Visualisering av Surface-tjudrade stora DNA-molekyler med ett fluorescerande protein-DNA-bindande peptid

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Visualisering av stora DNA-molekyler bundna på glas eller pärla ytor har använts för att undersöka DNA-protein interaktioner, proteindynamik på DNA-substratet, 1,2 och polymerfysik. 3,4 En plattform för enkel-bundna stora DNA-molekyler har ett par distinkta fördelar jämfört med andra DNA-immobiliseringsmetoder. 5 för det första, en stor DNA-molekyl tjudrad på ytan har en naturlig random-coil konforma utan skjuvning flöde, vilket är av avgörande betydelse för ett DNA-bindande protein för att känna igen dess bindningsställe. Det andra är det mycket lätt att ändra den kemiska miljön runt DNA-molekyler för en serie av enzymatiska reaktioner i en flödeskammare. För det tredje, framkallar en mikroflödes skjuvflöde DNA molekyl sträcker sig upp till 100% av hela konturlängden, vilket är mycket svårt att uppnå med hjälp av alternativa DNA förlängning närmar såsom ytan immobilisering 6 och nanochannel förlossning. 7 En fullt stretched DNA-molekyl ger också lägesinformation som kan vara användbar för att övervaka enzymatiska rörelser på den genomiska kartan.

Icke desto mindre har de DNA-sammanlänkning tillvägagångssätt en kritisk brist i att den interkalerande färgämne, såsom YOYO-1 i allmänhet orsakar tjudrade DNA-molekyler att lätt brytas genom fluorescens excitationsljus. I allmänhet, stora DNA-molekyler måste färgas med ett fluorescerande färgämne för visualisering under ett fluorescerande mikroskop. För detta ändamål, YOYO-1 eller andra TOTO serie färgämnen används främst eftersom dessa färgämnen fluorescerar endast när de intercalate dubbelsträngat DNA. 8 Det är emellertid väl känt att bis-interkalerande färg orsakar Ijusinducerad DNA foto klyvning eftersom av interkalering av fluoroforer. 9 Vidare fluorescerande färgade DNA-molekyler bundna på ytan är bräckligare eftersom skjuvning flöden kan utöva bryta krafter på fritt rörliga DNA-molekyler. Därför har vi utvecklat FP-DBP som en roman DNA-färgning protein färgämne för avbildning av stora DNA-molekyler bundna på ytan. Fördelen med att använda FP-DBP är att den inte orsakar foto klyvning av DNA-molekyler till vilka den binder. 10 Dessutom har FP-DBP inte öka den konturlängd av DNA, medan bis-interkalerande färgämnen öka konturlängden med cirka 33%.

Denna video metod introducerar experimentell metod för att tjudra stora DNA-molekyler till en PEG-biotin yta. Figur 1 visar olika metoder för uppbundna DNA med trubbiga ändar och klibbiga ändar. Sålunda kan denna färgningsmetod tillämpas på vilken som helst typ av DNA-molekyl. Figur 2 visar en schematisk representation av flödet kammarenheten som kan styras av en sprutpump för att generera skjuvning flöden för att sträcka DNA-molekyler såväl som att ladda kemiska och enzym lösningar. Figur 3 visar mikrofotografier av helt sträckta DNA-molekyler bundna på PEGylated yta 11 och färgades med FP-DBP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA Biotinylering

  1. Biotinylering av trubbiga ändar DNA med användning av terminalt transferas (TdT)
    Notera: Använd T4 DNA (166 kbp), som är en trubbig ände DNA.
    1. Tillsätt 5 | il av 2,5 mM CoCl2, 5 | il av 10 x reaktionsbuffert, 0,5 pl av 10 mM biotin-11-dUTP, 0,5 pl av terminalt transferas (10 enheter), och 0,5 | il T4-DNA (0,5 | ig / | il) till reaktionsblandningen. Göra till en slutlig volym av 50 | il genom tillsats av 38,5 fil vatten.
    2. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C under 1 timme.
      Notera: omfattar reaktionstiden kan ge dubbel bunden DNA, det vill säga, är det möjligt att biotiner är taggade i båda ändar.
    3. Stoppa reaktionen genom tillsats av 5 pl av 0,5 M EDTA, pH 8.
    4. Håll röret vid 4 ° C.
  2. Biotinylering av klibbiga ändar DNA med användning av DNA-ligas
    Obs! Använd λ DNA (48,5 kbp), som är en klibbig-end-DNA. <ol>
  3. Lägg 1 fil T4 DNA-ligas, 5 | il av 10 x ligeringsbuffert, 1 ^ il av 25 ng / | j, l λ-fag-DNA, och tillsätt 43 | il vatten till en slutvolym av 50 | il.
  4. Håll röret vid 4 ° C.

2. funktionaliserade ytan Derivatisering

Notera:. För att tjudra en ände av en DNA-molekyl på glasytan, är en primär amingrupp silaniseras på ett täckglas följt av biotin-PEG beläggning såsom visas i figur 1 är viktig för enda molekyl DNA imaging Denna PEGylering process eftersom det kan avsevärt minska slumpmässigt brus som skapas av fästande av oönskade molekyler på ytan.

  1. piranha Rengöring
    Obs: Piranha lösningar reagerar häftigt med organiska material, därför bör hanteras med försiktighet, efter ordentliga säkerhetsanvisningar.
    1. Placera täck på en polytetrafluoretylen (PTFE) rack, och hålla dem by PTFE gängtejp på längden, hälften på kanten av ytorna och hälften på hyllan. Efter omslag, lämna en lång bit (~ 5 cm) av tejp för att hantera rack under rengöringsproceduren.
    2. Fyll en 1 L glasbägare med 350 ml H 2 SO 4 och 150 ml H2O 2 för att göra Piranha-lösning i ett dragskåp. Plats i racket i Piranha-lösning under 2 h.
    3. Tom Piranha-lösning från bägaren, och sköljtäck noggrant med avjoniserat vatten till dess att pH-värdet för vattnet i bägaren når neutralt. Använd pH pappersremsor.
    4. Sonikera de ställningar av täckglas i bägaren innehållande vatten, i 30 min. Töm vatten från bägaren strax före amino silanisering. Använd 75 W ultraljuds makt att rengöra och derivatisera glassubstrat.
  2. Aminosilanization på Glass Surface
    1. Tillsätt 2 ml av N - [3- (trimetoxisilyl) propyl] etylendiamin och 10 ml isättika till 200 mlmetylalkohol i en ren polypropen behållare för beredning av aminosilanization lösning.
    2. Placera rengjorda täck i polypropylen behållaren. Skakar dem vid 100 rpm och rumstemperatur under 30 min.
    3. Sonikera bägaren med derivatiserade täckglas under 15 min vid 75 W. Skaka dem vid 100 rpm och vid rumstemperatur under åtminstone 30 min.
    4. Tömma lösningen från bägaren, och skölj täckglasen försiktigt, en gång med metylalkohol, och två gånger med etylalkohol. Förvara täck i etylalkohol och använda dem inom två veckor.
  3. PEGylering av täckglas
    1. Göra 10 ml av 0,1 M natriumbikarbonat (NaHCO 3). Filtrera lösningen med en 0,22-um sprutfilter.
    2. Lös upp 2 mg av biotin-PEG-succinimidyl-karbonat (biotin-PEG-SC) och 80 mg av PEG-succinimidyl valerat (mPEG-SVG) i 350 pl av NaHCOs 3. Använd en lätt skyddsrör.
    3. Vortexa röret kraftigt under en0 sek, och centrifugera den vid 10000 x g under 1 min för att avlägsna bubblor.
    4. Skölj en glasskiva med aceton, följt av sköljning med etylalkohol. Låt bilden lufttorka helt.
    5. Placera en droppe (50 ^ il) av PEG-lösning på rent objektglas. Täck droppen försiktigt med en amino silaniserad täckglas, utan att generera några bubblor.
    6. Placera objektglasen för tre timmar till över natten i ett mörkt, väl planat fuktig kammare vid rumstemperatur. Använder en tom pipettspets hållaren som kammaren, med vatten vid botten. Täta resterande PEG-lösning i röret och hålla den vid 4 ° C.
    7. Skölj PEGylerade täck noggrant med avjoniserat vatten. Förvara den på en mörk och torr plats fram till användning.

3. Hopsättning en flödeskammare

  1. Fabricera en stansad akryl hållare, som i figur 2. Se till att diametern på slangen insatsen är 0,762 mm, och utse en hålet är ett inlopp och den andra ärett utlopp (Figur 2).
  2. Placera dubbelsidiga klibbiga tejpremsor (bredd 6/5 mm) på en akrylhållare (Figur 2), anpassa sig vinkelrätt mot ett inlopp och utloppshålet, inte störande någon kanal hål. Använd dessa tejpremsor som flerkanaliga väggar för att göra kammare. Skrubba bandet med hjälp av en pipett spets.
  3. Placera en PEGylerat täck på toppen för att göra flödeskammare, med PEGylerat sidan nedåt.
  4. För att förhindra att någon lösning läcker genom att trycka på toppen av en täck över området där dubbelsidiga band placeras. Lägga snabbtork epoxilim för att stänga kanterna av kammaren upptill och nedtill (gul färg i fig 2).
  5. Anslut en kort bit (2,5 cm) av rör (ytterdiameter, OD, 0,042 ") till en gastät spruta och täta skarven med epoxilim.
  6. Ansluta en lång flexibel slang (OD: 0,03 ") till rörledningen kopplad till sprutan och täta skarven med epoxilim.
  7. Fylla tubing kopplad till sprutan med DI-vatten. Se till att det inte finns någon luftbubbla.
  8. För in slangen i hålet av flödet kammaren förseglad med epoxilim.
  9. Placera en gul spets (200 | j, l spets) på det andra hålet som en reservoar.

4. Prov laddas in Flow avdelningen

Notera: neutravidin kan ersättas med andra avidin proteiner såsom streptavidin. Samtliga reaktioner kan utföras vid rumstemperatur, såvida det inte nämns. Ta provlösning i en gul spets, och installera spetsen med lösningen på hålet i akryl hållare (figur 2b).

  1. Ställa in flödeshastigheten för sprutpump med 50 | il / min. Belastning 20 pl avidin protein (25 ug / ml i T50 lösning, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), och hålla den under 10 minuter.
  2. Belastning 20 pl biotinylerade oligodeoxinukleotider (100 nm i 1 x TE), och hålla den under 10 minuter. Om terminal transferas används, hoppa lastningav oligodeoxinukleotider.
  3. Belastning 20 pl av DNA-lösningen från steg 1 in i flödeskammaren med en flödeshastighet av 10 | j, l / min, och hålla det i 30 min.
  4. Tvätta flödet kammaren med 1 x TE och ladda 40 pl FP-DBP 10 (~ 80 nM).
  5. Observera DNA under ett fluorescerande mikroskop med kontinuerligt flöde av färgning molekyler i en × TE på en 60X objektiv. Använd 488 nm halvledarlaser för excitation av FP (EGFP) -DBP. För fullständig sträcka av DNA-molekyler, tillämpa olika flödeshastigheter enligt DNA-längder används. Till exempel gäller 50 l / min för 48,5 kbp av λ DNA, och 100 ul / min för 166 kb T4 DNA.
    1. För återvinning av akrylhållaren, blöt monterade flödeskammare i ett hushåll rengöringsmedel 12. Ta bort tejp och epoxi med ett rakblad och gnugga med händerna för att helt ta bort dem. Rensa hål med kanyler. Håll innehavarna i avjoniserat vatten tills vidare användning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar två olika DNA tjudra metoder beroende på terminala strukturer av DNA-molekylen. Figur 1a illustrerar hur de klibbiga ändar DNA-molekylerna hybridiseras med komplementära biotinylerade oligonukleotider, som är immobiliserade på avidinbelagda PEG yta. Figur 1b visar tillsatsen av biotinylerad ddNTP eller dNTP till 3'-hydroxylgruppen i en trubbig ände-DNA genom terminalt transferas. Vi har lagt flexibla linkers mellan DNA-molekyler och biotin. Denna ökade ligeringen och avidin-biotin bindningseffektiviteten för att ge tillräckligt utrymme för reaktionerna. Figur 1c visar den övergripande schematisk representation för DNA tethering på avidinbelagda PEG yta.

Figur 2 visar hopsättningen av flödeskammare tillsammans med en akrylhållare. Jämfört med glass / kvarts glid glasögon, förenklar en skräddarsydd akryl innehavare framställningen av flödet kammaren för epi-fluorescensmikroskopi. 12 flödet kammaren möjliggör omedelbar byte av buffertbetingelser för enzymreaktioner, 6 och sträcker DNA-molekyler.

Figur 3 visar en enda bundna DNA och T4 XDNA färgades med FP-DBP. Mikroflödes skjuvning flöden avlånga enstaka DNA-molekyler upp till full konturlängder såsom 16,5 pm (48,5 kb λ DNA x 0,34 nm) och 56,4 pm (166 kb T4 DNA x 0,34 nm). Vi kunde upprepa DNA stretching och avslappning flera gånger under en längre period (t.ex. halvtimme), eftersom vi utnyttjade FP-DBP som inte orsakar foto klyvning.

Figur 1
Figur 1. Schematisk illustration av DNA uppbindning. a) A: sticky ended DNA hybridiseras med en biotinylerad komplementär oligonukleotid. Trietylenglykol är en flexibel linker mellan oligonukleotiden och biotin. B) Biotinylerad dNTP läggs till en trubbig ände av dubbelsträngad DNA, genom terminalt transferas. Polycarbon spacer (11-atomer) är en flexibel linker mellan dNTP och biotin. C) biotinylerat DNA är förankrad till en avidin-protein, som är kopplad till en biotinylerad PEG kovalent bunden till glasytan. Förhållandet mellan biotinylerat PEG till normal PEG var 0,025 (01:40). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Flödes kammare. a) Flödes kammare bestående av en akrylsyrahartshållare, remsor av dubbelsidiga tejper och en PEGylerad täcka slip. Akryl Innehavaren av dimensionerna 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x B x H), framställdes med laserskärning b) från sidan flödet kammaren. Stansade hål är en inloppsöppning som en gul spets är installerad för en buffertreservoar, och en utloppsöppning som är ansluten till en slang som styrs av en sprutpump. klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Fluorescerande mikroskopiska bilder av sträckta DNA-molekyler färgade med FP-DBP. a) Bakteriofag λ DNA (48,5 kbp) bundna på ytan efter ligering med biotinylerade komplementära oligonukleotider. b) bakteriofag T4 DNA (166 kb) bundna på ytan efter att ha lagt biotin med terminal transferas. Indikerade pilarna visar DNA molecules sträckas upp till sin fulla konturlängder såsom 16,5 um för λ DNA och 56,4 um för T4 DNA. Skala barer. 10 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi en plattform för att visualisera långa DNA-molekyler biotinylerade för förankring på ytor. Vi har rapporterat en metod för DNA-molekyler bundna på en avidin protein belagd yta med biotinylerad bovinserumalbumin. 6 I den tidigare strategin, fann vi en avgörande fråga om DNA foto klyvning orsakad av bis-interkala färgämnen som färgas DNA-molekyler bundna på yta. Eftersom dessa ständigt exciterade fluoroforer har en hög sannolikhet för att attackera en DNA-fosfatryggraden, 9 excitationsljuset strömmen måste minimeras för att undvika bild-klyvning.

För att övervinna denna olägenhet har vi utvecklat genetiskt manipulerade fluorescerande proteiner med DNA-bindningsförmåga (FP-DBP) för färgning av DNA utan foto-klyvning. 10 Vi observerade tillförlitlig DNA färgning på avidinbelagda proteinytor. Trots denna plattform hade en annan fråga om oönskad aggregation av fluorescerande proteiner påproteinytan, vilket resulterar i ökad bakgrundsbrus. Det är viktigt att minimera denna slumpmässigt brus för enda molekyl DNA-analys för att förbättra kontrasten av DNA och proteiner från bakgrunden. Användningen av FP-DBP kräver därför ytpassivering för att förhindra den fluorescerande proteinet från att adsorberas på ytan. PEG kan vara en kraftfull kandidat för detta ändamål. 12 Därför, använde vi biotinylerad-PEG, vilket dramatiskt förbättrad signal-till-brusförhållandet för avbildning FP-DBP färgade DNA-molekyler bundna på ytan.

Det finns flera viktiga steg och anteckningar i denna metod för högre avkastning. I syfte att tjudra en ände av en DNA-molekyl på en glasyta, är en primär amingrupp silaniseras på ett täckglas följt av biotin-PEG beläggning såsom visas i figur 1. Denna ytpassivering process är kritisk för enda molekyl DNA avbildning eftersom den kan avsevärt minska buller genereslump adsorption på ytorna.Därför natten aminosilanization och PEGylering rekommenderas starkt. Dessutom kan en rengöring glasskiva samt täckglaset med piraya lösning kan ytterligare reducera bakgrundsljud.

En biotinylerad oligonukleotid måste ha en fosfatgrupp vid 5'-änden för att koppla den till 3 'hydroxylgruppen i en stor DNA-molekyl. Sekvensen av biotinylerade oligonukleotiden är 5'-p-GGGCGGCGACCT-TEG-biotin-3 'för λ DNA uppbindning. Den λ DNA-lösningen måste laddas strax efter framställningen av λ DNA-lösning (beskrivet i 1.1), eftersom λ DNA bildar ofta konkatemerer med långtidslagring. För trubbiga ändar DNA, såsom T4-DNA, kan terminalt transferas lägga biotinylerade dUTPs i båda ändar av DNA utan någon specificitet. Sålunda har terminalt transferas reaktionstiden justeras noggrant runt en timme, annars förlängas reaktion kan ge dubbel-märkt DNA (det vill säga, är båda ändarna märkt med biotin). i tilläggition till viralt DNA såsom λ och T4, kan alla typer av DNA utnyttjas i denna plattform. Det är dock rekommenderas att använda fragment från gigantisk iskt DNA efter uppslutning av sällsynta skärrestriktionsenzymer som Swal eller Notl.

Olika flödeshastigheter tillämpas för olika längder av DNA. Vanligtvis längre DNA-molekyler kräver snabbare flödeshastigheter för att helt sträcka ut DNA-molekylerna, för att matcha den exakta konturlängden. Till exempel, kan λ DNA sträcka upp till 16,5 um, vilket motsvarar det beräknade värdet av 0,34 nm x 48.502 bp.

Det är ganska viktigt att nyligen förbereda alla material, i synnerhet alla proteiner och PEG. Till exempel, neutravidin förlorar lätt sin funktion att binda biotiner om den förvaras som en utspädd lösning. För PEG lösningar är pH kritiskt att konjugera funktionella grupper av en primär amin och N-hydroxisuccinimid. Därför rekommenderas det att nyligen förbereda alla material åtminstone varje vecka.

Visualisering av stora DNA-molekyler bundna på ytan är en mångsidig plattform som skall tillämpas för en mängd olika applikationer såsom genomik, epigenomik, biokemiska studier för DNA och proteininteraktioner, och polymerfysikstudier. Emellertid är detta tillvägagångssätt för närvarande begränsad endast att modellera system som använder relativt enkla och välkända DNA-molekyler, såsom det virala genomet. Utvidgas till att omfatta det mänskliga genomet och epigenomet, är det ytterst viktigt att upprätta en robust, pålitlig och enkel plattform för praktisk användning. Genom att övervinna Ijusinducerad DNA foto klyvning och förhindra slumpmässig adsorption av fluorescerande protein på ytan, ger denna plattform därför tydliga och bilder med hög kontrast för DNA långsträckt med skjuvning flöden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258, (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468, (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84, (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264, (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47, (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11, (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359, (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5, (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats