ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ויזואליזציה של מולקולות דנ"א גדולות קשורות ברצועה על משטחי זכוכית או חרוז נוצלה על חקירת אינטראקציות חלבון דנ"א, דינמיקת חלבון על מצע DNA, 1,2 ופיזיקת פולימר. 3,4 פלטפורמת מולקולות דנ"א גדולות יחידות קשורות יש כמה ברור יתרונות בהשוואה לשיטות וקיבוע DNA אחרים. 5 ראשית, מולקולת דנ"א גדולה הקשורה על פני השטח יש קונפורמציה טבעי אקראי סליל ללא אספקת גזירה, מהם החשיבות מכרעת עבור חלבון-DNA מחייבת להכיר אתר הקישור שלו. שנית, זה מאוד קל לשנות את הסביבה הכימית סביב מולקולות DNA לסדרת תגובות אנזימטיות בתא זרימה. שלישית, זרימת גזירת microfluidic גורמת DNA המולקולרית המתיח עד 100% של אורך המסלול המלא, וזה מאוד קשה להשיג באמצעות התארכות DNA גישות חלופית כגון משטח וקיבוע 6 וכליאת nanochannel. 7 מלא stretcheמולקולת הדנ"א ד גם מספקת מידע מיקומית כי יכול להיות שימושי עבור ניטור תנועות האנזימטית על המפה הגנומי.

אף על פי כן, גישת קשירת DNA יש חסרון קריטי כי לצבוע intercalating כגון YOYO-1 בדרך כלל גורם למולקולות DNA קשורות להישבר בקלות על ידי אור עירור קרינה. באופן כללי, מולקולות דנ"א גדולות צריכות להיות מוכתמות עם פלורסנט לצבוע להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לשם כך, YOYO-1 או צבעי סדרת הטוטו אחרים משמשים בעיקר בגלל צבעים אלה לזרוח רק כשהם intercalate פעמיים גדילי דנ"א. 8 עם זאת, ידוע כי bis-intercalating לצבוע גורם צילום מחשוף DNA האור הנגרמת בגלל של עיבור fluorophores 9 יתר על כן, מולקולות DNA מוכתמות fluorescently הקשור על פני השטח הן יותר שבירות מאז תזרים גזירה יכול להפעיל שבירת כוחות על העברת מולקולות DNA באופן חופשי. לכן, פיתחנו FP-DBP כרומן DNA-מכתים חלבון לצבוע הדמית מולקולות דנ"א גדולות קשורות ברצועה על פני השטח. היתרון של שימוש FP-DBP הוא שזה לא לגרום צילום מחשוף של מולקולות DNA שאליו הוא נקשר. 10 בנוסף, FP-DBP אינה מגדילה את אורך קווי המתאר של ה- DNA, ואילו צבעים-intercalating bis להגדיל את אורך המסלול בכ -33%.

שיטת וידאו זה מציגה את הגישה ניסיון אולי לקשירת מולקולות דנ"א גדולות משטח PEG-ביוטין. איור 1 מדגים גישות שונות של קשירת DNA עם קצוות בוטים קצוות דביקים. לכן, שיטה מכתימה זה יכול להיות מיושמת על כל סוג של מולקולת הדנ"א. איור 2 מתאר ייצוג סכמטי של הרכבת תא הזרימה שיכולה להיות נשלטה על ידי משאבת מזרק כדי ליצור תזרים גזירה למתוח מולקולות דנ"א וכן לטעון כימיים אנזים פתרונות. איור 3 מדגים micrographs של מולקולות DNA נמתח מלא קשורה על PEGylatמשטח ed 11 ומוכתם FP-DBP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA biotinylation

  1. Biotinylation של DNA חוד מעוגל באמצעות מסוף transferase (TDT)
    הערה: השתמש T4 DNA (166 KBP), שהינה DNA חוד מעוגל.
    1. הוסף 5 μl של 2.5 מ"מ 2 CoCl, 5 μl של 10 × חיץ התגובה, 0.5 μl של 10 מ"מ ביוטין-11-dUTP, 0.5 μl של transferase הטרמינל (10 יחידות), ו -0.5 μl של ה- DNA T4 (0.5 מיקרוגרם / μl) לתערובת התגובה. הפוך לנפח סופי של 50 μl ידי הוספת 38.5 μl של מים.
    2. דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
      הערה: זמן תגובה מורחבת עשוי להניב הדנ"א הדו-קשור, כלומר, יתכן כי biotins מתויג בשני קצותיו.
    3. עצור את התגובה על ידי הוספת 5 μl של 0.5 מ 'EDTA, pH 8.
    4. שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס.
  2. Biotinylation של DNA הסתיימה דביק שימוש DNA האנזים
    הערה: DNA λ השתמש (48.5 KBP), שהינה DNA דביק-סוף. <ol>
  3. הוסף 1 μl של ה- DNA האנזים T4, 5 μl של חיץ קשירת 10 ×, 1 μl של 25 ng / μl DNA הפאג λ, ולהוסיף 43 μl של מים כדי ליצור נפח סופי של 50 μl.
  4. שמור את הצינור על 4 מעלות צלזיוס.

2. derivatization Surface הפונקציונלי

הערה:. על מנת לקשור קץ של מולקולת דנ"א על משטח זכוכית, קבוצה אמינית העיקרי הוא silanized על coverslip ואחריו ציפוי ביוטין-PEG כפי שמוצג באיור 1 תהליך PEGylation זה חשוב הדמיה DNA מולקולה בודדת כי זה יכול להקטין אקראי רעש נוצר על ידי התקשרות של רצויי מולקולות משמעותיים על פני השטח.

  1. פיראנה ניקוי
    הערה: פתרונות פיראנה להגיב נמרצות עם חומרים אורגניים, ולכן זה צריך להיות מטופל בזהירות, עמידה בהנחיות בטיחות נאותה.
    1. מקום coverslips על מדף polytetrafluoroethylene (PTFE), ולהחזיק אותם בy PTFE חותם חוט קלטת לאורכו, חצי על קצה משטחים וחצי על המדף. לאחר גלישה, להשאיר חתיכה ארוכה (~ 5 סנטימטרים) של סרט לטיפול המתל במהלך הליך הניקוי.
    2. ממלאים כוס זכוכית 1 ליטר עם 350 מ"ל של H 2 SO 4 ו -150 מ"ל של H 2 O 2 כדי להפוך פתרון פיראניה במנדף. מניחים את מתלה בתמיסה פיראניה במשך שעה 2..
    3. פתרון פיראניה ריק מן הקנקן, ולשטוף coverslips ביסודיות עם מים ללא יונים עד pH של המים בכוס מגיע נייטרלי. השתמש רצועות נייר pH.
    4. Sonicate המדפים של תלושים לכסות במים המכילים המבחנה, למשך 30 דקות. מים ריקים מהקנקן רק לפני silanization אמינו. השתמש 75 ואט sonication לנקות derivatize מצעי הזכוכית.
  2. Aminosilanization על משטח זכוכית
    1. הוסף 2 מ"ל של N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylenediamine ו -10 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית 200 מ"לשל מתיל אלכוהול במיכל פוליפרופילן נקי להכנת הפתרון aminosilanization.
    2. מניחים coverslips לנקות בתוך המיכל פוליפרופילן. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל"ד ו החדר למשך 30 דקות.
    3. Sonicate כוס עם מכסה מחליק derivatized במשך 15 דקות ב 75 W. לנער אותם ב 100 הטמפרטורה סל"ד ו מקום לפחות 30 דקות.
    4. רוקן את הפתרון מן הקנקן, ולשטוף coverslips בזהירות, פעם עם אלכוהול מתיל, ופעמיים עם כוהל אתילי. coverslips אחסן כוהל אתילי ולהשתמש בהם תוך שבועיים.
  3. PEGylation של coverslip
    1. הפוך 10 מ"ל של 0.1 מ 'סודיום ביקרבונט (NaHCO 3). סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
    2. ממיסים 2 מ"ג של קרבונט ביוטין-PEG-succinimidyl (ביוטין-PEG-SC) ו -80 מ"ג של valerate PEG-succinimidyl (MPEG-SVG) ב 350 μl של NaHCO 3. השתמש צינור הגנת אור.
    3. וורטקס צינור נמרצות במשך 10 שניות, צנטריפוגות אותו ב 10,000 g × דקות 1 כדי להסיר בועות.
    4. יש לשטוף שקופית זכוכית עם אצטון, ואחריו שטיפה עם כוהל אתילי. אפשר את השקופית אוויר יבש לחלוטין.
    5. מניח ירידה (50 μl) של פתרון PEG בשקופית הזכוכית הנקיה. מכסים את אגל בעדינות עם תלוש כיסוי silanized אמינו, מבלי ליצור בועות.
    6. מקום שקופית עבור 3 שעות עד לילה חשוך, גם מפולס בתא לח בטמפרטורת חדר. השתמש בעל קצה פיפטה וריק כמו התא, עם מים בתחתית. חותם פתרון PEG שיורית בצינור ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס.
    7. שוטפים את coverslip PEGylated ביסודיות עם מים ללא יונים. אחסן אותו במקום חשוך ויבש עד השימוש.

3. הרכבת תא זרימה

  1. לפברק בעל אקריליק אגרוף, כמו באיור 2. ודא בקוטר של להכניס צינורות הוא 0.762 מ"מ, וציין חור אחד הוא מפרץ קטן והשני הואלשקע (איור 2).
  2. מניח רצועות סרט דביקות דו-צדדיות (רוחב 5-6 מ"מ) על בעל אקריליק (איור 2), יישור בניצב חור כניסה ויציאה, לא מביך כל חורי ערוץ. השתמש רצועות קלטת אלה קירות רב ערוצית לעשות תאים. שפשפו את הקלטת באמצעות קצה pipet.
  3. מניחים coverslip PEGylated על העליונה כדי ליצור תאי זרימה, כשהצד PEGylated עם הפנים כלפי מטה.
  4. כדי למנוע כל פתרון דליפה, לחץ על החלק העליון של coverslip על האזור שבו קלטות דו צדדית ממוקמות. להוסיף דבק אפוקסי מהיר יבש כדי לסגור את הקצוות של החדר בראש בתחתית (צבע צהוב באיור 2).
  5. חבר קטע קצר (2.5 ס"מ) של צינורות (קוטר חיצוני, OD, 0.042 ") כדי מזרק חזק גז ולאטום המפרק עם דבק אפוקסי.
  6. חבר צינורות (OD: 0.03 ") ארוכים וגמישים אל הצינורות צמודים המזרק ולאטום מפרק עם דבק אפוקסי.
  7. מלא את הטוביםng צמוד מזרק עם מים די. ודא שאין בועות אוויר.
  8. הכנס את הצינור לתוך החור של תא הזרימה חתום עם דבק אפוקסי.
  9. מניחים טיפ צהוב (200 קצה μl) על החור אחרים כמאגר.

4. טוענים דוגמא אל לשכת התזרים

הערה: Neutravidin ניתן להחליף חלבונים avidin אחרים כגון streptavidin. כל התגובות יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, אלא אם כן היא מוזכרת. קח פתרון מדגם טיפ צהוב, ולהתקין את הקצה עם הפתרון לתוך החור של בעל אקריליק (איור 2b).

  1. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה מזרק ב 50 μl / min. טען 20 μl של חלבון avidin (25 מיקרוגרם / מ"ל ​​בתמיסה T50, טריס 10 מ"מ, 50 מ"מ NaCl, pH 8), ולשמור אותו במשך 10 דקות.
  2. טען 20 μl של oligodeoxynucleotides biotinylated (100 מיקרומטר 1 × TE), ולשמור אותו במשך 10 דקות. אם transferase הטרמינל משמש, לדלג על הטעינהשל oligodeoxynucleotides.
  3. טען 20 μl של פתרון ה- DNA משלב 1 לתוך תא זרימה בקצב זרימה של 10 μl / min, ולשמור אותו במשך 30 דקות.
  4. שטפו את תא הזרימה עם 1 × TE, ולטעון 40 μl של 10 FP-DBP (~ 80 ננומטר).
  5. שים DNA תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם זרימה רציפה של מולקולות מכתימות ב 1 × TE על עדשה אובייקטיבית 60X. השתמש 488 לייזר מצב מוצק ננומטר עירור של FP (eGFP) -DBP. עבור מתיחה מלאה של מולקולות DNA, להחיל ספיקות שונות לפי אורכי DNA בשימוש. לדוגמה, להחיל 50 μl / min 48.5 KBP של DNA λ, ו 100 μl / min 166 KBP של דנ"א T4.
    1. עבור מחזור של בעל אקריליק, להשרות תאי זרימה התאספו בתמיסת דטרגנט בית 12. הסר קלטות אפוקסי עם סכין גילוח ולשפשף עם ידות כדי לקחת אותם לגמרי. סתימה חורה עם מחטי מזרק. שמור על הבעלים במי deionized עד לשימוש נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג שתי שיטות קשירת DNA שונות בהתאם מבני מסוף של מולקולת הדנ"א. האיור 1 א ממחיש כיצד מולקולות DNA הסתיימו הדביקות הם הכלאה עם oligonucleotides biotinylated משלים, אשר משותק על פני שטח PEG מצופה avidin. 1B איור מראה תוספת של biotinylated ddNTP או dNTP לקבוצת הידרוקסיל '3 של ה- DNA חוד מעוגל ידי transferase הטרמינל. הוספנו linkers גמישה בין מולקולות דנ"א ביוטין. עובדה זו הגבירה את היעילות מחייב קשירת avidin ביוטין לספק מספיק מקום עבור התגובות. תרשים 1C מדגים את ייצוג סכמטי כוללת קשירה DNA על פני השטח PEG מצופה avidin.

איור 2 מתאר את המכלול של החדר לזרום יחד עם בעל אקריליק. לעומת גלאסs / קוורץ משקפים שקופית, בעל אקריליק מחוייט מפשט את הכנת תא הזרימה עבור מיקרוסקופיה עלית פלורסנט. 12 תא הזרימה מאפשר שינוי מיידי של תנאי חיץ לתגובות אנזים, 6 ומולקולות DNA מתיחות.

איור 3 מדגים דנ"א חד-קשור ו- T4 λDNA מוכתם FP-DBP. גזירת Microfluidic זורמת מולקולות דנ"א יחיד מוארכות עד אורכי קונטור מלאים כגון 16.5 מיקרומטר (48.5 kb λ DNA x 0.34 ננומטר) 56.4 מיקרומטר (166 kb T4 DNA x 0.34 ננומטר). הצלחנו לחזור מתיחת DNA והרפיה מספר פעמים במהלך תקופה ממושכת (למשל, חצי שעה), מאז השתמשנו FP-DBP שאינו גורם-מחשוף תמונה.

איור 1
איור 1. איור סכמטי של קשירת DNA. א) יםDNA הסתיימה "דביק היא הכלאה עם oligonucleotide משלים biotinylated. טרי אתילן גלוקול הוא מקשר גמיש בין oligonucleotide ו ביוטין. ב) Biotinylated dNTP מתווסף בקצה הקהה ​​של DNA גדילי כפול, על ידי transferase הטרמינל. Spacer Polycarbon (11-אטומי) הוא מקשר גמיש בין dNTP ו ביוטין. ג) Biotinylated DNA מעוגן חלבון avidin, אשר מקושר PEG biotinylated מלוכדות קוולנטית אל משטח זכוכית. יחס PEG biotinylated לקדמותו PEG היה 0.025 (1:40). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תא זרימה. א) תא זרימה מורכב בעל שרף חומצה אקרילית, רצועות של קלטות פעמים צדדיות וכן PEGylated לכסות להחליק. בעל אקריליק של ממדים 76 מ"מ x 26 מ"מ x 5 מ"מ (גובה X רוחב X L), היה מפוברק עם חיתוך לייזר ב) מבט צד של החדר זרימה:. אגרוף חורים מהווים יציאת כניסת שעליו טיפ צהוב מותקן עבור מאגר חיץ, וכן יציאה מחובר בצינור בשליטת א-משאבת מזרק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תמונות מיקרוסקופיות פלורסנט של מולקולות DNA נמתח מוכתם FP-DBP. א) DNA λ bacteriophage (48.5 KBP) קשור על פני השטח לאחר קשירת עם oligonucleotides משלימים biotinylated. ב) DNA T4 bacteriophage (166 KBP) קשור על פני השטח לאחר הוספת ביוטין עם transferase הטרמינל. חיצים צוין להראות DNA molecules נמתח עד אורכי מתאר המלא שלהם כגון 16.5 מיקרומטר עבור DNA λ ו 56.4 מיקרומטר עבור DNA T4. ברי סולם:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מציגים פלטפורמה המאפשר הדמיה מולקולות דנ"א ארוכות biotinylated לעיגון על משטחים. דיווחנו גישה עבור מולקולות DNA קשור על משטח מצופה חלבון avidin עם אלבומין בסרום שור biotinylated. 6 לפי הגישה קודם לכן, מצאנו נושא מכריע של מחשוף צילום DNA הנגרם על ידי צבעי bis-העיבור כי להכתים מולקולות DNA קשור על משטח. כמו fluorophores נרגש הרף אלה יש סבירות גבוהה לתקיפה עמוד שדרה פוספט DNA, 9 הכוח אור עירור היה צריך להיות ממוזער כדי למנוע מחשוף התמונה.

על מנת להתגבר על אי הנוחות, פתחנו מהונדסים גנטיים חלבוני ניאון עם יכולת ה- DNA המחייבת (FP-DBP) עבור DNA המכתים בלי מחשוף תמונה. 10 צפה מכתים DNA אמין על משטחי חלבון מצופה avidin. אף על פי כן, לפלטפורמה הזו עוד בעיה של צבירה הרצויה של חלבוני ניאון עלפני חלבון, וכתוצאה מכך רעש רקע מוגבר. זה חיוני כדי למזער את הרעש האקראי הזה לניתוח DNA מולקולה בודדת על מנת לשפר את הניגודיות של דנ"א וחלבונים מן הרקע. השימוש FP-DBP ולכן דורש פסיבציה פני השטח כדי למנוע את חלבון פלואורסצנטי מלהיות adsorbed על פני השטח. PEG יכול להיות מועמד חזק למטרה זו. 12 לפיכך, השתמשנו biotinylated-PEG, שהגדילו באופן משמעותי את יחס אות לרעש עבור הדמיה FP-DBP מולקולות DNA מוכתם קשור על פני השטח.

ישנם מספר צעדים והערות קריטיים שיטה זו עבור תשואות גבוהות יותר. על מנת לקשור קץ של מולקולת דנ"א על משטח זכוכית, קבוצה אמינית העיקרי הוא silanized על coverslip ואחריו ציפוי ביוטין-PEG כפי שמוצג באיור 1. תהליך פסיבציה משטח זה הוא קריטי עבור הדמיה DNA מולקולה בודדת כי זה יכול להקטין רעש מניבות אקראי ספיחה על המשטחים באופן משמעותי.לכן, לילה aminosilanization ו PEGylation מומלץ בחום. בנוסף, ניקוי שקופיות הזכוכית כמו גם את מכסה הזכוכית עם פתרון פיראניה יכול להפחית את רעש רקע נוסף.

Oligonucleotide biotinylated חייב להיות קבוצת פוספט ב 5 'סוף כדי לקשר אותו 3' קבוצת הידרוקסיל של מולקולת דנ"א גדולה. הרצף של oligonucleotide biotinylated הוא 5'-p-GGGCGGCGACCT-TEG ביוטין- 3 'עבור קשירת DNA λ. פתרון ה- DNA λ צריך להיות טעון זמן קצר לאחר הכנה של פתרון ה- DNA λ (המתואר 1.1), כי λ DNA לעתים קרובות מהווה concatemers עם אחסון לטווח זמן. עבור DNA בוטה הסתיים כגון DNA T4, transferase הטרמינל יכול להוסיף dUTPs biotinylated בשני קצותיו של DNA ללא כל ייחוד. לפיכך, זמן תגובת transferase הטרמינל צריך להיות מותאם בקפידה סביב שעה, אחרת תגובה מורחבת עשויה להניב DNA פעמים שכותרתו (כלומר, בשני הקצוות מסומנים עם ביוטין). בהוספהition ל- DNA ויראלי כגון λ ו- T4, כל סוגי ה- DNA יכול להיות מנוצל על פלטפורמה זו. עם זאת, מומלץ להשתמש שברי מ- DNA גנומי ענקית לאחר עיכול על ידי אנזימים נדיר מחתך הגבלה כגון SwaI או NotI

ספיקות שונות מוחלות עבור אורכים שונים של DNA. בדרך כלל, מולקולות דנ"א עוד דורשות ספיקות מהר כדי למתוח את מולקולות ה- DNA מלא, כדי להתאים את אורך המסלול המדויק. לדוגמה, λ DNA יכול להשתרע עד 16.5 מיקרומטר, אשר תואמת את הערך המחושב של 0.34 ננומטר x 48,502 נ"ב.

זה די חשוב טרי להכין את כל החומרים, במיוחד כל חלבוני יתדות. לדוגמה, Neutravidin מאבד את תפקידו ברצון של מחייב biotins אם הוא מאוחסן כפתרון מדולל. לקבלת פתרונות PEG, pH הוא קריטי להטות קבוצות פונקציונליות של אמין ראשוני n-hydroxysuccinimide. לכן, מומלץ טרי להכין את כל החומרים לפחות מדי שבוע.

ויזואליזציה של מולקולות דנ"א גדולות קשורות ברצועה על פני השטח היא פלטפורמה צדדית שיש להחיל עבור מגוון רחב של יישומים כגון הגנומיקה, epigenomics, מחקרים ביוכימיים עבור דנ"א אינטראקצית חלבון, ומחקרי פיזיקת פולימר. עם זאת, גישה זו כיום מוגבלת רק לבנות מודל מערכות המשתמשות פשוט יחסית ידועה מולקולות DNA כגון הגנום הויראלי. כדי להתארך עד הגנום האנושי epigenome, יש חשיבות קריטית להקים פלטפורמה יציבה, אמינה, ופשוטה לשימוש מעשי. על ידי להתגבר על-מחשוף צילום DNA-induced אור ומניעת ספיחה אקראית של חלבון פלואורסצנטי על פני השטח, פלטפורמה זו ולכן מספקת תמונות ברורות ניגודיות גבוהה עבור DNA מוארכת עם תזרימי גזירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258, (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468, (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84, (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264, (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47, (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11, (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359, (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5, (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats