एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन डीएनए पेप्टाइड बंधन के साथ भूतल सीमित बड़े डीएनए अणु के दृश्य

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
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Biology

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Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

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Abstract

Introduction

पर कांच या मनका सतहों सीमित बड़े डीएनए अणु के दृश्य डीएनए सब्सट्रेट, 1,2 और बहुलक भौतिकी पर डीएनए, प्रोटीन बातचीत, प्रोटीन गतिशीलता की जांच के लिए उपयोग किया गया है। 3,4 एकल सीमित बड़े डीएनए अणु के लिए एक मंच में कुछ अलग है फायदे के अन्य डीएनए स्थिरीकरण तरीकों की तुलना में। 5 सबसे पहले, एक बड़े डीएनए सतह पर सीमित अणु एक कतरनी प्रवाह है, जो एक डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन अपने बंधन साइट को पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है बिना एक प्राकृतिक यादृच्छिक-तार रचना है। दूसरा, यह एक प्रवाह कक्ष में एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के लिए डीएनए अणु के आसपास रासायनिक वातावरण को बदलने के लिए बहुत आसान है। तीसरा, एक microfluidic कतरनी प्रवाह डीएनए आणविक पूर्ण समोच्च लंबाई, जो वैकल्पिक डीएनए बढ़ाव का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए बहुत मुश्किल है की 100% तक खींच ऐसी सतह स्थिरीकरण 6 और nanochannel कारावास के रूप में दृष्टिकोण लाती है। 7 एक पूरी तरह से stretcheडी डीएनए अणु भी स्थितीय जानकारी है कि जीनोमिक मानचित्र पर एंजाइमी आंदोलनों की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकता है।

फिर भी, डीएनए टेदरिंग दृष्टिकोण इस तरह yoyo-1 आम तौर पर सीमित डीएनए अणु आसानी से प्रतिदीप्ति उत्तेजना प्रकाश ने तोड़ा होने का कारण बनता रूप में है कि intercalating डाई में एक महत्वपूर्ण कमी है। आम तौर पर, बड़े डीएनए अणु एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे दृश्य के लिए एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग किया जाना है। इस प्रयोजन के लिए, yoyo-1 या अन्य पूर्ण श्रृंखला रंगों मुख्य रूप से इस्तेमाल किया क्योंकि इन रंगों केवल प्रतिदीप्ति जब वे intercalate डबल असहाय डीएनए कर रहे हैं। 8 हालांकि, यह अच्छी तरह से मालूम है कि बीआईएस intercalating डाई प्रकाश प्रेरित डीएनए फोटो दरार क्योंकि कारण बनता है । fluorophores के मध्यनिवेश 9 आगे की, fluorescently दाग डीएनए सतह पर सीमित अणुओं अधिक नाजुक बाद कतरनी प्रवाह स्वतंत्र रूप से डीएनए अणु जाने पर बलों को तोड़ने लागू कर सकते हैं। इसलिए, हम एक उपन्यास के रूप में डी एफ पी DBP विकसितNA-धुंधला इमेजिंग सतह पर सीमित बड़े डीएनए अणु के लिए प्रोटीन डाई। एफपी-DBP उपयोग करने का लाभ यह है कि यह डीएनए अणु यह बांधता है जो करने के लिए फोटो-दरार पैदा नहीं करता है। 10 इसके अलावा, एफपी-DBP, डीएनए की समोच्च लंबाई में वृद्धि नहीं करता है, जबकि बीआईएस intercalating रंगों समोच्च लंबाई बढ़ाने के बारे में 33% से।

इस वीडियो विधि एक खूंटी बायोटिन की सतह के लिए बड़े डीएनए अणु tethering के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का परिचय। चित्रा 1 कुंद समाप्त होता है और चिपचिपा समाप्त होता है के साथ डीएनए tethering के लिए अलग अलग दृष्टिकोण को दिखाता है। इस प्रकार, इस धुंधला विधि डीएनए अणु के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है। चित्रा 2 प्रवाह कक्ष विधानसभा कि एक सिरिंज पंप द्वारा नियंत्रित किया जा सकता डीएनए अणु में खिंचाव के साथ ही रासायनिक और एंजाइम को लोड करने के लिए कतरनी प्रवाह उत्पन्न करने के लिए एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दर्शाया गया है समाधान। चित्रा 3 PEGylat पर सीमित पूरी तरह से बढ़ाकर डीएनए अणु की micrographs दर्शाता हैएड सतह 11 और एफ पी DBP के साथ दाग।

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Protocol

1. डीएनए Biotinylation

  1. कुंद एंडेड डीएनए टर्मिनल ट्रांसफेरेज़ का उपयोग करने का Biotinylation (TdT)
    नोट: उपयोग टी -4 डीएनए (166 KBP) है, जो एक कुंद एंडेड डीएनए है।
    1. 2.5 मिमी की 5 μl जोड़े CoCl 2, 10 × प्रतिक्रिया बफर के 5 μl, 10 मिमी बायोटिन-11-dUTP के 0.5 μl, टर्मिनल ट्रांसफेरेज़ के 0.5 μl (10 इकाइयों), और टी -4 डीएनए के 0.5 μl (0.5 माइक्रोग्राम / μl) प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए। पानी की 38.5 μl जोड़कर 50 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
      नोट: विस्तारित प्रतिक्रिया समय, डबल सीमित डीएनए उपज हो सकती है यानी, यह संभव है कि biotins दोनों सिरों पर टैग कर रहे हैं।
    3. 0.5 एम EDTA, पीएच 8 के 5 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब रखें।
  2. चिपचिपा समाप्त डीएनए के Biotinylation डीएनए Ligase का प्रयोग
    नोट: उपयोग λ डीएनए (48.5 KBP) है, जो एक चिपचिपा अंत डीएनए है। <राजभाषा>
  3. टी -4 डीएनए ligase के 1 μl, 10 × बंधाव बफर के 5 μl, 25 एनजी के 1 μl जोड़ें / μl λ फेज डीएनए, और 50 μl के अंतिम मात्रा बनाने के लिए पानी के 43 μl जोड़ें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब रखें।

2. Functionalized भूतल derivatization

नोट:। क्रम में कांच की सतह पर एक डीएनए अणु का एक अंत तार करने के लिए, एक प्राथमिक एमाइन समूह एक coverslip बायोटिन खूंटी कोटिंग के द्वारा पीछा किया पर के रूप में चित्र 1 में दिखाया silanized है यह PEGylation प्रक्रिया एकल अणु डीएनए इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह काफी सतह पर अवांछित अणुओं की कुर्की के द्वारा बनाई गई यादृच्छिक शोर को कम कर सकते हैं।

  1. पिरान्हा सफाई
    नोट: पिरान्हा समाधान कार्बनिक सामग्री के साथ सख्ती से प्रतिक्रिया है, इसलिए यह उचित सुरक्षा दिशा निर्देशों का पालन, देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
    1. जगह एक polytetrafluoroethylene (PTFE) रैक पर coverslips, और उन्हें पकड़ खY PTFE धागा सील टेप लंबाई, सतहों के किनारे और रैक पर आधे पर आधा। रैपिंग के बाद, सफाई की प्रक्रिया के दौरान रैक से निपटने के लिए टेप का एक लंबा टुकड़ा (~ 5 सेमी) छोड़ दें।
    2. एच 2 के 350 मिलीलीटर के साथ एक 1 एल कांच बीकर भरें ताकि एच 22 के 4 और 150 मिलीलीटर एक धूआं हुड में पिरान्हा समाधान बनाने के लिए। पिरान्हा समाधान में रैक 2 घंटे के लिए रखें।
    3. खाली पिरान्हा बीकर में पानी का पीएच तक विआयनीकृत पानी के साथ बीकर से समाधान है, और कुल्ला coverslips अच्छी तरह से तटस्थ तक पहुँचता है। पीएच पेपर स्ट्रिप्स का प्रयोग करें।
    4. बीकर युक्त पानी में कवर फिसल जाता है की रैक Sonicate, 30 मिनट के लिए। खाली पानी बीकर से सिर्फ अमीनो silanization से पहले। साफ है और ग्लास substrates derivatize को sonication शक्ति के 75 डब्ल्यू का प्रयोग करें।
  2. कांच की सतह पर Aminosilanization
    1. एन के 2 मिलीलीटर जोड़ें - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine और 200 मिलीलीटर के लिए हिमनदों एसिटिक एसिड के 10 मिलीलीटरaminosilanization समाधान तैयार करने के लिए एक साफ polypropylene कंटेनर में मिथाइल अल्कोहल की।
    2. polypropylene कंटेनर में साफ coverslips रखें। उन्हें 30 मिनट के लिए 100 आरपीएम और कमरे के तापमान पर हिला।
    3. 75 पर 15 मिनट के लिए derivatized कवर फिसल जाता है के साथ बीकर Sonicate डब्ल्यू कम से कम 30 मिनट के लिए 100 rpm और कमरे के तापमान पर उन्हें हिला।
    4. एथिल शराब के साथ बीकर से समाधान खाली है, और मिथाइल अल्कोहल के साथ सावधानी से coverslips कुल्ला, एक बार, दो बार और। एथिल अल्कोहल में स्टोर coverslips और उन्हें दो सप्ताह के भीतर का उपयोग करें।
  3. Coverslip के PEGylation
    1. (3 NaHCO) 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट के 10 मिलीलीटर बनाओ। एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ समाधान फ़िल्टर।
    2. बायोटिन खूंटी succinimidyl कार्बोनेट (बायोटिन खूंटी एससी) और 3 NaHCO के 350 μl में (एमपीईजी एसवीजी) खूंटी succinimidyl valerate के 80 मिलीग्राम की 2 मिलीग्राम भंग। एक प्रकाश संरक्षण ट्यूब का प्रयोग करें।
    3. 1 के लिए सख्ती ट्यूब भंवर0 सेकंड, और सेंट्रीफ्यूज यह 10,000 × छ 1 मिनट बुलबुले को दूर करने के लिए पर।
    4. एसीटोन के साथ एक गिलास स्लाइड, एथिल शराब के साथ rinsing द्वारा पीछा कुल्ला। हवा के लिए स्लाइड पूरी तरह से सूखे की अनुमति दें।
    5. साफ कांच की स्लाइड पर खूंटी समाधान की एक बूंद (50 μl) रखें। एक एमिनो silanized कवर पर्ची के साथ धीरे छोटी बूंद कवर, किसी भी बुलबुले पैदा करने के बिना।
    6. 3 घंटे के लिए जगह स्लाइड रात भर अंधेरे में एक कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से समतल करने के लिए नम कक्ष। तल पर पानी के साथ चैम्बर के रूप में एक खाली विंदुक टिप धारक का उपयोग करें। ट्यूब में अवशिष्ट खूंटी समाधान को सील करने और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
    7. विआयनीकृत पानी से अच्छी तरह PEGylated coverslip कुल्ला। उपयोग करें जब तक एक अंधेरे और सूखी जगह में संग्रहीत।

3. एक फ्लो चैंबर कोडांतरण

  1. एक मुक्का मारा एक्रिलिक धारक निर्माण, चित्रा 2 के रूप में। सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग डालने का व्यास 0.762 मिमी, और नामित एक छेद एक इनलेट है और अन्य हैएक दुकान (चित्रा 2)।
  2. दो तरफा चिपचिपा टेप स्ट्रिप्स (चौड़ाई 5-6 मिमी) एक एक्रिलिक धारक पर (चित्रा 2), एक इनलेट और आउटलेट छेद के लंबवत संरेखित, किसी भी चैनल छेद perturbing नहीं रखें। इन टेप स्ट्रिप्स का उपयोग के रूप में मल्टी चैनल दीवारों कक्षों बनाने के लिए। एक pipet टिप का उपयोग कर टेप रगडें।
  3. शीर्ष पर एक PEGylated coverslip रखें PEGylated ओर मुंह के बल के साथ प्रवाह कक्षों बनाने के लिए।
  4. लीक से किसी भी समाधान को रोकने के लिए ऐसा क्षेत्र है जहां दो तरफा टेप रखा जाता है पर एक coverslip के शीर्ष दबाएँ। त्वरित सूखी epoxy गोंद शीर्ष पर और नीचे (चित्रा 2 में पीले रंग) पर चैम्बर के किनारों को बंद करने के लिए जोड़ें।
  5. एक गैस तंग सिरिंज के लिए ट्यूबिंग (बाहरी व्यास, आयुध डिपो, 0.042 ") का एक छोटा टुकड़ा (2.5 सेमी) कनेक्ट और epoxy गोंद के साथ संयुक्त सील।
  6. ट्यूबिंग सिरिंज से जुड़े करने के लिए और epoxy गोंद के साथ संयुक्त सील: एक लंबे लचीला ट्यूबिंग (0.03 "ओवर ड्राफ्ट) कनेक्ट करें।
  7. tubi भरेंएनजी डि पानी के साथ सिरिंज से जुड़े। सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुला नहीं है सुनिश्चित करें।
  8. प्रवाह कक्ष epoxy गोंद के साथ बंद के छेद में ट्यूबिंग डालें।
  9. एक जलाशय के रूप में अन्य छेद पर एक पीले रंग की टिप (200 μl टिप) रखें।

4. फ्लो चैंबर में नमूना लोड हो रहा है

नोट: इस तरह के Neutravidin streptavidin के रूप में अन्य avidin प्रोटीन के साथ बदला जा सकता है। प्रतिक्रियाओं के सभी कमरे के तापमान पर किया जा सकता है जब तक कि यह उल्लेख किया है। एक पीले रंग की टिप में नमूना समाधान ले लो, और एक्रिलिक धारक (चित्रा 2 बी) के छेद पर समाधान के साथ टिप स्थापित करें।

  1. 50 μl / मिनट में सिरिंज पंप के प्रवाह की दर निर्धारित करें। लोड avidin प्रोटीन के 20 μl (T50 समाधान में 25 माइक्रोग्राम / एमएल, Tris 10 मिमी, 50 मिमी NaCl, पीएच 8), और यह 10 मिनट के लिए रख सकते हैं।
  2. लोड biotinylated oligodeoxynucleotides के 20 μl (1 × ते में 100 सुक्ष्ममापी), और यह 10 मिनट के लिए रख सकते हैं। टर्मिनल ट्रांसफेरेज़ प्रयोग किया जाता है, लोडिंग को छोड़oligodeoxynucleotides की।
  3. लोड 10 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर प्रवाह कक्ष में चरण 1 से डीएनए समाधान के 20 μl, और यह 30 मिनट के लिए रख सकते हैं।
  4. 1 × ते के साथ प्रवाह कक्ष धो लें, और एफपी-DBP 10 (~ 80 एनएम) के 40 μl लोड।
  5. एक 60x उद्देश्य लेंस पर 1 * ते में अणुओं धुंधला करने के निरंतर प्रवाह के साथ एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे डीएनए का निरीक्षण करें। एफपी (EGFP) -DBP की उत्तेजना के लिए 488 एनएम ठोस राज्य लेजर का प्रयोग करें। डीएनए अणु से भरा खिंचाव के लिए, डीएनए इस्तेमाल किया लंबाई के हिसाब से अलग प्रवाह की दर लागू होते हैं। उदाहरण के लिए, टी -4 डीएनए के 166 KBP के लिए λ डीएनए के 48.5 KBP, और 100 μl / मिनट के लिए 50 μl / मिनट लागू होते हैं।
    1. एक्रिलिक धारक की रीसाइक्लिंग के लिए, एक घर डिटर्जेंट समाधान 12 में इकट्ठे प्रवाह कक्षों लेना। एक रेजर ब्लेड और हाथों से रगड़ के साथ टेप और epoxy हटाये उन्हें पूरी तरह से दूर ले जाना। सिरिंज सुई के साथ छेद Unclog। आगे उपयोग करें जब तक विआयनीकृत पानी में धारकों रखें।

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Representative Results

चित्रा 1 डीएनए अणु के टर्मिनल संरचनाओं के आधार पर दो अलग डीएनए टेदरिंग तरीकों से पता चलता है। चित्रा 1 ए दिखाता है कि कैसे चिपचिपा समाप्त डीएनए अणु पूरक biotinylated ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स, जो avidin लेपित खूंटी सतह पर स्थिर रहे हैं के साथ संकरित हैं। 1B आंकड़ा के अलावा चलता biotinylated ddNTP या टर्मिनल ट्रांसफेरेज़ द्वारा एक कुंद एंडेड डीएनए के 3 'हाइड्रॉक्सिल समूह के लिए dNTP। हम डीएनए अणु और बायोटिन के बीच लचीला linkers जोड़ा। इस बंधाव और avidin बायोटिन बाध्यकारी दक्षता प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त स्थान उपलब्ध कराने के लिए वृद्धि हुई है। -1 सी चित्रा avidin लेपित खूंटी सतह पर डीएनए टेदरिंग के लिए समग्र योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दर्शाता है।

चित्रा 2 एक एक्रिलिक धारक के साथ प्रवाह चैम्बर के विधानसभा दर्शाया गया है। glas की तुलनाएस / क्वार्ट्ज स्लाइड चश्मा, एक कस्टम बनाया एक्रिलिक धारक महामारी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए प्रवाह कक्ष की तैयारी सरल करता है। 12 प्रवाह कक्ष एंजाइम प्रतिक्रियाओं, 6 और खींच डीएनए अणु के लिए बफर की स्थिति की तत्काल बदलने के लिए सक्षम बनाता है।

चित्रा 3 एकल सीमित डीएनए और टी -4 λDNA एफपी-DBP के साथ दाग को दर्शाता है। Microfluidic कतरनी पूर्ण समोच्च लंबाई करने के लिए ऊपर लम्बी एकल डीएनए अणु बहती है जैसे 16.5 माइक्रोन (48.5 केबी λ डीएनए x 0.34 एनएम) और 56.4 माइक्रोन (166 केबी टी -4 डीएनए x 0.34 एनएम)। हम, एक विस्तारित अवधि (जैसे, आधे घंटे) के दौरान डीएनए खींच और आराम के लिए कई बार दोहराने में सक्षम थे, क्योंकि हम एफ पी DBP कि फोटो दरार का कारण नहीं है का उपयोग किया।

आकृति 1
चित्रा 1. डीएनए टेदरिंग के योजनाबद्ध चित्रण। क) एक रोंticky एंडेड डीएनए एक biotinylated पूरक oligonucleotide के साथ संकरित है। Triethylene ग्लाइकोल oligonucleotide और बायोटिन। ख) Biotinylated dNTP डबल असहाय डीएनए के एक कुंद अंत में जोड़ा जाता है, टर्मिनल ट्रांसफेरेज़ द्वारा बीच एक लचीला लिंकर है। Polycarbon स्पेसर (11-परमाणुओं) dNTP और बायोटिन। ग) Biotinylated डीएनए के बीच एक लचीला लिंकर एक avidin प्रोटीन है, जो एक biotinylated खूंटी covalently कांच की सतह को बंधुआ से जुड़ा हुआ है के लिए लंगर जाता है। सामान्य खूंटी के लिए biotinylated खूंटी के अनुपात 0.025 था (1:40)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 प्रवाह कक्ष। क) एक एक्रिलिक एसिड राल धारक से मिलकर प्रवाह कक्ष, दो तरफा टेप और एक PEGylated के स्ट्रिप्स पर्ची कवर। आयाम 76 मिमी x 26 मिमी एक्स 5 मिमी (एल एक्स डब्ल्यू एक्स एच) के एक्रिलिक धारक, लेजर काटने के साथ निर्मित किया गया था ख) प्रवाह कक्ष के साइड देखें:। छिद्रित छेद है, जिस पर एक पीले रंग की टिप के लिए स्थापित किया गया है एक इनलेट बंदरगाह हैं एक बफर जलाशय, और कहा कि एक ट्यूबिंग एक सिरिंज पंप द्वारा नियंत्रित से जुड़ा है एक दुकान के बंदरगाह। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. एफपी-DBP के साथ दाग बढ़ाकर डीएनए अणु की फ्लोरोसेंट सूक्ष्म छवियों। क) जीवाणुभोजी λ डीएनए (48.5 KBP) biotinylated पूरक ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स साथ बंधाव के बाद सतह पर सीमित। ख) जीवाणुभोजी टी -4 डीएनए (166 KBP) टर्मिनल ट्रांसफेरेज़ साथ बायोटिन जोड़ने के बाद सतह पर सीमित। संकेत तीर डीएनए Molecul दिखानेes अपनी पूरी समोच्च लंबाई λ डीएनए के लिए इस तरह के रूप में 16.5 माइक्रोन और 56.4 माइक्रोन टी -4 डीएनए के लिए अप करने के लिए बढ़ाया। स्केल सलाखों:। 10 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ हम सतहों पर प्रस्तुतीकरण के लिए biotinylated लंबे डीएनए अणु visualizing के लिए एक मंच प्रस्तुत करते हैं। हम biotinylated गोजातीय सीरम albumin के साथ एक avidin प्रोटीन लेपित सतह पर सीमित डीएनए अणु के लिए एक दृष्टिकोण है। 6 पहले दृष्टिकोण में सूचना दी है, हम डीएनए फोटो दरार बीआईएस मध्यनिवेश रंगों कि डीएनए अणु दाग की वजह से एक महत्वपूर्ण मुद्दे पर सीमित पाया सतह। इन लगातार उत्साहित fluorophores एक उच्च संभावना है, एक डीएनए फॉस्फेट रीढ़ की हड्डी पर हमला करने के लिए 9 उत्तेजना प्रकाश शक्ति फोटो दरार से बचने के लिए कम से कम किया जा सकता था किया है।

आदेश में इस असुविधा को दूर करने के लिए, हम आनुवंशिक रूप से फोटो दरार बिना धुंधला डीएनए के लिए डीएनए बाध्यकारी क्षमता (एफपी-DBP) के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन इंजीनियर विकसित की है। हम 10 पर avidin लेपित प्रोटीन सतहों विश्वसनीय डीएनए धुंधला मनाया। बहरहाल, इस मंच पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अवांछनीय एकत्रीकरण का एक और मुद्दा थाप्रोटीन की सतह, वृद्धि की पृष्ठभूमि शोर में जिसके परिणामस्वरूप। यह पृष्ठभूमि से डीएनए और प्रोटीन के विपरीत बढ़ाने के लिए एकल अणु डीएनए विश्लेषण के लिए इस यादृच्छिक शोर को कम करने के लिए आवश्यक है। एफपी-DBP का उपयोग इसलिए सतह पर adsorbed किया जा रहा से फ्लोरोसेंट प्रोटीन को रोकने के लिए सतह passivation की आवश्यकता है। खूंटी इस उद्देश्य के लिए एक शक्तिशाली उम्मीदवार हो सकता है। 12 इसलिए, हम biotinylated खूंटी, जो नाटकीय रूप से बढ़ाया सतह पर सीमित इमेजिंग एफपी-DBP दाग डीएनए अणु के लिए संकेत करने वाली शोर अनुपात का इस्तेमाल किया।

वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम और अधिक पैदावार के लिए इस विधि में नोट कर रहे हैं। आदेश में एक कांच की सतह पर एक डीएनए अणु का एक अंत तार करने के लिए, एक प्राथमिक एमाइन समूह के रूप में चित्र 1 में दिखाया एक coverslip बायोटिन खूंटी कोटिंग के द्वारा पीछा किया पर silanized है। यह सतह passivation प्रक्रिया एकल अणु डीएनए इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह काफी सतहों पर शोर पैदा यादृच्छिक सोखना कम कर सकते हैं।इसलिए, रात भर aminosilanization और PEGylation पुरजोर सिफारिश की है। इसके अलावा, गिलास स्लाइड के साथ-साथ पिरान्हा समाधान के साथ कवर कांच की सफाई के लिए आगे पृष्ठभूमि शोर को कम कर सकते हैं।

एक biotinylated oligonucleotide एक बड़े डीएनए अणु के हाइड्रॉक्सिल समूह 'आदेश 3 से लिंक करने के लिए अंत' 5 पर एक फॉस्फेट समूह होना चाहिए। biotinylated oligonucleotide के अनुक्रम λ डीएनए tethering के लिए 5'-P-GGGCGGCGACCT-तेग-बायोटिन 3 'है। λ डीएनए समाधान, λ डीएनए समाधान (1.1 में वर्णित) की तैयारी के बाद शीघ्र ही लोड करने के लिए है क्योंकि λ डीएनए अक्सर लंबे समय तक भंडारण के साथ concatemers रूप हैं। ऐसी टी -4 डीएनए के रूप में कुंद समाप्त डीएनए के लिए, टर्मिनल ट्रांसफेरेज़ किसी भी विशिष्टता के बिना डीएनए के दोनों सिरों पर biotinylated dUTPs जोड़ सकते हैं। इस प्रकार, टर्मिनल ट्रांसफेरेज़ प्रतिक्रिया समय अन्यथा बढ़ाया प्रतिक्रिया उपज हो सकती है डबल लेबल डीएनए (यानी, दोनों सिरों बायोटिन के साथ चिह्नित कर रहे हैं), ध्यान से एक घंटे के आसपास समायोजित किया गया है। में जोड़नाऐसे λ और टी -4 के रूप में वायरल डीएनए के लिए ition, डीएनए के किसी भी प्रकार के इस मंच में उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, यह इस तरह के स्वाई या चना के रूप में दुर्लभ कटर प्रतिबंध एंजाइमों से पाचन के बाद विशाल जीनोमिक डीएनए से टुकड़े का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है।

विभिन्न प्रवाह दरों डीएनए के विभिन्न लंबाई के लिए लागू कर रहे हैं। आमतौर पर, अब डीएनए अणु पूरी तरह से डीएनए अणु फैलाने के लिए, सटीक समोच्च लंबाई मैच के लिए तेजी से प्रवाह की दर की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, λ डीएनए 16.5 माइक्रोन तक खिंचाव कर सकते हैं, जो 0.34 एनएम एक्स 48,502 बीपी के मूल्य की गणना करने के लिए मेल खाती है।

यह हौसले सभी सामग्री, विशेष रूप से प्रोटीन और खूंटे के सभी तैयार करने के लिए काफी महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, Neutravidin आसानी से biotins बाध्यकारी अगर यह एक पतला समाधान के रूप में जमा है अपने कार्य को खो देता है। खूंटी समाधान के लिए, पीएच एक प्राथमिक एमाइन और एन hydroxysuccinimide का कार्य समूहों एकत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, यह हौसले से कम से कम हर सप्ताह सभी सामग्री तैयार करने के लिए सिफारिश की है।

सतह पर सीमित बड़े डीएनए अणु के दृश्य के लिए एक बहुमुखी मंच ऐसे जीनोमिक्स, epigenomics, डीएनए और प्रोटीन बातचीत के लिए जैव रासायनिक अध्ययन, और बहुलक भौतिकी के अध्ययन के रूप में आवेदनों की एक किस्म के लिए लागू किया जा रहा है। हालांकि, इस दृष्टिकोण वर्तमान में इस तरह के वायरल जीनोम के रूप में अपेक्षाकृत सरल और अच्छी तरह से जाना जाता है डीएनए अणु का उपयोग कर सिस्टम मॉडल करने के लिए ही सीमित है। मानव जीनोम और epigenome के लिए बढ़ाया जा करने के लिए है, यह व्यावहारिक प्रयोग के लिए एक मजबूत, विश्वसनीय, और सरल मंच स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रकाश प्रेरित डीएनए फोटो दरार पर काबू पाने और सतह पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के यादृच्छिक सोखना को रोकने के द्वारा, इस मंच इसलिए कतरनी प्रवाह के साथ लम्बी डीएनए के लिए स्पष्ट और उच्च विपरीत चित्र प्रदान करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

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References

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