Визуализация поверхностного привязанным Большой Молекулы ДНК с флуоресцентной ДНК связыванием белков пептид

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Визуализация больших молекул ДНК привязанных на стеклянных или бусинки поверхностей была использована для исследования ДНК-белковых взаимодействий, динамика белка на подложке ДНК, 1,2 и физики полимеров. 3,4 Платформа для одной привязи больших молекул ДНК имеет несколько различны преимущества по сравнению с другими методами ДНК иммобилизации. 5 Во- первых, большая молекула ДНК , привязанным на поверхности имеет естественную конформацию случайной катушки без сдвигового потока, который является критически важным для белка ДНК-связывающим признать его сайт связывания. Во-вторых, это очень легко изменить химическую среду вокруг молекулы ДНК для серии ферментативных реакций в проточной камере. В- третьих, микрожидком поток сдвига вызывает молекулы ДНК растяжение до 100% от полной длины контура, который очень трудно достичь с помощью альтернативного удлинения ДНК подходов , таких как поверхности иммобилизации 6 и удержания наноканале. 7 Полностью stretched молекула ДНК также предоставляет позиционную информацию, которая может оказаться полезной для мониторинга ферментативные движения на геномной карте.

Тем не менее, ДНК привязывать подход имеет критический недостаток в том, что интеркалирующего красителя, такие как YOYO-1 обычно вызывает привязные молекулы ДНК, чтобы быть легко нарушена светом возбуждения флуоресценции. Как правило, крупные молекулы ДНК должны быть окрашены с флуоресцентным красителем для визуализации под флуоресцентным микроскопом. Для этой цели, YOYO-1 или другие ТОТО серии красители используются, главным образом, потому что эти красители флуоресцируют только тогда , когда они интеркаляции двухцепочечной ДНК. 8 Тем не менее, хорошо известно , что бис-интеркалирующие краситель вызывает Светоиндуцированное ДНК фото-расщеплению , так как из интеркаляции флуорофоров 9 . Кроме того, флуоресцентно окрашенные молекулы ДНК , привязанные на поверхности являются более хрупкими , так как сдвиговые потоки могут оказывать нарушая силы на свободно движущихся молекул ДНК. Поэтому мы разработали FP-DBP как роман DБелок краситель NA-окрашивание для визуализации больших молекул ДНК на привязи на поверхности. Преимущество использования FP-DBP является то , что он не вызывает фото-расщепление ДНК - молекул , к которым он связывается. 10 Кроме того, FP-ДАД не приводит к увеличению контурной длины ДНК, в то время как бис-интеркалирующие красители увеличивают длину контура примерно на 33%.

Этот метод видео вводит экспериментальный подход для привязывания больших молекул ДНК к ПЭГ-биотин поверхности. На рисунке 1 показаны различные подходы привязывать ДНК с тупыми концами и липкими концами. Таким образом, этот способ окрашивания может быть применен к любому типу молекулы ДНК. 2 изображает схематическое представление сборки проточную камеру , которым можно управлять с помощью шприца насос для генерирования сдвиговых потоков для растягиваться молекулы ДНК, а также для загрузки химических и фермент решения. Рисунок 3 демонстрирует микрофотографии полностью растянутых молекул ДНК привязанных на PEGylatред поверхность 11 и окрашивали FP-DBP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ДНК Биотинилирование

  1. Биотинилирование тупыми ДНК с использованием терминальная трансфераза (TdT)
    Примечание: Используйте T4 ДНК (166 т.п.н.), которая представляет собой ДНК с тупыми.
    1. Добавьте 5 мкл 2,5 мМ CoCl 2, 5 мкл 10 × реакционного буфера, 0,5 мкл 10 мМ биотин-11-дУТФ, 0,5 мкл концевой трансферазы (10 единиц), и 0,5 мкл Т4 - ДНК (0,5 мкг / мкл) к реакционной смеси. Сделать до конечного объема 50 мкл путем добавления 38,5 мкл воды.
    2. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
      Примечание: Более продолжительное время реакции может дать двойной привязанные ДНК, то есть, возможно , что биотины помечены на обоих концах.
    3. Остановить реакцию добавлением 5 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8.
    4. Держите трубку при температуре 4 ° С.
  2. Биотинилирование липкого завершенного ДНК с помощью ДНК - лигазы
    Примечание: Используйте Х ДНК (48,5 т.п.н.), который представляет собой липкую конец ДНК. <ол>
  3. Добавить 1 мкл ДНК-лигазы Т4, 5 мкл 10 × буфера для лигирования 1 мкл 25 нг / мкл λ ДНК фага, и добавляют 43 мкл воды, чтобы конечный объем 50 мкл.
  4. Держите трубку при температуре 4 ° С.

2. функционализированных поверхности дериватизации

Примечание:. Чтобы привязанный конец молекулы ДНК на поверхности стекла, основная группа амина силанизированы на покровное с последующим биотин-ПЭГ - покрытием , как показано на рисунке 1 Этот процесс Пегилирование важен для визуализации ДНК одной молекулы , так как ему может значительно уменьшить случайный шум, создаваемый приложением нежелательных молекул на поверхности.

  1. Piranha Очистка
    Примечание: Решения Piranha энергично реагирует с органическими материалами, поэтому с ним следует обращаться с осторожностью, в соответствии с надлежащими правил техники безопасности.
    1. Место покровные на политетрафторэтилена (PTFE) стойку, и держать их бу PTFE Резьбовое уплотнение ленты в продольном направлении, половина на краю поверхностей и половина на стойке. После того, как обертку, оставить длинный кусок (~ 5 см) ленты для обработки стойки во время процедуры очистки.
    2. Заполните стеклянный стакан объемом 1 л 350 мл H 2 SO 4 и 150 мл H 2 O 2 , чтобы сделать пиранья решение в вытяжном шкафу. Поместите стойку в пираньи растворе в течение 2 часов.
    3. Пустой раствор пиранья из стакана, и покровные тщательно промыть деионизированной водой до рН воды в химическом стакане достигает нейтральной. Используйте рН полоски бумаги.
    4. Разрушать ультразвуком стойки покровных стеклах в химический стакан, содержащий воду, в течение 30 мин. Пустые воды из стакана непосредственно перед амино- силанизацией. Используйте 75 Вт озвучивания мощности для очистки и дериватизации стеклянных подложек.
  2. Aminosilanization на поверхности стекла
    1. Добавить 2 мл N - [3- (триметоксисилил) пропил] этилендиамина и 10 мл ледяной уксусной кислоты , 200 млметилового спирта в чистом полипропиленовый контейнер для приготовления раствора aminosilanization.
    2. Поместите очищенные покровные в полипропиленовый контейнер. Встряхнуть их при 100 оборотах в минуту и ​​комнатной температуре в течение 30 мин.
    3. Разрушать ультразвуком химический стакан с дериватизированных промахов покрова в течение 15 мин при 75 Вт Встряхнуть их при 100 оборотах в минуту и ​​комнатной температуре в течение по крайней мере 30 мин.
    4. Очищать раствор из стакана, и тщательно споласкивать покровные, один раз с метиловым спиртом, и в два раза этиловым спиртом. Храните покровные в этиловом спирте и использовать их в течение двух недель.
  3. Пегилирование покровного
    1. Сделать 10 мл 0,1 М раствором бикарбоната натрия (NaHCO 3). Фильтр решение с шприцевой фильтр 0,22 мкм.
    2. Растворите 2 мг карбоната биотин-ПЭГ-сукцинимидил (биотин-ПЭГ-SC) и 80 мг ПЭГ-сукцинимидил валерат (мПЭГ-SVG) в 350 мкл раствора NaHCO 3. Используйте легкую защитную трубку.
    3. Вихре трубки энергично в течение 10 сек, и центрифуга это при 10000 х г в течение 1 мин для удаления пузырьков.
    4. Промыть стекло с ацетоном, затем промывали этиловым спиртом. Разрешить слайд высохнуть на воздухе полностью.
    5. Поместите каплю (50 мкл) раствора PEG на чистую предметное стекло. Накройте капельку мягко с аминокислотой силанизированы покровным, без создания каких-либо пузырьков.
    6. Место слайды в течение 3 ч, чтобы в течение ночи в темноте, хорошо выровнена влажной камере при комнатной температуре. Используйте пустой держатель наконечника пипетки в камере, с водой на дне. Уплотнение остаточного раствора ПЭГ в трубке и держать его при температуре 4 ° С.
    7. Промыть покровное Pegylated тщательно деионизированной водой. Храните его в темном и сухом месте до использования.

3. Сборка проточной камерой

  1. Изготовить пробивки акриловый держатель, как показано на рисунке 2. Убедитесь , что диаметр трубки вставки составляет 0,762 мм, и обозначают одно отверстие впускной и другойвыпускное отверстие (рисунок 2).
  2. Поместите двухсторонние липкой лентой полоски (шириной 5-6 мм) на держателе акриловой (рисунок 2), совместив перпендикулярно к входным и выходным отверстием, не пошевелив каких - либо отверстий каналов. Используйте эти ленты полосы, как стены многоканальные сделать камеры. Скраб ленту, используя наконечник пипетки.
  3. Поместите покровное Pegylated на вершине, чтобы сделать камеры потока, со стороной пегилированного лицом вниз.
  4. Для того, чтобы предотвратить какое-либо решение от утечки, нажмите на верхнюю часть покровное над областью, где двухсторонние ленты размещены. Добавить быстрый сухой эпоксидный клей , чтобы закрыть края камеры в верхней и в нижней части (желтый цвет на рисунке 2).
  5. Подключение короткий кусок (2,5 см) из трубки (внешний диаметр, OD, 0,042 ") к герметичного шприца и герметизировать стык с эпоксидным клеем.
  6. Подключение длинные гибкие трубки (OD: 0,03 ") к трубопроводу, связанного с шприцем и герметизировать стык с эпоксидным клеем.
  7. Заполните TUBIнг связан с шприца с деионизированной водой. Убедитесь, что нет воздушных пузырьков.
  8. Вставьте трубку в отверстие проточной камеры запечатанный с эпоксидным клеем.
  9. Поместите желтый наконечник (200 мкл наконечника) на другое отверстие в резервуаре.

4. Пример Загрузка в поток палаты

Примечание: Neutravidin могут быть заменены другими авидин белками, такими как стрептавидин. Все реакции могут быть выполнены при комнатной температуре, если это не упоминается. Возьмем раствор образца в виде желтого наконечника, и установить наконечник с раствором на отверстие акрилового держателя (рисунок 2b).

  1. Установить расход шприцевой насос со скоростью 50 мкл / мин. Нагрузка 20 мкл авидин белка (25 мкг / мл в растворе Т50, трис 10 мМ, NaCl, 50 мМ, рН 8), и держать его в течение 10 мин.
  2. Нагрузка 20 мкл биотинилированных олигонуклеотидами (100 мкМ в 1 × ТЕ), и держать его в течение 10 мин. Если терминал трансферазы используется, пропустите загрузкуолигодезоксирибонуклеотидов.
  3. Нагрузка 20 мкл раствора ДНК из стадии 1 в проточную камеру при скорости потока 10 мкл / мин, и держать его в течение 30 мин.
  4. Промойте проточную камеру с 1 × TE, и загружают 40 мкл FP-ДАД 10 (~ 80 нм).
  5. Соблюдайте ДНК под флуоресцентным микроскопом с непрерывным потоком окрашивающих молекул в 1 × TE на 60X объектива. Использование 488 нм твердотельный лазер для возбуждения FP (EGFP) -DBP. Для полного участка молекулы ДНК, применяют различные скорости потока в соответствии с длиной ДНК, используемых. Например, применить 50 мкл / мин 48,5 т.п.н. Х ДНК, и 100 мкл / мин в течение 166 т.п.н. Т4 ДНК.
    1. Для повторного использования держателя акриловой, замочить собранные камеры потока в бытовой растворе моющего средства 12. Удалите ленты и эпоксидной смолы с бритвенным лезвием и втирают с руками, чтобы полностью снять их. Прочистить отверстия шприца иглы. Хранить держатели в деионизированной воде до дальнейшего использования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показаны два различных метода ДНК привязывание в зависимости от концевых структур молекулы ДНК. На рисунке 1а показано , как липкие законченные молекулы ДНК гибридизовали с комплементарными биотинилированных олигонуклеотидов, которые иммобилизованы на покрытые авидином PEG поверхности. На рисунке 1б показано добавление биотинилированный ддНТФ или дНТФ к гидроксильной группе 3'с тупыми ДНК с помощью терминальной трансферазы. Мы добавили гибкие линкеры между молекулами ДНК и биотин. Это увеличило перевязки и авидин-биотин эффективность связывания для обеспечения достаточного пространства для реакций. Рисунок 1в демонстрирует общую схематичное представление для привязывания ДНК на авидин покрытием PEG поверхности.

На рисунке 2 изображен узел проточной камеры вместе с акриловым держателем. По сравнению с Glass / кварцевые слайд - очки, изготовленным на заказ акриловый держатель упрощает подготовку проточной камеры для эпи-флуоресцентной микроскопии. 12 Камера потока обеспечивает мгновенное изменение буферных условий для ферментативных реакций, 6 и валентных молекул ДНК.

Рисунок 3 показывает одного-привязал ДНК и Т4 λDNA окрашивали FP-ДАД. Микрожидкостных сдвиговые течения вытянутые одиночные молекулы ДНК до полной длины контура, такой как 16,5 мкм (48,5 КБ А ДНК х 0,34 нм) и 56,4 мкм (166 Кб T4 ДНК X 0,34 нм). Мы смогли повторить ДНК растяжения и релаксации несколько раз в течение длительного периода времени (например, получасового), так как мы использовали FP-DBP , который не вызывает фото-расщепление.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема иллюстрация привязывать ДНК. а) sTicky состава ДНК гибридизуют с биотинилированным комплементарным олигонуклеотидом. Триэтиленгликоль гибкий линкер между олигонуклеотидом и биотинилированного дНТФ добавляется к тупым концом двухцепочечной ДНК, с помощью терминальной трансферазы биотин. Б). Polycarbon распорку (11-атомов) представляет собой гибкий линкер между дНТФ и биотин. С) биотинилированного ДНК прикрепляется к авидин белка, который связан с биотинилированным ПЭГ ковалентно связаны с поверхностью стекла. Отношение биотинилированного ПЭГ к нормальной ПЭГ 0.025 (1:40). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Технологическая схема камеры. а) Flow камера , состоящая из держателя акриловой кислоты , смолы, полосы двухсторонними лентами и пегилированного покрытия скольжения, Акриловый держатель размерами 76 мм х 26 мм х 5 мм (Д х Ш х В ), был изготовлен с помощью лазерной резки б) Вид сбоку камеры потока:. Перфорированные отверстия впускной канал , на котором установлен желтый наконечник для буферный резервуар, и выпускное отверстие , который соединен с трубкой , контролируемой шприц-насосом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Флуоресцентные микроскопические изображения вытянутых молекул ДНК окрашивали FP-ДАД. а) бактериофаг Л ДНК (48,5 т.п.н.) привязных на поверхности после лигирования с биотинилированным комплементарными олигонуклеотидами. б) бактериофага Т4 ДНК (166 п.н.) привязных на поверхности после добавления биотина с терминальной трансферазы. Выявленные стрелки показывают molecul ДНКэс растягивается до полной их длины контура, такой как 16,5 мкм при Х ДНК и 56,4 мкм для Т4 ДНК. Шкала баров:. 10 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представляем платформу для визуализации длинных молекул ДНК биотинилированного для закрепления на поверхностях. Мы сообщали подход к молекулам ДНК , привязанных на авидин белковой поверхности , покрытой с биотинилированного бычьего сывороточного альбумина. 6 В более раннем подходе, мы обнаружили , важнейший вопрос ДНК фото-расщепления , вызванного бис-интеркаляционных красителей , которые Stain молекулы ДНК привязанную на поверхность. Поскольку эти постоянно возбужденные флуорофоры имеют высокую вероятность для атаки фосфатной ДНК позвоночник, 9 свет возбуждения мощности должны были быть сведены к минимуму , чтобы избежать фото-расщеплению.

Для преодоления этого недостатка, мы разработали методами генной инженерии флуоресцентные белки с ДНК-связывающую способность (FP-DBP) для окрашивания ДНК без фото-расщеплению. 10 Мы наблюдали надежное окрашивание ДНК на покрытые авидином белковых поверхностей. Тем не менее, эта платформа была еще одна проблема нежелательной агрегации флуоресцентных белков наповерхностный белок, что приводит к увеличению фоновых шумов. Крайне важно, чтобы свести к минимуму этот случайный шум для анализа ДНК одной молекулы с целью повышения контрастности ДНК и белков из фона. Использование FP-DBP, следовательно, требует пассивации поверхности, чтобы предотвратить флуоресцентного белка от адсорбции на поверхности. ПЭГ может стать мощным кандидатом для этой цели. 12 Таким образом, мы использовали биотинилированный-ПЭГ, что значительно улучшенную отношение сигнал-шум для визуализации FP-DBP окрашенных молекул ДНК привязанных на поверхности.

Есть несколько важных шагов и отмечает в этом методе для более высоких урожаев. Для того , привязанный конец молекулы ДНК на поверхности стекла, первичная аминная группа силанизированы на покровное с последующим биотин-ПЭГ покрытием , как показано на рисунке 1. Этот процесс пассивации поверхности имеет решающее значение для визуализации ДНК одной молекулы потому , что он может значительно уменьшить уровень шума, генерирующим случайный адсорбции на поверхности.Таким образом, в течение ночи aminosilanization и Пегилирование настоятельно рекомендуется. Кроме того, очистка предметное стекло, а также покровного стекла с раствором пиранью может еще больше уменьшить фоновый шум.

Биотинилированный олигонуклеотид должен иметь фосфатную группу на 5'-конце для того, чтобы связать его с 3 'гидроксильной группы большой молекулы ДНК. Последовательность биотинилированного олигонуклеотида 5'-п-GGGCGGCGACCT-TEG-биотин-3 'при Х привязывать ДНК. Решение λ ДНК должен быть загружен вскоре после получения Х раствора ДНК (описанного в 1.1), так как λ ДНК часто образует concatemers с длительного хранения. Для тупыми концами ДНК, такой как Т4 ДНК, терминал трансферазы может добавить биотинилированных dUTPs на обоих концах ДНК без какой-либо специфичности. Таким образом, терминал время реакции трансферазы должен быть тщательно регулировались около часа, в противном случае продлен реакция может дать двойную меченных ДНК (то есть, оба конца меченного биотином). В дополненияition к вирусной ДНК, таких как λ и Т4, любые типы ДНК могут быть использованы в этой платформе. Тем не менее, рекомендуется использовать фрагменты из гигантской геномной ДНК после расщепления редкими резака ферментами рестрикции, такие как SwaI или NotI

Различные скорости потока применяются для различных длин ДНК. Как правило, более длинные молекулы ДНК требуются более высокие скорости потока, чтобы полностью растянуть молекулы ДНК, чтобы соответствовать точной длины контура. Например, λ ДНК может растягиваться до 16,5 мкм, что соответствует расчетному значению 0,34 нм х 48502 пар оснований.

Очень важно, чтобы свеже подготовить все материалы, в частности, все белки и колышки. Например, Neutravidin легко теряет свою функцию связывания биотины, если она хранится в виде разбавленного раствора. Для получения растворов PEG, рН имеет решающее значение для конъюгации функциональные группы первичного амина и н-гидроксисукцинимида. Поэтому рекомендуется свеже подготовить все материалы по крайней мере, каждую неделю,

Визуализация больших молекул ДНК привязанных на поверхности является универсальной платформой для применения для различных приложений, таких как геномика, Epigenomics, биохимических исследований для ДНК и взаимодействия белков, а также исследования физики полимеров. Тем не менее, этот подход в настоящее время ограничивается только для моделирования систем с использованием относительно простых и хорошо известных молекул ДНК, таких как вирусный геном. Для того, чтобы распространить на геном человека и эпигенома, чрезвычайно важно создать надежную, надежную и простую платформу для практического использования. Преодолевая светоиндуцированного ДНК фото-расщепление и предотвращая случайное адсорбции флуоресцентного белка на поверхности, поэтому эта платформа обеспечивает высокую четкость и высокую контрастность изображения для ДНК вытянутого с сдвиговых течениях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258, (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468, (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84, (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264, (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47, (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11, (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359, (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5, (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats