Visualisatie van Surface aangebonden grote DNA moleculen met een Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Visualisatie van grote DNA-moleculen gebonden op glas of kraal oppervlakken is gebruikt voor het onderzoeken van DNA-eiwit interacties, eiwit dynamica van DNA-substraat, 1,2 en polymeerfysica. 3,4 Een platform voor single-tethered grote DNA-moleculen heeft een paar verschillende voordelen ten opzichte van andere DNA immobilisatie werkwijzen. 5 Ten eerste, een groot DNA-molecuul gebonden aan het oppervlak een natuurlijke willekeurige coil conformatie zonder shear flow die cruciaal voor een DNA bindend eiwit aan zijn bindingsplaats herkennen. Ten tweede is het zeer gemakkelijk om de chemische omgeving rond DNA moleculen veranderen van een reeks enzymatische reacties in een stromingskamer. Ten derde, een microfluïde afschuifstroming induceert DNA moleculaire uitstrekt tot 100% van de volledige contour lengte, die zeer moeilijk te bereiken alternatieve DNA elongatie zal zoals oppervlakte immobilisatie 6 en nanokanaal opsluiting. 7 Een volledig stretched DNA molecuul ook positie-informatie voor de controle enzymatische bewegingen op de genomische kaart kan zijn.

Toch is de DNA-tethering aanpak heeft een kritische tekortkoming in de intercalerende kleurstof zoals YOYO-1 in het algemeen veroorzaakt tethered DNA-moleculen gemakkelijk om gebroken te worden door middel van fluorescentie excitatie licht. In het algemeen grote DNA moleculen te worden gemerkt met een fluorescente kleurstof voor visualisatie onder een fluorescentiemicroscoop. Daartoe YOYO-1 of andere TOTO series kleurstoffen worden vooral omdat deze kleurstoffen alleen fluoresceren wanneer ze dubbelstrengs DNA intercaleren. 8 is echter bekend dat bis-intercalerende kleurstof veroorzaakt licht geïnduceerde DNA foto-splitsing omdat intercalatie van de fluoroforen. 9 verder fluorescerend gekleurd DNA-moleculen gebonden aan het oppervlak zijn kwetsbaarder omdat shear flows uitoefenen brekende krachten op vrij bewegen DNA moleculen. Daarom hebben wij FP-DBP als nieuw DNA-eiwit kleuring kleurstof voor het afbeelden van grote DNA-moleculen gebonden aan het oppervlak. Het voordeel van FP-DBP is dat het geen foto-splitsing van de DNA-moleculen waaraan het bindt veroorzaakt. 10 Bovendien FP-DBP niet de contour lengte van DNA verhogen, terwijl bis-intercalerende kleurstoffen verhogen de contourlengte ongeveer 33%.

Deze video methode introduceert de experimentele aanpak voor tethering grote DNA-moleculen aan een PEG-biotine oppervlak. Figuur 1 toont verschillende benaderingen van aanbinden DNA met stompe uiteinden en sticky ends Aldus kan deze kleuring worden toegepast op elk soort DNA-molecuul. Figuur 2 toont een schematische weergave van de stromingskamer samenstelling die kan worden gecontroleerd door een spuitpomp om dwarskracht stromen DNA-moleculen strekken en chemische en enzym plaatsen genereren oplossingen. Figuur 3 toont microfoto van volledig gestrekt DNA-moleculen gebonden aan het PEGylated oppervlak 11 en gekleurd met FP-DBP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA Biotinylatie

  1. Biotinylering van stompe uiteinden DNA met behulp van Terminal transferase (TdT)
    Opmerking: Gebruik T4 DNA (166 kbp), dat een stomp eindigende DNA.
    1. Voeg 5 ul van 2,5 mM CoCl2, 5 pi 10 x reactiebuffer, 0,5 pi 10 mM biotine-11-dUTP, 0,5 gl terminale transferase (10 eenheden) en 0,5 pl T4 DNA (0,5 ug / ul) aan het reactiemengsel. Maak een eindvolume van 50 ul door toevoegen van 38,5 pl water.
    2. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 1 uur.
      Opmerking: uitbreiding reactietijd kan dubbel-gebonden DNA werd verkregen, dat wil zeggen, het is mogelijk dat biotine gelabeld zijn aan beide uiteinden.
    3. Stop de reactie door toevoeging van 5 pl 0,5 M EDTA, pH 8.
    4. Houd de buis bij 4 ° C.
  2. Biotinylering van kleverige eindigende DNA gebruiken DNA Ligase
    Opmerking: Gebruik λ DNA (48,5 kbp), dat een klevende uiteinden DNA. <ol>
  3. Voeg 1 pl T4 DNA ligase, 5 ui 10 x ligatiebuffer, 1 pl 25 ng / pl λ faag-DNA en voeg 43 ul water tot een eindvolume van 50 pl te maken.
  4. Houd de buis bij 4 ° C.

2. Gefunctionaliseerde Surface Derivatisering

Opmerking:. Om een uiteinde van een DNA-molecuul op glasoppervlakte tether, is een primaire aminegroep gesilaniseerd op een dekglaasje gevolgd door biotine-PEG bekleding zoals weergegeven in figuur 1 Dit PEGylatie is van belang voor het individuele molecuul DNA beeldvorming omdat het kan aanzienlijk verminderen willekeurige ruis door aanhechting van ongewenste moleculen op het oppervlak.

  1. Piranha Cleaning
    Opmerking: Piranha oplossingen reageren heftig met organische materialen, dus het moet met zorg worden behandeld, volgens de juiste richtlijnen voor veiligheid.
    1. Plaats coverslips op een polytetrafluorethyleen (PTFE) rack, en houd ze by PTFE Draaddichtend tape lengte, helft aan de rand van de oppervlakken en de helft op het rek. Na het verpakken, laat een lang stuk (~ 5 cm) van de tape voor de behandeling van het rek tijdens de reiniging.
    2. Vul een 1 L glazen beker met 350 ml H 2 SO 4 en 150 ml H 2 O 2 tot piranha oplossing in een zuurkast maken. Plaats het rek piranha-oplossing gedurende 2 uur.
    3. Lege piranha oplossing uit de beker, en spoel dekglaasjes grondig met gedemineraliseerd water totdat de pH van het water in de beker bereikt neutraal. Gebruik pH-papier stroken.
    4. Ultrasone trillingen de rekken van de dekglaasjes in de beker met water, gedurende 30 minuten. Lege water uit de beker net voor amino silaneren. Gebruik 75 W van sonicatie vermogen te reinigen en te derivatiseren de glassubstraten.
  2. Aminosilanization op glasoppervlakte
    1. Voeg 2 ml N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethyleendiamine en 10 ml ijsazijn en 200 mlmethylalcohol in een schone polypropyleen houder voor het bereiden van de aminosilanization oplossing.
    2. Plaats gereinigd dekglaasjes in de polypropyleen container. Schud ze bij 100 rpm en kamertemperatuur gedurende 30 min.
    3. Ultrasone trillingen het bekerglas met gederivatiseerde dekglaasjes gedurende 15 minuten bij 75 W. Schud ze op 100 rpm en kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min.
    4. Leeg de uit de beker, en spoel dekglaasjes voorzichtig, eenmaal met methanol en tweemaal met ethanol. Store dekglaasjes in ethylalcohol en gebruik ze binnen twee weken.
  3. PEGylatie van het dekglaasje
    1. Voeg 10 ml 0,1 M natriumbicarbonaat (NaHCO3). Filtreer de oplossing door een 0,22 urn spuitfilter.
    2. Los 2 mg biotine-PEG-succinimidyl carbonaat (biotine-PEG-SC) en 80 mg PEG-succinimidyl valeraat (mPEG-SVG) in 350 pl van NaHCO3. Gebruik een lichte bescherming buis.
    3. Vortex de buis krachtig gedurende 10 sec, en centrifuge het op 10.000 xg gedurende 1 min te bellen te verwijderen.
    4. Spoel een glasplaatje met aceton, gevolgd door spoelen met ethylalcohol. Laat de schuif aan de lucht volledig drogen.
    5. Een druppel (50 pl) van PEG-oplossing op de schone glasplaatje. Bedek de druppel voorzichtig af met een amino-gesilaniseerd dekglaasje, zonder dat dit tot enige bubbels.
    6. Plaats dia's voor 3 uur 's nachts in een donkere, goed genivelleerd vochtige kamer bij kamertemperatuur. Gebruik een lege pipet tip houder als de kamer, met water op de bodem. Seal resterende PEG-oplossing in de buis en houd het bij 4 ° C.
    7. Spoel de gePEGyleerde dekglaasje grondig met gedemineraliseerd water. Bewaar het in een donkere en droge plaats tot gebruik.

3. Het assembleren van een Flow Kamer

  1. Fabriceren een geperforeerd acryl houder, zoals in figuur 2. Controleer of de diameter van de buis insert is 0,762 mm, en wijst een gat is een inlaat en de andereeen uitlaat (figuur 2).
  2. Plaats dubbelzijdige plakband strips (breedte 5-6 mm) op acryl houder (figuur 2), en lijn loodrecht op een inlaat- en uitlaatopening, geen storende elk kanaal gaten. Gebruik deze tape strips als multi-channel muren om kamers te maken. Schrob de tape met behulp van een pipet tip.
  3. Plaats een gePEGyleerde dekglaasje op de bovenkant om stroom kamers te maken, met de gePEGyleerde zijde omlaag.
  4. Om te voorkomen dat elke oplossing lekken, drukt u op de top van een dekglaasje over het gebied waar de dubbelzijdige tapes worden geplaatst. Add sneldrogende epoxylijm aan de randen van de kamer bovenaan en onderaan (gele kleur in figuur 2) afsluiten.
  5. Sluit een kort stukje (2,5 cm) van de buis (buitendiameter, OD, 0,042 ") om een ​​gasdichte spuit en sluit de verbinding met epoxy lijm.
  6. Sluit een lange flexibele buis (OD: 0,03 ") om de slang verbonden met de spuit en sluit de verbinding met epoxylijm.
  7. Vul het Tubing verbonden met de spuit met DI water. Zorg ervoor dat er geen luchtbel.
  8. Plaats de buis in het gat van de stromingskamer afgedicht met epoxylijm.
  9. Plaats gele punt (200 pl tip) anderzijds hole als reservoir.

4. Sample laden in Flow Kamer

Opmerking: neutravidine kan worden vervangen door andere eiwitten zoals avidine streptavidine. Alle reacties worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij vermeld. Neem het monster oplossing in een gele tip, en installeer de tip met de oplossing op het gat van acryl houder (Figuur 2b).

  1. Stel het debiet van de inspuitpomp 50 pl / min. Load 20 ul avidine-eiwit (25 ug / ml in T50-oplossing, 10 mM Tris, NaCl 50 mM, pH 8) en houdt deze gedurende 10 min.
  2. Belasting 20 pi van gebiotinyleerd oligodeoxynucleotiden (100 micrometer op 1 × TE), en houd het voor 10 min. Als klem transferase wordt gebruikt, slaat u de laad-van oligodeoxynucleotiden.
  3. Belasting 20 pl DNA-oplossing van stap 1 in de stroom kamer bij een stroomsnelheid van 10 pl / min en houdt deze gedurende 30 min.
  4. Was de stroom kamer met 1 x TE, en de belasting 40 pi van FP-DBP 10 (~ 80 nm).
  5. Observeer DNA onder een fluorescentiemicroscoop met een continue stroom van kleuring moleculen in 1 × TE op een 60X objectief. Gebruik 488 nm solid state laser voor excitatie van FP (eGFP) -DBP. Voor volledige stuk DNA moleculen hanteren verschillende stroomsnelheden volgens de DNA lengtes gebruikt. Breng bijvoorbeeld 50 pl / min gedurende 48,5 kbp van λ DNA, en 100 pl / min gedurende 166 kbp van T4 DNA.
    1. Voor de recycling van de acryl houder, genieten gemonteerd stroom kamers in een huishouden reinigingsmiddel 12. Verwijder tapes en epoxy met een scheermesje en wrijf met de handen om ze volledig uit te schakelen. Ontstoppen gaten met injectienaalden. Houd de houders in gedemineraliseerd water tot verder gebruik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont twee verschillende DNA tethering methoden afhankelijk terminale structuur van het DNA-molecuul. Figuur 1a toont hoe de kleverige eindigende DNA moleculen worden gehybridiseerd met complementaire gebiotinyleerde oligonucleotiden, die worden geïmmobiliseerd op de met avidine beklede PEG oppervlak. Figuur 1b toont de toevoeging van gebiotinyleerd ddNTP en dNTP om de 3-hydroxylgroep van een stomp eindigende DNA door terminale transferase. Wij voegden flexibele linkers tussen DNA moleculen en biotine. Dit verhoogde de ligatie en avidine-biotine bindingsefficiëntie voldoende ruimte voor de reacties verschaffen. Figuur 1c toont het algemene schematische voorstelling van DNA tethering op met avidine gecoate oppervlak PEG.

Figuur 2 toont het samenstel van de stromingskamer met acryl houder. In vergelijking met glass / kwarts glazen dia, een op maat gemaakte acryl houder vergemakkelijkt de bereiding van de stromingskamer voor epi-fluorescentie microscopie. 12 De stromingskamer maakt direct veranderen van bufferomstandigheden voor enzymreacties, 6 en strekken DNA moleculen.

Figuur 3 toont single-aangebonden DNA en T4 ADNA gekleurd met FP-DBP. Microfluïdische shear stroomt langwerpige enkel DNA-moleculen tot volledige contour lengtes zoals 16,5 urn (48,5 kb DNA λ x 0,34 nm) en 56,4 urn (166 kb T4 DNA x 0,34 nm). We waren in staat om DNA strekken en ontspannen meerdere keren herhalen gedurende langere tijd (bijvoorbeeld half uur), omdat we gebruik gemaakt FP-DBP die geen foto-splitsing veroorzaakt.

Figuur 1
Figuur 1. Schematische weergave van DNA-tethering. a) een sticky eindigende DNA gehybridiseerd met een gebiotinyleerd oligonucleotide complementair. Triethyleenglycol is een flexibele linker tussen het oligonucleotide en biotine. B) gebiotinyleerd dNTP toegevoegd aan een stomp uiteinde van dubbelstrengs DNA door terminale transferase. Polycarbon spacer (11 atomen) een flexibele linker tussen dNTP en biotine. C) gebiotinyleerd DNA is verankerd aan een avidine eiwit dat gekoppeld is aan een gebiotinyleerd PEG covalent gebonden aan het glasoppervlak. De verhouding van gebiotinyleerd PEG normaal PEG was 0,025 (01:40). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Flow kamer. a) stromingskamer bestaande uit een acrylzuur hars houder stroken dubbelzijdig klevende banden en gePEGyleerde dekglas. Acryl houder waarvan de afmetingen 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x B x H), werd vervaardigd met lasersnijden b) Zijaanzicht van de stromingskamer. Geperforeerde gaten een inlaatopening waarop een gele tip is geïnstalleerd een buffer reservoir, en een uitlaat poort die is verbonden met een buis bestuurd door een spuit-pomp. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Fluorescent microscopische beelden van uitgerekte DNA-moleculen gekleurd met FP-DBP. a) bacteriofaag λ DNA (48,5 kbp) vastgebonden op het oppervlak na ligatie met gebiotinyleerd complementaire oligonucleotiden. b) bacteriofaag T4 DNA (166 kbp) vastgebonden op het oppervlak na het toevoegen van biotine met een terminale transferase. Aangegeven pijlen geven DNA molecules gestrekt op hun volle omtrek lengte zoals 16,5 urn voor λ DNA en 56,4 urn voor T4 DNA. Schaal bars. 10 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier presenteren we een platform voor het visualiseren van lange DNA-moleculen gebiotinyleerd voor het verankeren op oppervlakken. We hebben een aanpak voor het DNA-moleculen gebonden aan een avidine eiwit gecoate oppervlak met gebiotinyleerd runderserumalbumine. 6 In de eerdere benadering gemeld, vonden we een cruciale kwestie van DNA foto-splitsing veroorzaakt door bis-intercalatie kleurstoffen die DNA-moleculen vlekken vastgebonden op de oppervlak. Aangezien deze voortdurend opgewonden fluoroforen hebben een grote kans op een DNA fosfaatruggengraat vallen, 9 het excitatielicht kracht moest worden geminimaliseerd om foto-splitsing voorkomen.

Om deze ongemakken te overwinnen, ontwikkelden we genetisch gevormde fluorescente proteïnen met DNA bindingsvermogen (FP-DBP) kleuring voor DNA zonder foto-splitsing. 10 Wij namen betrouwbare DNA-kleuring op met avidine gecoate eiwitoppervlakken. Toch is dit platform had een ander probleem van ongewenste aggregatie van fluorescerende eiwitten op deproteïneoppervlak, resulterend in verhoogde achtergrondruis. Het is essentieel om deze willekeurige ruis voor individuele molecuul DNA analyse minimalisering contrast van DNA en eiwitten uit de achtergrond te verbeteren. Het gebruik van FP-DBP vereist daarom oppervlaktepassivering te voorkomen dat de fluorescerende eiwit van geadsorbeerd op het oppervlak. PEG kan een sterke kandidaat voor dit doel. 12 Daarom gebruikten we gebiotinyleerd PEG, die dramatisch verbeterde signaal-ruisverhouding voor beeldvorming FP-DBP gekleurde DNA-moleculen gebonden aan het oppervlak.

Er zijn een aantal kritische stappen en aantekeningen in deze methode voor hogere opbrengsten. Om een uiteinde van een DNA-molecuul op een glasoppervlak tether, is een primaire aminegroep gesilaniseerd op een dekglaasje gevolgd door biotine-PEG bekleding zoals weergegeven in figuur 1. Dit oppervlaktepassivering werkwijze is essentieel voor enkel-molecuul DNA beeldvorming omdat het aanzienlijk kan verminderen noise genereren van willekeurige adsorptie aan de wanden.Daarom worden 's nachts aminosilanization en PEGylatie sterk aanbevolen. Bovendien kan het reinigen het glaasje en het dekglas met piranha-oplossing kan verder verminderen achtergrondruis.

Een gebiotinyleerd oligonucleotide moet een fosfaatgroep op 5 'uiteinde om te koppelen aan 3-hydroxylgroep van een groot DNA-molecuul. De sequentie van de gebiotinyleerde oligonucleotide 5'-p-GGGCGGCGACCT-TEG-biotine-3 'voor λ DNA tethering. De λ DNA-oplossing reeds kort beladen na de bereiding van λ DNA-oplossing (in 1,1 beschreven), omdat λ DNA vormt vaak concatemeren met lange opslagtijd. Voor stomp eindigende DNA zoals T4 DNA kan terminale transferase gebiotinyleerd dUTPs aan beide uiteinden van DNA toe te voegen zonder specificiteit. Aldus terminale transferase reactietijd moet zorgvuldig worden aangepast ongeveer een uur, verder uitgebreid reactie kan dubbel-gemerkte DNA (dat wil zeggen dat beide uiteinden gemerkt met biotine) werd verkregen. in addvulle viraal DNA zoals λ en T4, kan elk type DNA wordt gebruikt in dit platform. Het is echter raadzaam om fragmenten van genomisch DNA gigantische gebruiken na digestie met zeldzame-cutter restrictie-enzymen zoals Notl of Swal.

Verschillende stroomsnelheden worden toegepast voor verschillende lengtes van DNA. Gewoonlijk langere DNA-moleculen vereisen hogere stroomsnelheden volledig rekken van de DNA-moleculen, de exacte contourlengte passen. Zo kunnen λ DNA rekken tot 16,5 pm, hetgeen overeenkomt met de berekende waarde van 0,34 nm x 48.502 bp.

Het is heel belangrijk om vers bereiden alle materialen, met name alle eiwitten en PEG. Bijvoorbeeld, neutravidine verliest snel zijn functie binden biotine als het wordt opgeslagen als een verdunde oplossing. Voor PEG oplossingen, pH is essentieel voor functionele groepen van een primair amine en N-hydroxysuccinimide conjugeren. Daarom wordt aanbevolen vers bereiden alle objecten tenminste wekelijks.

Visualisatie van grote DNA moleculen gebonden aan het oppervlak is een veelzijdig platform toe te passen voor verschillende toepassingen zoals genomica, epigenomics, biochemische studies voor DNA en eiwit interactie, en polymeerfysica studies. Echter, deze aanpak nog beperkt tot systemen met relatief eenvoudige en bekende DNA-moleculen modelleren zoals het virale genoom. Worden uitgebreid tot het menselijk genoom en epigenome, is het uiterst belangrijk om een ​​robuust, betrouwbaar en eenvoudig platform voor praktisch gebruik. Door het overwinnen van licht geïnduceerde DNA foto-splitsing en het voorkomen van willekeurige adsorptie van fluorescerend eiwit op het oppervlak, dit platform biedt dan ook duidelijk en contrastrijke beelden voor DNA langwerpig met shear flows.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258, (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468, (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84, (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264, (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47, (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11, (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359, (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5, (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats