Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University
Published 6/23/2016
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Biology

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Lee, S., Jo, K. Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide. J. Vis. Exp. (112), e54141, doi:10.3791/54141 (2016).

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Abstract

Introduction

Visualisierung großer DNA - Moleküle gebunden auf Glas oder Perlenoberflächen wurde zur Untersuchung von DNA-Protein - Wechselwirkungen, Proteindynamik auf DNA - Substrat, 1,2 und Polymerphysik verwendet. 3,4 Eine Plattform für Single-tethered großen DNA - Molekülen hat ein paar deutliche Vorteile gegenüber anderen DNA Immobilisierungsverfahren. 5 Erstens hat ein großes DNA - Molekül auf der Oberfläche gebunden eine natürliche ungeordneten Konformation ohne Scherströmung, die für ein DNA-bindendes Protein von entscheidender Bedeutung ist seine Bindungsstelle zu erkennen. Zweitens ist es sehr einfach, die chemische Umgebung um DNA-Moleküle für eine Reihe von enzymatischen Reaktionen in einem Strömungsraum zu ändern. Drittens ist ein Mikrofluidik - Scherströmung induziert DNA - Molekular zu 100% der vollen Konturlänge Dehnung auf, was sehr schwierig ist , die alternative DNA - Verlängerung wie Oberflächenimmobilisierung 6 und Nanokanal Haft nähert sich zu erreichen. 7 A vollständig stretched DNA-Molekül stellt auch eine Positionsinformation, die zur Überwachung der enzymatischen Bewegungen auf der genomischen Karte nützlich sein kann.

Dennoch hat die DNA Anbinden Ansatz eine kritische Nachteil dadurch, dass der interkalierende Farbstoff wie YOYO-1 in der Regel verursacht tethered DNA-Moleküle leicht durch Fluoreszenzanregungslicht durchbrochen werden. Im Allgemeinen große DNA-Moleküle mit einem fluoreszierenden Farbstoff zur Sichtbarmachung unter einem Fluoreszenzmikroskop gefärbt werden. Hierzu YOYO-1 oder andere TOTO Reihe Farbstoffe sind in erster Linie verwendet , da diese Farbstoffe nur fluoreszieren , wenn sie doppelsträngige DNA interkalieren. 8 Es ist jedoch bekannt , dass bis-interkalierenden Farbstoffes verursacht lichtinduzierten DNA Photospaltungs weil fluoreszierend gefärbte DNA - Moleküle der Interkalation von Fluorophore. 9 Ferner ist auf der Oberfläche gebunden sind empfindlicher , da Scherströmungen ausüben können Kräfte brechen auf frei DNA - Moleküle bewegen. Daher entwickelten wir FP-DBP als neuartige DNA-Anfärbung Proteinfarbstoff zum Abbilden großer DNA-Moleküle an der Oberfläche gebunden. Der Vorteil der Verwendung von FP-DBP ist , dass es nicht photo Spaltung der DNA - Moleküle bindet , an die verursacht. 10 Außerdem FP-DBP nicht die Konturlänge von DNA nicht erhöht, während bis-interkalierende Farbstoffe , die Konturlänge erhöhen um etwa 33%.

Dieses Video - Methode stellt die experimentellen Ansatz zu einer PEG-Biotin - Oberfläche großer DNA - Moleküle zu binden. Abbildung 1 unterschiedliche Ansätze von Anbindehaltung DNA mit stumpfen Enden und klebrigen Enden zeigt. Somit kann diese Färbemethode für jede Art von DNA - Moleküls angewandt werden. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Strömungskammeranordnung , die durch eine Spritzenpumpe gesteuert werden kann , um Scherströmungen erzeugen , um DNA - Moleküle als auch zu laden , Chemikalien- und Enzym strecken Lösungen. 3 zeigt Mikroaufnahmen von vollständig gestreckten DNA - Moleküle auf der PEGylat gefesselteed Fläche 11 und gefärbt mit FP-DBP.

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Protocol

1. DNA Biotinylierung

  1. Biotinylierung von blunt ended DNA unter Verwendung von Terminal - Transferase (TdT)
    Hinweis: Die Verwendung von T4-DNA (166 kbp), das eine stumpfe ended DNA ist.
    1. Zugabe von 5 & mgr; l von 2,5 mM CoCl 2, 5 & mgr; l 10 × Reaktionspuffer, 0,5 ul 10 mM Biotin-11-dUTP, 0,5 ul terminaler Transferase (10 Einheiten) und 0,5 ul T4 - DNA (0,5 ug / ul) zu dem Reaktionsgemisch. Machen zu einem Endvolumen von 50 & mgr; l von 38,5 & mgr; l Wasser zugegeben.
    2. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 1 Stunde.
      Hinweis: Erweiterte Reaktionszeit kann Ausbeute doppelt angebundenen DNA, dh es ist möglich , dass Biotinen an beiden Enden markiert sind.
    3. Die Reaktion durch Zugabe von 5 ul 0,5 M EDTA, pH 8.
    4. Halten Sie das Röhrchen bei 4 ° C.
  2. Biotinylierung von klebrigen Enden DNA unter Verwendung von DNA - Ligase
    Hinweis: Verwenden Sie λ-DNA (48,5 kbp), das eine klebrige-End-DNA ist. <ol>
  3. 1 ul T4-DNA-Ligase, 5 ul 10 × Ligationspuffer, 1 ul 25 ng / & mgr; l λ-Phagen-DNA, und fügen 43 ul Wasser auf ein Endvolumen von 50 & mgr; l zu machen.
  4. Halten Sie das Röhrchen bei 4 ° C.

2. Funktionalisierte Oberflächenderivatisierung

. Hinweis: Um ein Ende eines DNA - Moleküls auf der Glasoberfläche anbinden, eine primäre Amingruppe auf einem Deckglas silanisiert gefolgt von Biotin-PEG - Beschichtung , wie in Figur 1 gezeigt Dieser PEGylierung Prozess ist wichtig für Einzelmolekül - DNA - Bildgebung , da es kann erheblich zufälliges Rauschen durch Anlagerung von unerwünschten Molekülen auf der Oberfläche erzeugt verringern.

  1. Piranha Reinigung
    Hinweis: Piranha-Lösungen reagieren heftig mit organischen Materialien, daher sollte es mit Vorsicht behandelt werden, die nach einer ordnungsgemäßen Sicherheitsrichtlinien.
    1. Platz Deckgläser auf einem Polytetrafluorethylen (PTFE) Rack, und halten Sie sie by PTFE Gewindedichtband der Länge nach, halb auf dem Rand der Oberflächen und zur Hälfte auf dem Rack. Nach dem Wickeln für die Handhabung der Zahnstange während des Reinigungsvorganges ein langes Stück (~ 5 cm) des Bandes verlassen.
    2. Füllen Sie ein 1 L Becherglas mit 350 ml H 2 SO 4 und 150 ml H 2 O 2 Piranha - Lösung in einem Abzug zu machen. Legen Sie das Rack in Piranha-Lösung für 2 Stunden.
    3. Leere Piranha-Lösung aus dem Becher und rinse Deckgläser gründlich mit entionisiertem Wasser, bis der pH des Wassers in dem Becher erreicht neutral. Verwenden Sie pH-Papierstreifen.
    4. Beschallen die Racks von Deckgläsern in den Becher Wasser, 30 min. Leere Wasser aus dem Becher kurz vor Amino Silanisierung. Verwenden Sie 75 W von Beschallungsleistung zu reinigen und zu derivatisieren die Glassubstrate.
  2. Aminosilanisierung auf der Glasoberfläche
    1. 2 ml N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylendiamin und 10 ml Eisessig zu 200 mlMethylalkohol in einem sauberen Polypropylenbehälter für die Aminosilanisierung Lösung vorbereitet.
    2. Legen gereinigt Deckgläser in der Polypropylenbehälter. Schüttle sie bei 100 Upm und Raumtemperatur für 30 min.
    3. Beschallen den Becher mit derivatisierten Abdecküberzüge für 15 min bei 75 W für mindestens 30 min schütteln sie bei 100 Umdrehungen pro Minute und Raumtemperatur.
    4. Entleeren der Lösung aus dem Becherglas und spülen Deckgläser vorsichtig einmal mit Methylalkohol und zweimal mit Ethylalkohol. Shop Deckgläser in Ethylalkohol und nutzen sie innerhalb von zwei Wochen.
  3. PEGylierung des Deckplättchens
    1. Machen 10 ml 0,1 M Natriumbicarbonat (NaHCO 3). Filtern der Lösung mit einem 0,22 um-Spritzenfilter.
    2. Man löst 2 mg Biotin-PEG-Succinimidylcarbonat (Biotin-PEG-SC) und 80 mg PEG-Succinimidyl - valerat (mPEG-SVG) in 350 & mgr; l NaHCO 3. Verwenden Sie ein Lichtschutzrohr.
    3. Mischen Sie den Schlauch kräftig für 10 sec, und es Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min zu entfernen Blasen.
    4. Spülen einen Glasobjektträger mit Aceton und anschließend mit Ethylalkohol gespült. Lassen Sie den Schieber vollständig an der Luft trocknen.
    5. Einen Tropfen (50 ul) von PEG-Lösung auf dem sauberen Glas-Objektträger. Decken Sie die Tröpfchen sanft mit einem Amino silanisiert Deckglas, ohne Blasen zu erzeugen.
    6. Die Objektträger für 3 Stunden bis über Nacht in einem dunklen, gut eingeebnete feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen leeren Pipettenspitzenhalter als die Kammer, mit Wasser auf dem Boden. Siegel Rest PEG-Lösung in dem Rohr und halten sie bei 4 ° C.
    7. Spülen Sie die pegyliertes Deck gründlich mit entsalztem Wasser. Bewahren Sie es in einem dunklen und trockenen Ort bis zum Gebrauch.

3. Montage einer Flusskammer

  1. Fabrizieren ein gestanztes Acrylhalter, wie in Abbildung 2. Stellen Sie sicher , dass der Durchmesser der Rohreinsatz 0,762 mm ist, und bezeichnen ein Loch ein Einlass ist und das andereeinen Auslass (Abbildung 2).
  2. Legen Sie doppelseitige Klebeband Streifen (Breite 5-6 mm) auf einem Acryl-Halter (Abbildung 2), Ausrichten senkrecht zu einer Ein- und Austrittsloch, keine Kanalbohrungen gestört. Verwenden Sie diese Bandstreifen als Mehrkanalwände Kammern zu machen. Schrubben Sie das Band mit einer Pipettenspitze.
  3. Legen Sie ein pegyliertes Deckglas auf der Oberseite, um die Strömungskammern machen, mit dem PEGylierten Seite nach unten.
  4. Um eine Lösung nicht auslaufen, drücken Sie die Spitze eines Deckglases über den Bereich, in dem doppelseitigen Klebebändern platziert werden. Fügen Sie schnell trocknend Epoxidkleber die Ränder der Kammer am oberen und am unteren Rand (gelbe Farbe in Abbildung 2) zu schließen.
  5. Verbinden ein kurzes Stück (2,5 cm) der Rohrleitung (Außendurchmesser OD, 0,042 ") zu einer gasdichten Spritze und Abdichten der Verbindung mit Epoxy-Klebstoff.
  6. Verbinden eine lange flexible Schlauch (OD: 0,03 "), um den Schlauch an der Spritze verbunden, und abdichten das Gelenk mit Epoxidkleber.
  7. Füllen Sie den tubing an der Spritze mit DI-Wasser verbunden. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblase.
  8. Legen Sie den Schlauch in das Loch der Strömungskammer mit Epoxid-Kleber versiegelt.
  9. Legen Sie eine gelbe Spitze (200 ul Spitze) auf der anderen Loch als Reservoir.

4. Probe Laden in Flusskammer

Hinweis: Neutravidin kann mit anderen Proteinen Avidin wie Streptavidin ersetzt werden. Alle Reaktionen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden, es sei denn, es erwähnt wird. Nehmen Probenlösung in einem gelben Spitze, und installieren Sie die Spitze mit der Lösung auf das Loch von Acrylhalter (Abbildung 2b).

  1. Stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe bei 50 & mgr; l / min. Last 20 ul Avidin-Protein (25 ug / ml in T50-Lösung, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), und halten Sie es für 10 Minuten.
  2. Last 20 ul biotinylierten Oligodesoxynukleotide (100 & mgr; M in 1 × TE), und halten Sie es für 10 Minuten. Wenn Terminal-Transferase verwendet wird, lassen Sie die Ladevon Oligodesoxynukleotide.
  3. Last 20 ul DNA-Lösung aus Schritt 1 in die Strömungskammer mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ul / min und Halten für 30 min.
  4. Waschen Sie die Flusskammer mit 1 × TE und laden 40 ul FP-DBP 10 (~ 80 nM).
  5. Beobachten DNA unter einem Fluoreszenzmikroskop mit kontinuierlichen Fluss von Anfärben Moleküle in 1 × TE auf einem 60X Objektiv. Verwenden 488 nm Festkörperlaser zur Anregung von FP (eGFP) -DBP. Für volle Strecke von DNA-Molekülen, gelten unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten entsprechend den DNA-Längen verwendet. So gelten beispielsweise 50 & mgr; l / min für 48,5 kbp von λ-DNA und 100 & mgr; l / min für 166 kbp von T4 DNA.
    1. Für das Recycling des Acrylhalter tränken montierten Strömungskammern in einem Haushalt Reinigungslösung 12. Entfernen Sie Bänder und Epoxy mit einer Rasierklinge und reiben mit den Händen völlig sie auszuziehen. Unclog Löcher mit Spritzennadeln. Halten Sie die Halter in entsalztem Wasser bis zur weiteren Verwendung.

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Representative Results

Figur 1 zeigt zwei verschiedene DNA Anbinden Methoden in Abhängigkeit von terminalen Strukturen des DNA - Moleküls. 1a veranschaulicht , wie die klebrigen Enden DNA - Moleküle mit komplementären biotinylierten Oligonukleotiden hybridisiert werden, die auf dem Avidin-beschichteten PEG Oberfläche immobilisiert sind. 1b zeigt die Zugabe von biotinyliertes ddNTP oder dNTP an die Hydroxylgruppe eines stumpfen ended DNA durch terminale Transferase "3. Wir fügten flexible Linker zwischen DNA-Molekülen und Biotin. Dadurch erhöhte sich die Ligation und Avidin-Biotin - Bindungseffizienz ausreichend Raum für die Reaktionen zu liefern. 1c veranschaulicht die allgemeine schematische Darstellung für die DNA - Anbinden auf die Avidin-beschichteten Oberfläche PEG.

Figur 2 zeigt die Anordnung der Strömungskammer zusammen mit einem Acrylhalter. Im Vergleich zu Glass / Quarz - Deckgläser, eine maßgeschneiderte Acrylhalter vereinfacht die Herstellung der Strömungskammer für Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie. 12 Die Strömungskammer sofortige Veränderung der Pufferbedingungen für Enzymreaktionen ermöglicht, 6 und Verstrecken DNA - Moleküle.

Abbildung 3 zeigt Einzel gefesselte DNA und T4 & lgr; DNA gefärbt mit FP-DBP. Mikrofluidik-Scher fließt längliche einzelne DNA-Moleküle bis zur vollständigen Konturlängen wie 16,5 & mgr; m (48,5 kb λ DNA x 0,34 nm) und 56,4 & mgr; m (166 kb T4 DNA x 0,34 nm). Wir konnten DNA Stretching und Entspannung mehrmals während eines längeren Zeitraums (zB halbe Stunde) zu wiederholen, da wir FP-DBP verwendet , die nicht photo Spaltung verursacht.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der DNA - Tethering. a) A sticky ended DNA wird mit einem biotinylierten komplementären Oligonukleotid hybridisiert. Triethylenglykol ist ein flexibler Linker zwischen dem Oligonukleotid und Biotin. B) Biotinylierte dNTP zu einem stumpfen Ende der doppelsträngigen DNA, die von terminaler Transferase zugesetzt wird. Polycarbon Abstandshalter (11-Atomen) ist ein flexibler Linker zwischen dNTP und Biotin. C) Biotinylierte DNA wird an einen Avidin - Protein verankert ist , die kovalent an die Glasoberfläche gebunden an ein biotinyliertes PEG gebunden ist. Das Verhältnis von biotinylierten PEG zu normalen PEG betrug 0,025 (01.40). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Flusskammer. a) Flusskammer aus einem Acrylsäureharz Halter aus, Streifen doppelseitige Klebebänder und ein pegyliertes Deckglas. Die Acryl-Halter von Abmessungen 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x B x H), wurde mit Laserschneiden hergestellt b) Seitenansicht der Strömungskammer. Gestanzten Löcher sind eine Einlassöffnung , an dem ein gelber Spitze für installiert ist ein Pufferspeicher, und eine Austrittsöffnung , die durch eine Spritzenpumpe gesteuert mit einem Schlauch verbunden ist. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Fluorescent mikroskopische Aufnahmen von gestreckten DNA - Moleküle , gefärbt mit FP-DBP. a) Bacteriophage λ - DNA (48,5 kbp) auf der Oberfläche gebunden nach der Ligation mit biotinyliertem komplementären Oligonukleotiden. b) Bacteriophage T4 DNA (166 kbp) auf der Oberfläche gebunden , nachdem Biotin mit terminaler Transferase hinzugefügt wird . Angegeben Pfeile zeigen DNA moleculgestreckt es, um ihre volle Konturlängen wie 16,5 & mgr; m für λ-DNA und 56,4 & mgr; m für die T4-DNA auf. Maßstabsbalken:. 10 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Hier präsentieren wir eine Plattform zur Visualisierung von langen DNA-Molekülen biotinyliert für auf Oberflächen zu verankern. Wir haben einen Ansatz für die DNA - Moleküle gebunden an eine Avidin Protein beschichtete Oberfläche mit biotinyliertem Rinderserumalbumin berichtet. 6 In der früheren Ansatz, fanden wir eine entscheidende Frage der DNA - Photospaltung durch Bis-Einlagerungs Farbstoffe verursacht wird, die auf die gefesselte DNA - Moleküle Fleck Oberfläche. Da diese kontinuierlich angeregten Fluorophore haben eine hohe Wahrscheinlichkeit , eine DNA Phosphatrückgrats angreifen, 9 die Anregungslichtleistung minimiert werden musste Photospaltung zu vermeiden.

Um diesen Nachteil zu überwinden, entwickelten wir genetisch fluoreszierende Proteine ​​mit DNA-Bindungsfähigkeit (FP-DBP) für die Färbung DNA ohne Photospaltung entwickelt. 10 Wir haben beobachtet , zuverlässige DNA - Färbung auf Avidinbeschichtete Proteinoberflächen. Dennoch hatte diese Plattform ein weiteres Problem unerwünschter Aggregation von fluoreszierenden Proteinen auf derProteinoberfläche, was zu erhöhten Hintergrundrauschen führt. Es ist wesentlich, diese Zufallsrauschen für Einzelmolekül-DNA-Analyse zu minimieren, um den Kontrast von DNA und Proteinen aus dem Hintergrund zu verstärken. Die Verwendung von FP-DBP erfordert daher Oberflächenpassivierung von dem fluoreszierenden Protein zu verhindern auf der Oberfläche adsorbiert wird. PEG kann ein leistungsfähiger Kandidat für diesen Zweck sein. 12. Daher verwendeten wir biotinylierte-PEG, die dramatisch Signal-zu-Rausch - Verhältnis für die Bildgebung FP-DBP auf der Oberfläche gebunden gefärbten DNA - Molekülen verstärkt.

Es gibt mehrere wichtige Schritte und stellt in diesem Verfahren für höhere Erträge. Um ein Ende eines DNA - Moleküls auf einer Glasoberfläche, eine primäre Amingruppe auf einem Deckglas , gefolgt von Biotin-PEG - Beschichtung silanisiert wird anbinden , wie in Figur 1. Diese Oberflächen Passivierungsverfahren für Einzelmolekül - DNA - Bildgebung , da es kritisch gezeigt kann erheblich rausch Erzeugen von Zufalls Adsorption an den Oberflächen zu verringern.Daher werden über Nacht Aminosilanisierung und PEGylierung dringend empfohlen. Darüber hinaus können die Objektträger aus Glas sowie das Deckglas mit Piranha-Reinigungslösung weitere Hintergrundgeräusche zu reduzieren.

Ein biotinyliertes Oligonucleotid muss eine Phosphatgruppe am 5'-Ende, um es zu 3 zu verbinden 'haben Hydroxylgruppe eines großen DNA-Moleküls. Die Sequenz von biotinylierten Oligonukleotids 5'-p-GGGCGGCGACCT-TEG-Biotin-3 'für λ DNA Anbinden. Die λ-DNA-Lösung muß kurz nach der Herstellung von λ-DNA-Lösung eingelegt werden (in 1.1 beschrieben), weil λ DNA oft Konkatemeren mit Langzeitlagerung bildet. Für blunt-ended DNA wie T4 DNA kann terminale Transferase biotinylierten dUTPs an beiden Enden der DNA ohne Spezifität hinzufügen. Somit hat terminaler Transferase Reaktionszeit etwa eine Stunde sorgfältig eingestellt werden, sonst verlängert Reaktions doppelt markierten DNA kann erhalten wurde ( das heißt, beide Enden mit Biotin markiert). in Addition auf virale DNA wie λ und T4 können beliebige Arten von DNA in dieser Plattform verwendet werden. Es wird jedoch empfohlen, Fragmente von gigantischen genomische DNA nach dem Verdau von selten schneidenden Restriktionsenzymen wie SwaI oder NotI zu verwenden.

Unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten für unterschiedliche Längen von DNA aufgetragen. Normalerweise längere DNA-Moleküle erfordern schnellere Fließgeschwindigkeiten vollständig die DNA-Moleküle dehnen, um die genaue Konturlänge übereinstimmen. So kann beispielsweise λ DNA bis zu 16,5 & mgr; m, Strecke, die dem berechneten Wert von 0,34 nm x 48.502 bp entspricht.

Es ist ganz wichtig, frisch alle Materialien herzustellen, insbesondere alle von Proteinen und PEGs. Zum Beispiel verliert Neutravidin leicht seine Funktion Biotine binden, wenn es als eine verdünnte Lösung gespeichert ist. Für PEG-Lösungen, pH kritisch funktionellen Gruppen eines primären Amins und N-Hydroxysuccinimid zu konjugieren. Daher ist es empfehlenswert, frisch alle Materialien, jede Woche mindestens vorzubereiten.

Visualisierung großer DNA-Moleküle an der Oberfläche gebunden ist, eine vielseitige Plattform für eine Vielzahl von Anwendungen wie Genomik, epigenomics, biochemische Untersuchungen für DNA und Protein-Wechselwirkung und Polymerphysik Studien angewendet werden. Jedoch ist dieser Ansatz derzeit nur begrenzt Systeme zu modellieren relativ einfache und bekannte DNA-Moleküle, wie beispielsweise das virale Genom verwendet. Zu dem menschlichen Genom und epigenome verlängert werden, ist es von entscheidender Bedeutung, eine robuste, zuverlässige und einfache Plattform für die praktische Anwendung zu schaffen. Durch die Überwindung Licht-induzierte DNA-Foto-Spaltung und zur Verhinderung zufälliger Adsorption von fluoreszierenden Protein auf der Oberfläche, diese Plattform bietet daher klar und kontrastreiche Bilder für die DNA-länglich mit Scherströmungen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase New England Biolabs M0315S Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP Invitrogen R0081 Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA Nippon Gene 318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA Bioneer D-2510 Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip Marienfeld-Superior 0101050 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape Han Yang Chemical Co. Ltd. 3032292 Teflon™ tape
Sulfuric acid Jin Chemical Co. Ltd. S280823 H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide Jin Chemical Co. Ltd. H290423 H2O2, 35% in water
Sonicator Daihan Scientific Co. Ltd. WUC-A02H Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
ethylenediamine
Sigma-Aldrich 104884
Glacial Acetic Acid Duksan Chemicals 414 99% Purity
Methyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. M300318 99.9% Purity
Polypropylene Container Qorpak PLC-04907
Ethyl Alcohol Jin Chemical Co. Ltd. A300202 99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Syringe Filter Sartorius 16534----------K
Biotin-PEG-SC Laysan Bio Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
Acetone Jin Chemical Co. Ltd. A300129 99% Purity
Microscope Slides Marienfeld-Superior 1000612 ~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support Custom Fabrication
Double-sided Tape 3M Transparent type
Quick-dry Epoxy 3M
Polyethylene Tubing Cole-Parmer 06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe Hamilton 81165
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin Thermo Scientific 31000
Tris base Sigma-Aldrich T1503-5KG Trizma base
Microscope Olympus IX70
EMCCD Camera Q Imaging Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm) Oxxius LBX488
Alconox Alconox Inc.

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References

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