Visualisering af Surface-tøjret store DNA-molekyler med et fluorescerende protein DNA-bindende peptid

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Visualisering af store DNA-molekyler forankret på glas eller perle overflader er blevet udnyttet til undersøgelse DNA-protein interaktioner, protein dynamik på DNA substrat, 1,2 og polymer fysik. 3,4 En platform for enkelt-tøjrede store DNA-molekyler har et par særskilt fordele i forhold til andre DNA immobiliseringsmetoder. 5 Første, et stort DNA-molekyle bindes på overfladen har en naturlig random-coil konformation uden en forskydningshastighed flow, hvilket er kritisk vigtigt for et DNA-bindende protein til at genkende dets bindingssted. For det andet er det meget nemt at ændre det kemiske miljø omkring DNA-molekyler for en serie af enzymatiske reaktioner i et flow kammer. Tredje, en mikrofluid forskydningsstrømning inducerer DNA molekylær strækker sig op til 100% af fuld kontur længde, som er meget vanskelig at opnå ved anvendelse af alternative DNA-forlængelse tilgange såsom overfladen immobilisering 6 og nanochannel indespærring. 7 En fuldt stretched DNA-molekyle indeholder også positionsinformation, som kan være nyttig til overvågning enzymatiske bevægelser på det genomiske kort.

Alligevel DNA tethering tilgang har en kritisk mangel i at interkalerende farvestof, såsom YOYO-1 generelt forårsager tøjrede DNA-molekyler let kan brydes ved hjælp af fluorescens excitationslys. Generelt store DNA molekyler skal farves med et fluorescerende farvestof til visualisering under et fluorescensmikroskop. Til dette formål YOYO-1 eller andre TOTO serie farvestoffer anvendes primært fordi disse farvestoffer fluorescerer, når de interkalerer dobbeltstrenget DNA. 8. Det er imidlertid velkendt, at bis-interkalerende farvestof forårsager lysinduceret DNA foto-spaltning, fordi af interkalationselektroden af fluoroforer. 9 yderligere, fluorescerende farvede DNA-molekyler forankret på overfladen er mere skrøbelige, idet shear strømme kan udøve rev kræfter på frit bevægelige DNA-molekyler. Derfor har vi udviklet FP-DBP som en ny DNA-farvning protein farvestof til afbildning store DNA-molekyler forankret på overfladen. Fordelen ved at anvende FP-DBP er, at det ikke forårsager foto-spaltning af DNA-molekylerne, som det binder. 10. Hertil kommer, at FP-DBP ikke øge kontur længde af DNA, mens bis-interkalerende farvestoffer forøge konturlængde med omkring 33%.

Denne video metode introducerer den eksperimentelle tilgang til tethering store DNA-molekyler til en PEG-biotin overflade. Figur 1 illustrerer forskellige tilgange af tethering DNA med stumpe ender og klæbrige ender. Således kan denne farvningsmetode anvendes på enhver type af DNA-molekylet. Figur 2 afbilder en skematisk repræsentation af strømningskammeret samling, der kan styres af en sprøjtepumpe at generere forskydningskræfter strømme til at strække DNA-molekyler såvel som at indlæse kemiske og enzym løsninger. Figur 3 viser mikrografier af fuldt strakte DNA-molekyler forankret på PEGylated overflade 11 og farvet med FP-DBP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA Biotinylering

  1. Biotinylering af stumpendede DNA under anvendelse terminal transferase (TdT)
    Bemærk: Brug T4 DNA (166 kbp), som er en stumpendede DNA.
    1. Tilsæt 5 pi af 2,5 mM CoCl2, 5 pi 10 x reaktionsbuffer, 0,5 pi 10 mM biotin-11-dUTP, 0,5 pi terminal transferase (10 enheder), og 0,5 pi T4 DNA (0,5 ug / pl) til reaktionsblandingen. Yde til et endeligt volumen på 50 pi ved tilsætning 38,5 pi vand.
    2. Inkuber reaktionsblandingen ved 37 ° C i 1 time.
      Bemærk: Extended Reaktionstiden kan give dobbelt-tøjret DNA, dvs., er det muligt at biotiner er tagget i begge ender.
    3. Reaktionen standses ved tilsætning af 5 pi 0,5 M EDTA, pH 8.
    4. Hold røret ved 4 ° C.
  2. Biotinylering af klæbrig ended DNA under anvendelse af DNA-ligase
    Bemærk: Brug λ DNA (48,5 kbp), som er en klæbrig-ende-DNA. <ol>
  3. Tilsæt 1 pi T4 DNA-ligase, 5 pi 10 x ligeringspuffer, 1 pi 25 ng / pl λ-fag-DNA, og der tilsættes 43 pi vand til at gøre et slutvolumen på 50 pi.
  4. Hold røret ved 4 ° C.

2. funktionaliserede overflade Derivatisering

Bemærk:. For at tether en ende af et DNA-molekyle på glasoverfladen, er en primær amingruppe silaniseret på et dækglas efterfulgt af biotin-PEG belægning som vist i figur 1 Denne PEGylering proces er vigtig for enkelt-molekyle DNA billeddannelse, fordi det kan væsentligt reducere tilfældig støj skabt af binding af uønskede molekyler på overfladen.

  1. Piranha Rengøring
    Bemærk: Piranha-løsninger reagere voldsomt med organiske materialer, derfor skal det håndteres med omhu, efter ordentlige retningslinjer for sikkerhed.
    1. Placer dækglas på en polytetrafluorethylen (PTFE) rack, og holde dem by PTFE tråd segl tape på langs, halvdelen på kanten af ​​overfladerne og halvdelen på racket. Efter indpakning, efterlader et langt stykke (~ 5 cm) tape til håndtering af stativ under rensningen.
    2. Fyld en 1 L bægerglas med 350 ml H 2 SO 4 og 150 ml H2O 2 for at gøre Piranha-opløsning i et stinkskab. Placer rack i Piranha løsning i 2 timer.
    3. Tomme Piranha-opløsning fra bægerglasset, og skyl dækglas grundigt med deioniseret vand, indtil pH-værdien af ​​vandet i bægeret når neutral. Brug pH papirstrimler.
    4. Sonikeres racks dækglas i bægerglasset indeholdende vand, i 30 min. Tøm vand fra bægeret lige før amino silanisering. Brug 75 W af lydbehandling magt til at rengøre og derivatisering glas substrater.
  2. Aminosilanization på glasoverfladen
    1. Tilsæt 2 ml N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylendiamin og 10 ml iseddike til 200 mlmethylalkohol i en ren polypropylen beholder til fremstilling af aminosilanization opløsning.
    2. Placer rensede dækglas i polypropylen beholder. Ryste dem ved 100 rpm og stuetemperatur i 30 minutter.
    3. Sonikeres bægerglasset med derivatiserede dækglas i 15 minutter ved 75 W. ryste dem ved 100 opm og stuetemperatur i mindst 30 min.
    4. Tøm opløsningen fra bægeret, og skyl dækglas omhyggeligt, en gang med methylalkohol, og to gange med ethylalkohol. Opbevar dækglas i ethylalkohol og bruger dem inden for to uger.
  3. PEGylering af dækglasset
    1. Gør 10 ml 0,1 M natriumbicarbonat (NaHCO3). Opløsningen filtreres med et 0,22 um sprøjtefilter.
    2. Opløs 2 mg biotin-PEG-succinimidylcarbonat (biotin-PEG-SC) og 80 mg af PEG-succinimidyl valerat (mPEG-SVG) i 350 pi NaHCO3. Bruge en let beskyttelse rør.
    3. Vortex røret kraftigt i 10 sek, og centrifugeres den ved 10.000 x g i 1 minut for at fjerne bobler.
    4. Skyl et objektglas med acetone, efterfulgt af skylning med ethylalkohol. Lad dias til luft tørre helt.
    5. Placer en dråbe (50 pi) af PEG-opløsning på den rene objektglas. Dæk dråben forsigtigt med en amino silaniserede dækglasset, uden at generere nogen bobler.
    6. Placer dias for 3 timer til natten over i en mørk, godt nivelleret fugtigt kammer ved stuetemperatur. Brug en tom pipettespids holder som kammeret, med vand i bunden. Seal resterende PEG løsning i røret og holde det ved 4 ° C.
    7. Skyl PEGylerede dækglas grundigt med deioniseret vand. Opbevar det i et mørkt og tørt sted indtil brug.

3. Samling af en strømningskammer

  1. Fabrikere et udstanset akryl holder, som i figur 2. Kontroller, at diameteren af slangen indsatsen er 0,762 mm, og udpege en hul er et indløb og den anden eret udløb (figur 2).
  2. Placer dobbeltsidede tape strips (bredde 5-6 mm) på en akryl holder (figur 2), der tilpasser sig vinkelret på et indløb og udløb hul, ikke forstyrrende helst kanal huller. Brug disse tape strimler som multi-kanalvæggene at gøre kamre. Skrub båndet ved hjælp af en pipette spids.
  3. Placer en PEGyleret dækglas på toppen at gøre flow kamre, med PEGylerede nedad.
  4. At forhindre opløsning i at lække, tryk på toppen af ​​et dækglas over området, hvor dobbeltsidede bånd er placeret. Tilføj hurtigttørrende epoxy lim til at lukke kanterne af kammeret foroven og forneden (gul farve i figur 2).
  5. Tilslut et kort stykke (2,5 cm) slange (ydre diameter, OD, 0,042 ") til en gastæt sprøjte og forsegle samlingen med epoxy lim.
  6. Tilslut en lang fleksibel slange (OD: 0,03 ") til slangen forbundet til sprøjten, og forsegler samlingen med epoxylim.
  7. Fyld Tubing knyttet til sprøjten med DI-vand. Kontrollér, at der ikke er luft boble.
  8. Sæt slangen i hullet i strømningskammeret forseglet med epoxylim.
  9. Placer en gul spids (200 pi spids) på det andet hul som et reservoir.

4. Prøve Loading ind Flow Afdeling

Bemærk: Neutravidin kan erstattes med andre avidin proteiner, såsom streptavidin. Alle reaktioner kan udføres ved stuetemperatur, medmindre det er nævnt. Tag prøveopløsningen i en gul spids, og installere spidsen med opløsningen på hullet af acryl- holder (figur 2b).

  1. Indstil strømningshastigheden af ​​sprøjtepumpen ved 50 pl / min. Load 20 pi avidinproteinet (25 ug / ml i T50 løsning, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), og holde det i 10 min.
  2. Load 20 pi biotinylerede oligodeoxynucleotider (100 um i 1 × TE), og holde det i 10 min. Hvis der anvendes terminal transferase, springe lastningaf oligodeoxynucleotider.
  3. Load 20 pi DNA-opløsning fra trin 1 ind i strømningskammeret ved en strømningshastighed på 10 ul / min, og holde det i 30 minutter.
  4. Vask flow kammer med 1 × TE, og indlæse 40 pi FP-DBP 10 (~ 80 nM).
  5. Observere DNA under et fluorescerende mikroskop med kontinuerlig strøm af farvning molekyler i 1 × TE på en 60X objektiv. Brug 488 nm solid state laser til excitation af FP (eGFP) -DBP. For fuld strækning af DNA-molekyler, anvende forskellige strømningshastigheder efter DNA-længder, der anvendes. For eksempel anvendes 50 pl / min i 48,5 kbp af λ-DNA og 100 pl / min i 166 kbp af T4 DNA.
    1. For genanvendelse af indehaveren af akryl, sættetid samlet flow kamre i en husstand rengøringsmiddel 12. Fjern tape og epoxy med et barberblad og gnide med hænderne til helt at tage dem af. Unclog huller med sprøjtekanyler. Hold indehavere i demineraliseret vand indtil videre anvendelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser to forskellige DNA tøjring metoder afhængigt terminale strukturer af DNA-molekylet. Figur 1a illustrerer, hvordan de klæbrige ender DNA-molekyler hybridiseres med komplementære biotinylerede oligonukleotider, der er immobiliseret på avidin-belagte PEG overflade. Figur 1B viser tilsætningen af biotinyleret ddNTP eller dNTP til 3'hydroxylgruppen i en stumpendede DNA ved terminal transferase. Vi har tilføjet fleksible linkere mellem DNA-molekyler og biotin. Dette øgede ligering og avidin-biotin binding effektivitet til at tilvejebringe tilstrækkelig plads til reaktionerne. Figur 1c viser den overordnede skematisk repræsentation for DNA tethering på avidin-coatede PEG overflade.

Figur 2 viser samlingen af strømningskammeret sammen med en akryl holder. Sammenlignet med glass / kvarts slide briller, et skræddersyet akryl indehaveren forenkler fremstillingen af strømningskammeret for epi-fluorescensmikroskopi. 12 strømningskammeret muliggør øjeblikkelig ændring af pufferbetingelser for enzymreaktioner, 6 og strækker DNA-molekyler.

Figur 3 viser single-tøjret DNA og T4 XDNA farvet med FP-DBP. Mikrofluid shear strømmer aflange enkelte DNA-molekyler op til fuld kontur længder såsom 16,5 um (48,5 kb λ DNA x 0,34 nm) og 56,4 um (166 kb T4 DNA x 0,34 nm). Vi var i stand til at gentage DNA strækning og afslapning flere gange i løbet af en længere periode (f.eks halv time), eftersom vi udnyttet FP-DBP, der ikke forårsager foto-spaltning.

figur 1
Figur 1. Skematisk illustration af DNA tethering. a) En sticky ended DNA hybridiseres med en biotinyleret komplementært oligonucleotid. Triethylenglycol er en fleksibel linker mellem oligonukleotidet og biotin. B) Biotinyleret dNTP tilsættes til en stump ende af dobbeltstrenget DNA ved terminal transferase. Polycarbon afstandsstykke (11-atomer) er en fleksibel linker mellem dNTP og biotin. C) Biotinyleret DNA er forankret til et avidin protein, som er koblet til et biotinyleret PEG covalent bundet til glasoverfladen. Forholdet mellem biotinyleret PEG til normal PEG var 0,025 (01:40). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Flow kammer. a) Flow kammer bestående af en acrylsyre harpiks holder, strimler af dobbeltsidet tape og en PEGyleret dækglas. Akryl indehaver af dimensioner 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x B x H) Den blev fremstillet med laserskæring b) Ved siden udsigt på Flow kammer:. Udstansede huller er en indgangsport, hvor en gul spids er installeret til en buffer reservoir, og en udløbsport, som er forbundet til en slange styres af en sprøjte-pumpe. klik her for et større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3. Fluorescerende mikroskopiske billeder af strakte DNA-molekyler farvet med FP-DBP. a) bakteriofag λ DNA (48,5 kbp) bindes på overfladen efter ligering med biotinylerede komplementære oligonucleotider. b) bakteriofag T4 DNA (166 kbp) bindes på overfladen efter tilsætning biotin med terminal transferase. Indiceret pile viser DNA molecules strækkes op til deres fulde kontur længder såsom 16,5 um for λ DNA og 56,4 um for T4-DNA. Scale barer:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterer vi en platform til at visualisere lange DNA-molekyler biotinyleret til forankring på overflader. Vi har rapporteret en fremgangsmåde til DNA-molekyler forankret på et avidin protein overflade med biotinyleret bovint serumalbumin. 6 I den tidligere fremgangsmåde, fandt vi et afgørende spørgsmål om DNA foto-spaltning forårsaget af bis-interkalationstoppe farvestoffer pletten DNA-molekyler bindes på overflade. Da disse løbende exciterede fluoroforer har en høj sandsynlighed for at angribe en DNA phosphatskelet, 9 excitationslyset magt måtte minimeres for at undgå foto-spaltning.

For at overvinde denne ulempe udviklede vi gensplejsede fluorescerende proteiner med DNA-bindingsevne (FP-DBP) til farvning DNA uden foto-spaltning. 10 Vi observerede pålidelig DNA farvning på avidinovertrukne proteinoverflader. Ikke desto mindre denne platform havde en anden udgave af uønsket aggregering af fluorescerende proteiner påprotein overflade, hvilket resulterer i øget baggrundsstøj. Det er væsentligt at minimere denne tilfældig støj for enkelt-molekyle DNA-analyse at forbedre kontrasten af ​​DNA og proteiner fra baggrunden. Anvendelsen af ​​FP-DBP kræver derfor overfladepassivering at forhindre det fluorescerende protein i at blive adsorberet på overfladen. PEG kan være en stærk kandidat til dette formål. 12. Derfor har vi brugt biotinyleret-PEG, som dramatisk forbedret signal-til-støj-forholdet for billeddannelse FP-DBP farvede DNA-molekyler forankret på overfladen.

Der er flere kritiske trin og bemærker i denne metode til højere renter. For at tether en ende af et DNA-molekyle på en glasoverflade, er en primær amingruppe silaniseret på et dækglas efterfulgt af biotin-PEG belægning som vist i figur 1. Denne overflade passivering proces er kritisk for enkelt-molekyle DNA billeddannelse, fordi det kan væsentligt reducere støj-generering tilfældig adsorption på overfladerne.Derfor er natten aminosilanization og PEGylering anbefales kraftigt. Desuden rengøring objektglasset samt dækglasset med Piranha-opløsning kan yderligere reducere baggrundsstøj.

Et biotinyleret oligonucleotid skal have en phosphatgruppe ved 5'-enden for at knytte den til 3'hydroxylgruppen i et stort DNA-molekyle. Sekvensen af ​​biotinyleret oligonukleotid er 5'-p-GGGCGGCGACCT-TEG-Biotin-3 'for λ DNA tethering. Den λ DNA-opløsningen skal lastes kort efter fremstillingen af ​​λ DNA-opløsning (beskrevet i 1.1), fordi λ DNA ofte danner concatemerer med langtidsopbevaring. For stumpe DNA, såsom T4 DNA, kan terminal transferase tilføje biotinylerede dUTPs i begge ender af DNA uden specificitet. , Terminal transferase reaktionstid skal således justeres omhyggeligt omkring en time, ellers forlænget reaktion kan give dobbelt-mærket DNA (dvs. at begge ender mærket med biotin). I addition til viralt DNA, såsom λ og T4, kan alle typer af DNA anvendes i denne platform. Det anbefales dog, at bruge fragmenter fra gigantiske genomisk DNA efter fordøjelse af sjældne cutter restriktionsenzymer såsom Swal eller NotI

Forskellige flow satser anvendes til forskellige længder af DNA. Normalt længere DNA-molekyler kræver hurtigere strømningshastigheder til fuldt ud at strække DNA-molekylerne, der passer nøjagtigt kontur længde. For eksempel kan λ DNA strække op til 16,5 um, hvilket svarer til den beregnede værdi på 0,34 nm x 48,502 bp.

Det er ganske vigtigt at frisk forberede alle materialer, herunder alle proteiner og pinde. F.eks Neutravidin let mister sin funktion med bindende biotiner hvis det opbevares som en fortyndet opløsning. For PEG opløsninger, pH er vigtig at konjugere funktionelle grupper i en primær amin og N-hydroxysuccinimid. Derfor anbefales det at frisk forberede alle materialer mindst hver uge.

Visualisering af store DNA-molekyler forankret på overfladen er en alsidig platform, der skal anvendes til en lang række applikationer som genomik, Epigenomics, biokemiske undersøgelser for DNA og protein interaktion, og polymer fysik undersøgelser. Imidlertid er denne fremgangsmåde i øjeblikket kun begrænset til at modellere systemer, der anvender relativt enkle og velkendte DNA-molekyler, såsom det virale genom. For at blive udvidet til det humane genom og epigenome, er det kritisk vigtigt at etablere en robust, pålidelig og enkel platform til praktisk brug. Ved at overvinde lys-induceret DNA foto-spaltning og forhindre tilfældig adsorption af fluorescerende protein på overfladen, denne platform giver derfor klare og høj kontrast billeder for DNA aflange med shear strømme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258, (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468, (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84, (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264, (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47, (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11, (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359, (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5, (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats