une diminution de la charge virale au cours LCMV infection chronique 27. En outre, les cellules T reg sont activées lors de l' infection chronique de souris avec 23,25 LCMV 25. PD-1 est fortement exprimé sur les lymphocytes T reg ainsi que des cellules T EXH, et le niveau de PD-1 exprimé par les cellules T reg est en corrélation avec la force de leur fonction suppressive pour inhiber la prolifération des lymphocytes T 25.

Ici, nous décrivons une méthode pour comparer les caractéristiques des cellules T activées reg isolées à partir de souris infectées par LCMV CL13 et de repos des cellules T reg isolées de souris naïves. En outre, nous expliquons une série de processus pour séparer les cellules reg T activées et examiner leur ex vivo phénotype, ainsi que de mesurer leur activité suppressive in vitro.

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Protocol

Dans cette étude, les souris ont été maintenues dans une installation spécifique sans pathogène du Centre de recherche animale Yonsei Laboratoire de l'Université Yonsei. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées en conformité avec les lignes directrices coréenne Food and Drug Administration en utilisant des protocoles approuvés par le Comité international de soins et de l'utilisation des animaux du Centre de recherche animale Yonsei Laboratory à l'Université Yonsei.

1. Préparation des solutions

  1. Préparer un milieu RPMI à 2% par dilution de sérum bovin fœtal (FBS) à 2% et de la pénicilline-streptomycine à 1% dans du RPMI
  2. Préparer un milieu complet RPMI. À ajouter du milieu RPMI 10% SVF, 1% de pénicilline-streptomycine, 1% de L-glutamine et 50 pM de 2-mercaptoéthanol.
  3. Préparer cellules activées par fluorescence (FACS) tampon. Pour ce faire une solution saline ainsi, supplément tamponnée au phosphate (PBS) avec 2% de FBS.
  4. Préparer un tampon T d'isolement des cellules. Pour ce faire, compléter PBS avec 2% de FBS et mM ethylenediaminetetraa 2l'acide CETIC.

2. Isolement des lymphocytes spléniques

  1. Retirer les rates de souris naïves ou LCMV CL13 infectés comme décrit précédemment 19 et placez - les dans 60 mm x 15 mm de boîtes de Pétri contenant 10 ml de 2% du milieu RPMI.
    NOTE: Dans cette étude , des expériences, de 5 à 6 semaines d'âge C57B1L / 6J souris femelles reçu 2 x 10 6 unités (pfu) de formation de plaques de LCMV CL13 par injection intraveineuse via la veine de la queue. Sacrifiez les souris au jour 16 post-infection (16 pi d) 25. souris naïves Analyser ge-appariés étaient le même jour.
  2. Placer un tamis cellulaire dans un tube de 50 ml et le rincer avec 2 ml de 2% du milieu RPMI. Placer la rate sur le tamis cellulaire de 70 pm et broyer utilisant le piston d'une seringue. Rincer la crépine de cellules avec 2 ml de 2% du milieu RPMI et le retirer du tube de 50 ml.
  3. Remplir le tube avec 2% du milieu RPMI et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et resuspendre leculot cellulaire dans 1 ml de tampon de lyse ACK. Incuber les échantillons à température ambiante (TA) pendant 5 minutes.
    NOTE: Le volume de tampon de lyse ACK indiqué ci-dessus est pour une rate. Intensifier le volume en conséquence pour les échantillons de rate communs.
  4. Remplir le tube avec 2% du milieu RPMI et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules à une densité de 1 x 10 7 cellules / ml dans un milieu RPMI complet.
    NOTE: Pour le comptage des cellules vivantes, cellules de coloration au bleu trypan et compter que les cellules qui ne sont pas colorées en utilisant hémocytomètre vivre.

3. phénotypage de splénique conventionnel T (T conv) Cellules et cellules T reg

REMARQUE: avant isolement des cellules Treg, examiner le phénotype des lymphocytes spléniques isolés à partir de souris naïves ou infectées par coloration des cellules avec divers anticorps et en les analysant par cytométrie en flux.

  1. Transférer 50 pl de cellules(5 x 10 5 cellules) chez les lymphocytes spléniques totales dans chaque puits d'une nouvelle plaque de 96 puits à fond en U et ajouter 150 pi de tampon FACS par puits. Centrifuger à 300 g pendant 2 min à 4 ° C.
  2. Jeter le surnageant. Agiter le culot de cellules et ajouter 200 ul de tampon pour FACS par puits. Centrifuger à 300 g pendant 2 min à 4 ° C (2 fois).
  3. Préparer le cocktail d'anticorps pour des marqueurs de surface cellulaire coloration dans 50 ul de tampon pour FACS par puits avec les anticorps et les réactifs suivants. Anti-CD4 colorant violet, Anti-CD25 colorant vert, Anti-PD-1 colorant violet, Anti-CD8 PerCP-Cy5.5 colorant et la viabilité cellulaire réactif de détection proche infrarouge (IR) colorant réactif fluorescent.
    NOTE: Pour analyser davantage le phénotype des cellules reg T activées, anti-CD103 23,25 peut être ajouté pour la surface cellulaire marqueur coloration.
  4. Remettre en suspension le culot cellulaire avec 50 ul de cocktail d'anticorps par puits. Incuber pendant 20 minutes dans l'obscurité à 4 ° C. Laver les cellules deux fois avectampon FACS par centrifugation à 300 g pendant 2 min à 4 ° C.
  5. Après l'étape finale de lavage, décanter le surnageant et on fixe les cellules pendant 20 min dans l'obscurité à 4 ° C avec 100 pl de tampon de fixation préparées selon le protocole du fabricant.
  6. Laver les cellules deux fois avec le tampon de lavage de perméabilisation (préparé selon le protocole du fabricant) par centrifugation à 300 g pendant 2 min à 4 ° C.
  7. Préparer la solution d'anticorps pour la coloration intracellulaire Foxp3, et remettre en suspension le culot cellulaire avec 50 ul de solution d'anticorps anti-Foxp3.
    NOTE: Pour analyser davantage les phénotypes de T conv et des cellules T reg, anti-CTLA peut être ajouté à cette étape.
  8. Incuber pendant 20 minutes dans l'obscurité à 4 ° C et répétez l'étape 3.6. Après l'étape finale de lavage, la remise en suspension du culot cellulaire dans 200 pi de tampon pour FACS et examiner le phénotype des cellules par cytométrie de flux 25.
  9. Porte de la popula de cellules vivantestion. Pour analyser les phénotypes des cellules T conv lors de l' infection LCMV CL13, examiner la fréquence de Foxp3 - PD-1 + cellules entre les cellules CD4 + ou T CD8 +.
    NOTE: Sur la base des résultats expérimentaux, le pourcentage de Foxp3 - PD-1 + est supérieure à 50% dans les populations de cellules CD4 + et CD8 + T à 16 d pi avec LCMV CL13.
    1. Pour analyser la fréquence et phénotypes des cellules T reg, examiner les fréquences de Foxp3 + ou Foxp3 + PD-1 + cellules entre les cellules T CD4 +.
      NOTE: Sur la base des résultats expérimentaux, le pourcentage de Foxp3 + ou + PD-1 + cellules Foxp3 est plus de 20% de la population de lymphocytes T CD4 +, respectivement.

4. Isolement de CD4 + CD25 + cellules T reg

NOTE: Les volumes de tous les réactifs indiqués ci-dessous sont pour uneà partir du nombre de cellules de 1 x 10 7 splénocytes totaux.

  1. Préparer les cellules telles que décrites dans la section 2 en utilisant des souris infectées de façon chronique naïfs et LCMV. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon T d'isolement des cellules. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension complètement le culot cellulaire dans 40 ul de tampon.
  2. Pour l' enrichissement de cellules CD4 + T en utilisant le système de séparation magnétique de cellules, ajouter 10 ul de biotine-anticorps cocktail et mélangez bien. Incuber pendant 10 min à 4 ° C.
  3. Ajouter 30 pl de tampon, 20 ul de microbilles anti-biotine pour le marquage de cellules non T CD4 + et 10 pi d'anticorps CD25-PE pour le marquage fluorescent des cellules CD25 +. Bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l'obscurité.
  4. Ajouter 2 ml de tampon et passer les cellules à travers un tamis de 40 um de la cellule dans un nouveau tube de 50 ml pour éliminer les débris cellulaires. Laver les cellules par centrifugation à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.Jeter le surnageant et remettre en suspension complètement le culot cellulaire dans 500 pi de tampon à une densité allant jusqu'à 1,25 x 10 8 cellules.
  5. Appliquer les cellules sur la colonne et recueillir les cellules non marquées qui passent à travers la colonne. Laver la colonne en ajoutant 2 ml de tampon et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension complètement les cellules T CD4 + isolées dans 90 ul de tampon.
  6. Pour le marquage magnétique des cellules CD25 +, ajouter 10 ul d'anti-PE microbilles, bien mélanger et laisser incuber pendant 15 minutes dans l'obscurité à 4 ° C.
  7. Ajouter 2 ml de tampon et laver les cellules par centrifugation à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension complètement le culot cellulaire dans 500 pi de tampon à une densité allant jusqu'à 1 x 10 8 cellules.
  8. Pour enrichir les cellules reg CD4 + CD25 + T, appliquer les cellules sur la colonne pour la sélection positive, et laver le column en ajoutant 2 ml de tampon. Répétez le lavage trois fois.
  9. Lorsque la colonne est vide après l'étape de lavage final, ajouter 1 ml de tampon sur la colonne, et débusquer le magnétiquement marqué CD4 + CD25 + cellules en utilisant le piston.
  10. Répéter les étapes à 4/8 à 4/9 augmenter la pureté des cellules reg CD4 + CD25 + T isolés. Laver les cellules avec un tampon FACS par centrifugation à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules reg CD4 + CD25 + isolées à une concentration de 2 x 10 6 cellules / ml dans un milieu RPMI complet.
  11. Pour vérifier la pureté des cellules reg isolé-CD4 + CD25 + T, utiliser 2 x 10 5 cellules du total des cellules reg isolé-CD4 + CD25 + T. Colorer les cellules avec 50 pi de tampon FACS contenant un anticorps anti-CD4 FITC et la viabilité des cellules réactif de détection infrarouge proche colorant réactif fluorescent.
    REMARQUE: CD25 a déjà été marqué avec PE pendant l'isolement.
  12. Incuber pendant 20 minutes dans l'obscurité à 4 ° C. Laver les cellules avec un tampon FACS par centrifugation à 300 g pendant 2 min à 4 ° C. Après le lavage, resuspendre le culot cellulaire dans 100 pi de tampon FACS et vérifier la pureté par cytométrie en flux.
  13. Porte la population des cellules vivantes. Pour analyser la pureté des cellules T reg, confirmer le pourcentage de cellules CD4 + CD25 +.
    REMARQUE: D' après les résultats expérimentaux, le pourcentage de cellules CD4 + CD25 + parmi les cellules purifiées est supérieure à environ 80%.

5. Isolement des cellules T CD8 + et d' étiquetage des CD8 + cellules T

REMARQUE: Les volumes de tous les réactifs sont indiqués ci - dessous pour un certain nombre de cellules de départ de 1 x 10 7 splénocytes totaux.

  1. Préparer les cellules comme décrit dans la section 2 en utilisant des souris naïves. Laver les cellules en ajoutant 10 ml d'isolement des cellules T chamoiser. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant complètement, et remettre en suspension le culot cellulaire dans 40 ul de tampon.
  2. Pour l' isolement des lymphocytes T CD8 + en utilisant le système de séparation magnétique de cellules, ajouter 10 ul de biotine-cocktail d' anticorps pour la non-T CD8 + marquage des cellules et bien mélanger. Incuber pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Ajouter 30 pi de tampon et 20 ul de microbilles anti-biotine. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à 4 ° C.
  4. Appliquer les cellules sur la colonne et recueillir les cellules non marquées qui passent à travers la colonne. Laver la colonne par addition de 2 ml de tampon à trois reprises.
  5. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension complètement les cellules T CD8 + isolées dans 2 ml de tampon.
  6. Pour vérifier la pureté des cellules isolées, préparer 50 pi de solution d'anticorps dans un tampon FACS. Resuspendre les 2 x 10 5 cellules parmi isolé CD8 + T cells dans 50 pl de solution d'anticorps.
    NOTE: Pour préparer une solution d'anticorps, ajouter anti-CD8 FITC, et le réactif de détection de la viabilité cellulaire (fluorescent proche infrarouge colorant réactif) dans un tampon FACS.
  7. Incuber pendant 20 minutes dans l'obscurité à 4 ° C. Laver les cellules avec un tampon FACS par centrifugation à 300 g pendant 2 min à 4 ° C. Après le lavage, resuspendre le culot cellulaire dans 100 pi de tampon FACS, et vérifier la pureté des cellules par cytométrie en flux.
  8. Porte la population des cellules vivantes. Pour vérifier la pureté des cellules T CD8 +, confirmer le pourcentage de cellules T CD8 +.
    REMARQUE: D' après les résultats expérimentaux, le pourcentage de cellules CD8 + parmi les cellules purifiées est supérieure à environ 90%.
  9. Ajouter du PBS aux cellules T CD8 + isolées. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules T CD8 + isolées à une concentration de 1 x 10 7 cellules / ml dans du PBS.
  10. Pour marquer la CE CD8 + TIIs pour le dosage in vitro de suppression, diluer la prolifération cellulaire suivi colorant violet dans du PBS pour obtenir une concentration de 5 uM à température ambiante.
    NOTE: Les excitation et d'émission des pics approximatives de la prolifération des cellules de suivi colorant violet utilisé dans l'étude sont 405 et 450 nm, respectivement.
  11. Mélanger des volumes bien égaux de la prolifération cellulaire suivi colorant violet (5 uM) et de la suspension de cellules (1 x 10 7 cellules / ml de cellules T CD8 +) dans un tube de 15 ml et on incube à 20 min à 37 ° C. Vortex tube toutes les 10 min.
  12. Remplir le tube avec les médias RPMI complet à froid, et de laisser le tube pendant 10 min à température ambiante. Centrifuger à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant complètement, et remettre en suspension les cellules à une concentration de 2 x 10 6 cellules / ml avec un milieu RPMI complet préchauffée. Incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante.

6. Installation de l'In Vitro Suppression Assay utilisant CD4 + CD25 + T <sub> reg et CD8 + T Cells

  1. Pour préparer des anticorps anti-CD3 / CD28 billes revêtues, transférer le volume approprié de billes magnétiques à un tube de 15 ml de (2,5 ul / 1 x 10 5 cellules). Ajouter un volume égal de PBS et mélanger. Laver par centrifugation à 300 g pendant 2 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Diluer les billes magnétiques dans des milieux complets (50 pl / puits).
  2. Aliquoter 50 pi de cellules reg CD4 + CD25 + T par puits de plaque de 96 puits à fond en U (1 x 10 5 cellules / puits). Ajouter 50 ul de cellules T CD8 + comme répondeur T (T resp) de cellules par puits (1 x 10 5 cellules / puits). Ajouter 50 ul d'anti-CD3 / perles dilué CD28-enduit dans chaque puits.
    NOTE: Dans cette étape, l' étiquette et mettre en place des puits de contrôle comme suit: "cellule non stimulée T CD8 + que" sans anti-CD3 / CD28 perles revêtues; "Cellules T CD8 + uniquement» avec des anti-CD3 / CD28 billes revêtues; «Lymphocytes T CD8 + uniquement«Anti-CD3 / perles CD28 enrobées;". Cellulaire reg T uniquement "avec des anti-CD3 / perles de CD28 revêtues de cellules reg T peuvent être diluées par du milieu complet et co-cultivées avec des cellules T resp dans un rapport différent de T cellules resp: cellules T reg (1: 0,25-1: 1).
  3. Ajouter 50 pi ou le volume approprié des médias dans tous les puits à volume total de 200 pi. Couvrir la plaque avec une feuille et incuber dans un incubateur CO 2 à 37 ° C pendant 72 heures.

7. Analyse des CD8 + T prolifération cellulaire et la production de cytokines de cellules T CD8 +

  1. Pour l'analyse de la production de cytokines, après 3 jours de culture, séparer le surnageant de chaque puits dans une autre plaque et effectuer dosage immuno-enzymatique (ELISA).
    NOTE: Le surnageant peut être aliquote et stocké à -70 ° C. Dans cette expérience, la plaque revêtue d'anticorps anti-souris d'IFN-γ a été utilisé pour détecter la production d'IFN-γ accordment au protocole du fabricant. Pour déterminer la production d' IFN-γ de la prolifération des cellules T CD8 + au niveau de la cellule unique, coloration des cytokines intracellulaires peut être effectuée.
  2. Après avoir séparé le surnageant de chaque puits, laver la plaque contenant les cellules avec un tampon FACS et centrifuger à 300 g pendant 2 min à 4 ° C (3 fois).
  3. Après le lavage, jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire avec 50 ul de cocktail d' anticorps pour la coloration des lymphocytes T CD8 + ont proliféré. Incuber pendant 20 minutes dans l'obscurité à 4 ° C.
    NOTE: Pour préparer un cocktail d'anticorps, anti-CD4 ajouter au FITC, anti-CD8 PerCP-Cy5.5 et le réactif de détection de la viabilité cellulaire (fluorescent proche infrarouge colorant réactif) dans un tampon FACS.
    REMARQUE: Les anticorps dirigés contre différents marqueurs tels que CD44 ou CD69 peuvent être combinés avec d' autres anticorps pour confirmer l' activation des cellules T CD8 +. Rappelez - vous que les cellules T CD8 + ont déjà été marqué par la prolifération des cellules de suivi vcolorant iolet à l'étape 5.10.
  4. Laver deux fois par centrifugation à 300 g pendant 2 min à 4 ° C. Après l'étape finale de lavage, éliminer le surnageant, et fixer les cellules pendant 20 min dans l'obscurité à 4 ° C avec 100 ul de tampon de fixation.
  5. Laver deux fois par centrifugation à 300 g pendant 2 min à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules avec 200 pi de tampon pour FACS et la mesure de la prolifération des cellules T CD8 + suivi violets marqués par un colorant prolifération cellulaire par cytométrie de flux.
    1. Porte de la population de cellules T CD8 + parmi les cellules vivantes. Mesurer les pourcentages de cellules non divisées et réparties en fonction de la dilution de la prolifération cellulaire suivi colorant violet et la dilution des cellules T CD8 + , selon l'équation suivante. % D' inhibition = [(% de cellules T CD8 + ont proliféré en l'absence de cellules T reg -% de cellules T CD8 + ont proliféré en présence de cellules T reg) / (% de cellules T CD8 + ont proliféré enl'absence de cellules T reg)] x 100. En outre , les analyser des données en utilisant le logiciel de cytométrie de flux 25.

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Representative Results

Nous avons généré des souris avec une infection virale persistante en leur injectant 2 x 10 6 pfu de LCMV CL13 par voie intraveineuse. Pour étudier les changements phénotypiques dans les cellules reg T et les cellules T du cours de l' infection par le virus chronique, des lymphocytes spléniques provenant de souris naïves et infectées ont été colorés avec divers anticorps et analysées par cytométrie en flux. A 16 ans d pi, PD-1 a été régulée à la hausse dans les deux Foxp3 - CD4 + T conv (Figure 1A, panneau supérieur) et Foxp3 - cellules CD8 + T conv (Figure 1B, panneau supérieur). La fréquence des cellules reg Foxp3 + T CD4 + était deux fois plus élevé chez les souris LCMV CL13 infectées que chez les souris naïves (figure 1A). En particulier, la plupart des cellules Foxp3 + reg CD4 + T affiche le phénotype activé, exprimant des niveaux élevés dePD-1 à ce point de temps (figure 1A).

Pour le dosage in vitro de suppression, un nombre considérable de cellules conv T CD8 + et les cellules reg CD4 + CD25 + étaient nécessaires. Pour obtenir des cellules T CD8 + suivi de la prolifération violets marqués par un colorant 1 x 10 7 cellules, les splénocytes à partir de deux rates de souris naïves ont été regroupées. Pour obtenir 2 x 10 6 à 3 x 10 6 cellules reg CD4 + CD25 + T, au moins trois rates de souris naïves et infectées par LCMV CL13 respectivement, ont été regroupées. Lymphocytes T CD8 + en tant que cellules T resp ont été séparés avec succès sans contamination significative avec d' autres cellules immunitaires (figure 2A). Cellules T reg pourraient également être isolés, avec une population dominante de cellules CD25 + CD4 + T avec plus de 80% de pureté (figure 2B).

Pour comparer la fonction suppressive des cellules T naïves reg et chroniques, le T reg isolées et les cellules T ont été incubées resp ensemble sous une stimulation par des billes anti-CD3 / CD28 revêtu à 37 ° C pendant 3 jours. % D' inhibition de lymphocytes T CD8 + prolifération des cellules a été augmentée respectivement dans une cellule T reg dese manière dépendante (figure 3A). Lorsque des cellules T CD8 + resp ont été co-cultivées avec des cellules T reg chroniques dans un rapport de 1: 1, la prolifération de cellules T CD8 + resp ont été significativement inhibée (figure 3B). La production d' IFN-γ par les cellules resp T CD8 + ont également inhibé de manière significative lorsque les cellules CD8 + resp T ont été co-cultivées avec des cellules T activées reg de souris infectées de manière chronique plutôt que des cellules au repos reg T de souris naïves dans un T reg (figure 3C).

Figure 1
Figure 1: phénotypes de cellules CD4 + et CD8 + T dans la rate des souris naïves ou des souris LCMV CL13 infectées à 16 d pi (A) Expression de PD-1 ou CD25 sur Foxp3 - CD4 + T conv et Foxp3 + CD4 + cellules T reg. (B) L' expression de PD-1 ou CD25 sur Foxp3 - cellules conv T CD8 +. Les lymphocytes spléniques ont été colorées avec des anticorps dirigés contre CD4, CD8, CD25, PD-1 et Foxp3. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. Panel A a été modifié depuis 25 comme référence. S'il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Les puretés des cellules T resp isolées de souris naïves et des cellules T reg isolées à partir de souris naïves ou infectées par LCMV CL13 (A) Pourcentage de cellules T CD8 + après l' isolement.. (B) Pourcentage de cellules reg T CD4 + CD25 exprimant après isolement. Chaque quadrant (B) est déterminée par les niveaux de CD4 et CD25 expression. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3: Effet de lymphocytes T activés reg sur la réponse des lymphocytes T CD8 + (A)% d' inhibition de lymphocytes T CD8 + en co-culture avec des cellules T reg d'une manière dose-dépendante des cellules T reg.. (B) La prolifération des lymphocytes T CD8 + en co-culture avec des cellules T reg en rapport 1: 1. (C) la production d' IFN-γ des lymphocytes T CD8 + en co-culture avec des cellules T reg d'une manière dose-dépendante des cellules T reg. La prolifération des lymphocytes T CD8 + a été mesurée par dilution de la prolifération cellulaire suivi colorant violet dans les cellules T CD8 + ont proliféré et l' IFN-γ sécrétion a été évaluée par ELISA. Lymphocytes T CD8 + suivi violets marqués par un colorant prolifération cellulaire ont été stimulées avec anti-CD3 / CD28 billes revêtues pendant 3 jours en l'absence ou en présence de T + en co-culture avec et sans cellules T reg, respectivement. Pics gris remplis dans l'histogramme indiquent la prolifération des cellules T CD8 + co-cultivées sans cellules T reg. Chaque groupe a été conçu en triple. Les barres représentent la moyenne + SEM. Ce chiffre a été modifié à partir de 25 comme référence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Bien que seulement un petit nombre de cellules T reg existe chez les souris et les humains, il est important de comprendre leur fonction , car ils jouent un rôle crucial dans la régulation de la réponse immunitaire et le maintien de la tolérance immunitaire. Le nombre et les suppresseurs fonctions de T reg cellules augmente au cours d' une infection chronique par le virus 15-20 ainsi que la progression du cancer 13,14. Ceci est probablement dû à la stimulation antigénique continue. Pour évaluer les cellules T reg fonctionnent sous l' antigène persistance et le développement de la maladie, leur activité suppressive doit être mesurée.

Ici, nous décrivons un protocole pour analyser l'ex vivo phénotype des cellules T reg et de mesurer leur activité suppressive à l' aide d' un système de co-culture in vitro de cellules CD8 T + et les cellules T reg. Les étapes critiques dans le protocole actuel sont l' analyse et l' isolement des cellules T reg. Vivre et fraîchement isolés T in vitro. Nous avons également examiné les phénotypes de T conv et des cellules T reg au cours d' une infection chronique par le virus. Conv cellules T, à savoir Foxp3 - Cellules T CD4 + et CD8 + ont présenté une diminution de l'activité cellulaire après l'infection virale chronique (figure 1). L'expression PD-1 a été régulée à la hausse dans les deux populations cellulaires les T conv. Augmentation des T reg nombre de cellules et la régulation du PD-1 expression sont les caractéristiques de la réponse immunitaire lors d' une infection par le virus chronique. En outre, des anticorps pour d'autres récepteurs tels que les inhibiteurs de TIM-3 et CTLA-4 peuvent être utilisés en combinaison avec PD-1 pour étudier le phénotype des lymphocytes T par FACS après infection par le virus chorique.

Afin d'étudier l'activité suppressive des cellules T et des cellules resp reg T ont été co-cultivées selon un rapport de 1 à 1. Co-culture avec T régles cellules de souris infectées de manière chronique réduit significativement CD8 + prolifération des lymphocytes T et la sécrétion d' IFN-γ par rapport à des cellules T reg provenant de souris naïves. Ceci implique que la production de cytokines et la prolifération des lymphocytes T CD8 + en co-culture avec des cellules T reg sont inversement proportionnels à la fonction de suppression des cellules T reg. Bien que ce protocole recommande l'utilisation d'un système de séparation magnétique des cellules pour l' isolement des cellules T reg, la contamination par des cellules reg non-T ne peut pas être exclue. Les cellules T reg obtenues à partir de Foxp3-GFP journaliste souris 28-30 sont de meilleurs candidats pour étudier avec précision la fonction des cellules T reg que magnétique système de séparation cellulaire, comme CD25 est souvent surexprimé sur les cellules T reg CD4 + T conv ainsi que activés.

La fonction de suppression des cellules T reg a été évaluée par divers in vitrodes essais de suppression 16,28,31-34. L'avantage de l'essai de suppression in vitro est qu'elle évalue l'effet direct des cellules T reg sur l'inhibition de la réponse des lymphocytes T CD8 +, puisque seules les cellules resp T sont co-cultivées avec des cellules T reg. En plus des cellules T CD8 +, CD25 - lymphocytes T CD4 + peut être utilisé à la place des cellules T 25 resp. Les effets de T reg ou des cellules T conv sur les cellules immunitaires telles que des cellules dendritiques ou des cellules tueuses naturelles peuvent être évaluées en faisant varier les conditions expérimentales.

Molécules comme le CD103 35, LAG-3 36, la glycoprotéine A répétitions prédominantes 37, CD43 38, CD11a 38, ou cellules tueuses récepteur sous - famille lectine G 1 membre 38 ont été utilisés comme marqueurs de cellules reg T activées dans des maladies spécifiques. Dans ce protocole, on a utilisé PD-1 en tant queindicateur pour identifier activé les cellules T reg lors de l' infection par le virus chronique. Ce protocole peut être utilisé pour des analyses multidimensionnelles (phénotypiques et fonctionnels) de cellules T reg dans des conditions spécifiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072
Cell strainer, 70 mm BD Biosciences 352350
Cell strainer, 40 mm BD Biosciences 352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1x) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences
Flowjo TreeStar
Hematocytomer Marienfeld superior

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References

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