La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
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Biology

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Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

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Abstract

Introduction

La visualización de grandes moléculas de ADN atados en superficies de vidrio o de talón se ha utilizado para la investigación de las interacciones ADN-proteína, la dinámica de proteínas sobre un sustrato de ADN, 1,2 y física de polímeros. 3,4 Una plataforma para grandes moléculas de ADN de una sola atados tiene unos pocos distinta ventajas en comparación con otros métodos de inmovilización de ADN. 5 en primer lugar, una molécula de ADN grande atado en la superficie tiene una conformación aleatoria bobina natural sin un flujo de cizallamiento, que es de importancia crítica para una proteína de unión a ADN de reconocer su sitio de unión. En segundo lugar, es muy fácil cambiar el entorno químico alrededor de moléculas de ADN para una serie de reacciones enzimáticas en una cámara de flujo. En tercer lugar, un flujo de cizallamiento de microfluidos induce ADN molecular de estiramiento hasta 100% de la longitud del contorno completo, lo cual es muy difícil de lograr con la elongación del ADN enfoques alternativos como la inmovilización superficie 6 y el confinamiento nanochannel. 7 A completamente stretched molécula de ADN también proporciona información de posición que puede ser útil para el seguimiento de los movimientos enzimáticas en el mapa genómico.

Sin embargo, el procedimiento de anclaje del ADN tiene un defecto crítico en que el colorante de intercalación tales como el YOYO-1 por lo general hace que las moléculas de ADN atados a ser fácilmente rotas por la luz de excitación de fluorescencia. En general, las grandes moléculas de ADN tienen que ser teñido con un tinte fluorescente para la visualización en un microscopio fluorescente. Para este fin, otros colorantes de la serie TOTO YOYO-1 o son principalmente usados ​​debido a que estos tintes son fluorescentes solamente cuando se intercalan DNA de doble cadena. 8 Sin embargo, es bien sabido que los bis-intercalantes colorante hace DNA inducida por la luz de foto-escisión porque de la intercalación de fluoróforos. 9 Además, las moléculas de ADN fluorescente manchadas atados en la superficie son más frágiles puesto que los flujos de cizallamiento pueden ejercer fuerzas de rotura en mover libremente moléculas de ADN. Por lo tanto, hemos desarrollado FP-PAD como una novela DNA-tinción de colorante de proteínas para obtener imágenes de grandes moléculas de ADN atados en la superficie. La ventaja de usar FP-DBP es que no causa foto-escisión de las moléculas de ADN al que se une. 10 Además, FP-DBP no aumenta la longitud de contorno de ADN, mientras que los colorantes bis-intercalantes aumentan la longitud de contorno en aproximadamente 33%.

Este método de vídeo introduce el enfoque experimental para la inmovilización de grandes moléculas de ADN a una superficie de PEG-biotina. La figura 1 ilustra los diferentes enfoques de la inmovilización de ADN con extremos romos y extremos pegajosos. Por lo tanto, este método de tinción se puede aplicar a cualquier tipo de molécula de ADN. La figura 2 muestra una representación esquemática del conjunto de cámara de flujo que puede ser controlado por una bomba de jeringa para generar flujos de cizallamiento para estirar las moléculas de ADN, así como para carga química y enzimática soluciones. la Figura 3 muestra micrografías de las moléculas de ADN completamente estirada atados en el PEGylated superficie 11 y se tiñeron con FP-PAD.

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Protocol

1. ADN biotinilación

  1. La biotinilación de ADN de extremos romos usando transferasa terminal (TdT)
    Nota: El uso de ADN T4 (166 kpb), que es un ADN de extremos romos.
    1. Añadir 5 l de 2,5 mM CoCl 2, 5 l de 10 x tampón de reacción, 0,5 l de 10 mM de biotina-11-dUTP, 0,5 l de transferasa terminal (10 unidades), y 0,5 l de ADN T4 (0,5 g / l) a la mezcla de reacción. Hacer a un volumen final de 50 l mediante la adición de 38,5 l de agua.
    2. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 1 hr.
      Nota: el tiempo de reacción extendido puede producir ADN de doble atado, es decir, es posible que biotinas etiquetados en ambos extremos.
    3. Detener la reacción mediante la adición de 5 l de 0,5 M EDTA, pH 8.
    4. Mantenga el tubo a 4 ° C.
  2. La biotinilación de DNA de composición pegajosa Uso de ADN ligasa
    Nota: El uso λ DNA (48,5 kpb), que es un ADN de extremo cohesivo. <ol>
  3. Añadir 1 l de ADN ligasa de T4, 5 l de 10 x tampón de ligación, 1 l de 25 ng / l de ADN de fago λ, y añadir 43 l de agua para hacer un volumen final de 50 l.
  4. Mantenga el tubo a 4 ° C.

2. La derivación de superficie funcionalizado

Nota:. Con el fin de atar un extremo de una molécula de ADN en la superficie de vidrio, un grupo amina primaria se silanizada en un cubreobjetos, seguido de recubrimiento con biotina PEG como se muestra en la Figura 1 Este proceso PEGilación es importante para la formación de imágenes de ADN de una sola molécula porque puede reducir significativamente el ruido aleatorio creado por la unión de moléculas no deseadas en la superficie.

  1. Piranha limpieza
    Nota: Las soluciones Piranha reaccionan violentamente con materiales orgánicos, por lo que debe ser manejado con cuidado, siguiendo las directrices de seguridad adecuadas.
    1. Lugar cubreobjetos sobre una rejilla de politetrafluoroetileno (PTFE), y los mantienen by cinta de PTFE sello de rosca a lo largo, la mitad en el borde de las superficies y la otra mitad en el estante. Después de envolver, deje una pieza larga (~ 5 cm) de cinta para el manejo del soporte durante el procedimiento de limpieza.
    2. Llenar un vaso de vidrio de 1 litro con 350 ml de H 2 SO 4 y 150 ml de H 2 O 2 para hacer la solución piraña en una campana de humos. Coloque la parrilla en solución Piranha durante 2 horas.
    3. solución vacío piraña del vaso de precipitados, y cubreobjetos de enjuague a fondo con agua desionizada hasta que el pH del agua en el vaso alcanza neutro. Utilice tiras de papel de pH.
    4. Sonicar los bastidores de cubierta se desliza en el agua vaso de precipitados que contiene, por 30 min. Vaciar el agua del vaso justo antes de amino silanización. Utilice 75 W de potencia de ultrasonidos para limpiar y derivar los sustratos de vidrio.
  2. Aminosilanization sobre la superficie de cristal
    1. Añadir 2 ml de N - [3- (trimetoxisilil) propil] etilendiamina y 10 ml de ácido acético glacial a 200 mlde alcohol metílico en un recipiente de polipropileno limpio para la preparación de la solución aminosilanization.
    2. Colocar cubreobjetos limpios en el recipiente de polipropileno. Agitar ellos en 100 rpm y la temperatura ambiente durante 30 min.
    3. Someter a ultrasonidos el vaso con cubreobjetos derivatizados durante 15 min a 75 W. los agita a 100 rpm y la temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
    4. Vaciar la solución del vaso de precipitados, y enjuague cubreobjetos con cuidado, una vez con alcohol metílico, y dos veces con alcohol etílico. cubreobjetos de las tiendas en alcohol etílico y los utilizan dentro de dos semanas.
  3. PEGilación del cubreobjetos
    1. Hacer 10 ml de bicarbonato de sodio 0,1 M (NaHCO 3). Se filtra la solución con un filtro de jeringa de 0,22-micras.
    2. Disolver 2 mg de carbonato de biotina-PEG-succinimidilo (biotina-PEG-SC) y 80 mg de valerato de PEG-succinimidilo (mPEG-SVG) en 350 l de NaHCO3. Use un tubo de protección de la luz.
    3. Vortex el tubo vigorosamente durante 10 seg, y se centrifuga al 10.000 × g durante 1 min para eliminar las burbujas.
    4. Enjuague un portaobjetos de vidrio con acetona, seguido de un enjuague con alcohol etílico. Deje que el portaobjetos se seque al aire completamente.
    5. Coloque una gota (50 l) de la solución de PEG en el portaobjetos de vidrio limpio. Cubrir la gotita suavemente con una hoja de la cubierta amino silanizada, sin generar burbujas.
    6. Colocar los portaobjetos durante 3 horas hasta toda la noche en un lugar oscuro, bien nivelados cámara húmeda a temperatura ambiente. Utilice un soporte de la punta de la pipeta vacía como la cámara, con agua en la parte inferior. Sellar solución de PEG residual en el tubo y se mantiene a 4 ° C.
    7. Enjuague el portaobjetos pegilado a fondo con agua desionizada. Almacenarlo en un lugar oscuro y seco hasta su uso.

3. Montaje de una cámara de flujo

  1. Fabricar un soporte acrílico perforado, como en la Figura 2. Asegúrese de que el diámetro de la inserción de la tubería es 0,762 mm, y designar un agujero es una entrada y el otro esuna salida (Figura 2).
  2. Coloque tiras adhesivas de doble cara de cinta (ancho 5-6 mm) en un soporte de acrílico (Figura 2), alineando perpendicularmente a un orificio de entrada y salida, no perturbar cualquier orificio del canal. Utilice estas tiras de cinta como las paredes de varios canales para hacer cámaras. Frote la cinta utilizando una punta de pipeta.
  3. Colocar un cubreobjetos pegilado en la parte superior para hacer cámaras de flujo, con la cara hacia abajo pegilado.
  4. Para evitar cualquier solución se produzcan fugas, presione la parte superior de un cubreobjetos sobre el área donde se colocan cintas de doble cara. Añadir pegamento de secado rápido epoxi para cerrar los bordes de la cámara en la parte superior y en la parte inferior (color amarillo en la Figura 2).
  5. Conectar una pieza corta (2,5 cm) de tubo (diámetro externo, OD, 0,042 ") a una jeringa hermética a los gases y sellar la unión con pegamento de epoxi.
  6. Conectar un tubo largo y flexible (OD: 0,03 ") a la tubería vinculada a la jeringa y sellar la unión con pegamento epoxi.
  7. Llene el Tubing vinculada a la jeringa con agua DI. Asegúrese de que no hay burbujas de aire.
  8. Introduzca el tubo en el orificio de la cámara de flujo sellado con pegamento de epoxi.
  9. Coloque una punta amarilla (200 punta l) en el otro orificio como reservorio.

4. Carga de la muestra en la cámara de flujo

Nota: Neutravidina se puede sustituir con otras proteínas avidina como la estreptavidina. Todas las reacciones pueden realizarse a temperatura ambiente, a menos que se menciona. Tome la solución de la muestra en una punta amarilla, e instalar la punta con la solución sobre el agujero del soporte de acrílico (Figura 2b).

  1. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 50 l / min. Carga de 20 l de proteína de avidina (25 mg / ml en solución T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), y mantenerla durante 10 minutos.
  2. Carga de 20 l de oligodesoxinucleótidos con biotina (100 micras en 1 x TE), y mantenerla durante 10 minutos. Si se utiliza transferasa terminal, no realice la cargade oligodesoxinucleótidos.
  3. Carga de 20 l de solución de ADN a partir del paso 1 en la cámara de flujo a un caudal de 10 l / min, y mantenerla durante 30 minutos.
  4. Se lava la cámara de flujo con 1 x TE, y la carga de 40 l de FP-PAD 10 (~ 80 nm).
  5. Observe ADN bajo un microscopio de fluorescencia con flujo continuo de moléculas de tinción en 1 x TE en una lente de objetivo 60X. Utilice 488 nm láser de estado sólido para la excitación de FP -DBP (EGFP). Para estiramiento completo de moléculas de ADN, aplicar diferentes velocidades de flujo de acuerdo con las longitudes de ADN utilizados. Por ejemplo, se aplican 50 l / min durante 48,5 kpb de ADN λ, y 100 l / min durante 166 kpb de ADN T4.
    1. Para el reciclaje del soporte de acrílico, remojo cámaras de flujo montados en una solución de detergente doméstico 12. Retire las cintas y epoxi con una hoja de afeitar y frotar con las manos para tomar completamente apagado. Destapar los agujeros con agujas de jeringas. Mantener a los titulares en agua desionizada hasta su uso posterior.

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Representative Results

La figura 1 muestra dos métodos de inmovilización de ADN diferentes en función de las estructuras terminales de la molécula de ADN. La Figura 1a ilustra cómo las moléculas de ADN de extremos pegajosos se hibridan con oligonucleótidos biotinilados complementarios, que están inmovilizados en la superficie PEG avidina-revestido. La Figura 1B muestra la adición de biotinilado ddNTP o dNTP para el grupo hidroxilo 3 'de un ADN de extremos romos por transferasa terminal. Añadimos enlazadores flexibles entre moléculas de ADN y la biotina. Esto aumentó la eficacia de la unión de ligación y avidina-biotina para proporcionar espacio suficiente para las reacciones. La Figura 1C muestra la representación esquemática general para la inmovilización de ADN en la superficie PEG avidina-revestido.

La figura 2 representa el conjunto de la cámara de flujo a lo largo con un soporte de acrílico. En comparación con glass / gafas de diapositivas de cuarzo, un soporte acrílico hecho a medida simplifica la preparación de la cámara de flujo para la microscopía de epi-fluorescencia. 12 La cámara de flujo permite el cambio instantáneo de las condiciones del tampón para reacciones enzimáticas, 6 y estiramiento de moléculas de ADN.

La Figura 3 muestra de ADN-atado sola y T4 λDNA teñido con FP-PAD. cizalla de microfluidos flujos de moléculas individuales de ADN alargadas hasta longitudes de contorno completos, que incluyen 16,5 m (48,5 kb de ADN λ x 0,34 nm) y 56,4 micras (166 kb de ADN T4 x 0,34 nm). Hemos sido capaces de repetir ADN de estiramiento y relajación varias veces durante un período prolongado (por ejemplo, media hora), ya que hemos utilizado FP-PAD que no causa foto-escote.

Figura 1
Figura 1. Representación esquemática de la inmovilización del ADN. a) sADN de punta ticky se hibrida con un oligonucleótido complementario biotinilado. Trietilenglicol es un enlazador flexible entre el oligonucleótido y biotinilado dNTP se añade a un extremo romo de ADN de doble cadena, por transferasa terminal biotina. B). Spacer Policarbono (11 átomos) es un enlazador flexible entre dNTP y biotina. C) ADN biotinilado está anclada a una proteína avidina, que está vinculada a un PEG biotinilado unido covalentemente a la superficie de vidrio. La proporción de PEG con biotina con PEG normal fue de 0,025 (1:40). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Cámara de flujo. a) Cámara de flujo consiste en un soporte de resina de ácido acrílico, tiras de cintas de doble cara y una hoja de cubierta pegilado. El titular de acrílico de dimensiones de 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x W x H), se fabricó con corte por láser b) Vista lateral de la cámara de flujo:. Orificios perforados son un orificio de entrada en la que se instala una punta amarilla por un depósito de regulación, y un orificio de salida que está conectado a un tubo controlado por una jeringa de la bomba. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Imágenes microscópicas fluorescentes de moléculas de ADN estirados teñidas con FP-PAD. a) el ADN del bacteriófago λ (48,5 kbp), atado en la superficie después de la ligación con los oligonucleótidos complementarios biotinilados. b) DNA del bacteriófago T4 (166 kpb) atado en la superficie después de la adición de biotina con transferasa terminal. flechas indicadas muestran molecul ADNes estiran hasta sus longitudes de contorno completo tal como 16,5 micras para DNA λ y 56,4 micras para el ADN T4. Las barras de escala:. 10 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí presentamos una plataforma para la visualización de moléculas largas de ADN con biotina para el anclaje en las superficies. Hemos informado un enfoque para moléculas de ADN atados en una superficie recubierta de proteína de avidina con albúmina de suero bovino biotinilada. 6 En el enfoque anterior, se encontró una cuestión crucial de ADN foto-escisión causado por colorantes bis-de intercalación que manchan moléculas de ADN atado en el superficie. A medida que estos fluoróforos excitados continuamente tienen una alta probabilidad de atacar a un esqueleto de fosfato del ADN, 9 la potencia de luz de excitación se tuvo que reducir al mínimo para evitar la foto-escisión.

A fin de superar este inconveniente, se desarrolló por ingeniería genética proteínas fluorescentes de unión al ADN con capacidad (FP-DBP) para el ADN de tinción sin foto-escisión. 10 Se observó tinción de ADN fiable sobre superficies de las proteínas recubiertas de avidina. No obstante, esta plataforma tenía otro problema de la agregación indeseable de las proteínas fluorescentes en elsuperficie de la proteína, lo que resulta en un aumento del ruido de fondo. Es esencial para reducir al mínimo este ruido aleatorio para análisis de ADN de una sola molécula para mejorar el contraste de ADN y las proteínas del fondo. El uso de FP-DBP por lo tanto requiere pasivación de la superficie para evitar que la proteína fluorescente de ser adsorbido en la superficie. PEG podría ser un potente candidato para este propósito. 12 Por lo tanto, hemos utilizado biotinilado-PEG, que mejora considerablemente la relación señal-ruido para las moléculas de ADN de imágenes FP-DBP teñidas atados en la superficie.

Hay varios pasos críticos y notas de este método para rendimientos más altos. Con el fin de atar un extremo de una molécula de ADN en una superficie de vidrio, un grupo amina primaria se silanizada en un cubreobjetos, seguido de recubrimiento con biotina PEG como se muestra en la Figura 1. Este proceso de pasivación de la superficie es crítica para la formación de imágenes de ADN de una sola molécula porque puede reducir significativamente la adsorción al azar de generación de ruido en las superficies.Por lo tanto, se recomienda encarecidamente aminosilanization durante la noche y la PEGilación. Además, la limpieza de la lámina de vidrio, así como la cubierta de vidrio con solución Piranha puede reducir aún más el ruido de fondo.

Un oligonucleótido biotinilado debe tener un grupo fosfato en el extremo 5 'con el fin de vincularlo a 3' grupo hidroxilo de una molécula de ADN grande. La secuencia de oligonucleótido biotinilado es 5'-p-GGGCGGCGACCT-TEG-biotina-3 'para la inmovilización de ADN λ. La solución de DNA λ tiene que ser cargado poco después de la preparación de solución de ADN λ (descrito en 1.1), porque λ DNA a menudo se forma concatemers con el almacenamiento de largo plazo. Para el ADN de extremos romos tal como ADN T4, transferasa terminal puede añadir dUTPs biotinilados en ambos extremos de ADN sin ninguna especificidad. Por lo tanto, el tiempo de reacción transferasa terminal tiene que ser ajustado con cuidado alrededor de una hora, de lo contrario la reacción extendido puede producir ADN de doble marcado (es decir, ambos extremos se marcan con biotina). en complementoition al ADN viral tal como λ y T4, cualquier tipo de ADN puede ser utilizado en esta plataforma. Sin embargo, se recomienda el uso de fragmentos de ADN genómico gigantesca después de la digestión por enzimas de restricción raros-cortador como SwaI o NotI

Diferentes velocidades de flujo se aplican para las diferentes longitudes de ADN. Por lo general, las moléculas de ADN más largas requieren velocidades de flujo más rápidas para estirar completamente las moléculas de ADN, para que coincida con la longitud exacta del contorno. Por ejemplo, λ DNA puede estirar hasta 16,5 micras, lo que corresponde al valor calculado de 0,34 nm x 48.502 pb.

Es muy importante preparar recién todos los materiales, en particular todas las proteínas y PEG. Por ejemplo, Neutravidina pierde fácilmente su función de biotinas unión si se almacena como una solución diluida. Para las soluciones de PEG, el pH es crítico para conjugar grupos funcionales de una amina primaria y n-hidroxisuccinimida. Por lo tanto, se recomienda para preparar recién todos los materiales al menos cada semana.

La visualización de grandes moléculas de ADN atados en la superficie es una plataforma versátil para ser aplicado para una variedad de aplicaciones tales como la genómica, epigenomics, estudios bioquímicos de ADN y la interacción de proteínas, y los estudios de la física de polímeros. Sin embargo, este enfoque está limitado sólo para modelar sistemas que utilizan moléculas de ADN relativamente simples y bien conocidos, tales como el genoma viral. Para ser ampliado con el genoma humano y el epigenoma, es muy importante establecer una plataforma robusta, fiable y sencilla para el uso práctico. Mediante la superación de la luz inducida por ADN foto-escote y evitar la adsorción de la proteína fluorescente al azar en la superficie, por lo tanto, esta plataforma proporciona imágenes claras y de alto contraste de ADN alargado con flujos de cizalla.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

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References

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