जनरेशन और जीएम-सीएसएफ की पहचान व्युत्पन्न वायुकोशीय तरह मैक्रोफेज और वृक्ष के समान माउस अस्थि मज्जा से कोशिकाओं

1Microbiology and Immunology, University of British Columbia
Published 6/25/2016
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Immunology and Infection

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Dong, Y., Arif, A. A., Poon, G. F., Hardman, B., Dosanjh, M., Johnson, P. Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (112), e54194, doi:10.3791/54194 (2016).

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Abstract

मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) सहज प्रतिरक्षा ऊतकों और अंगों लसीकावत् कि रोगजनकों के खिलाफ रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा में पाया कोशिकाओं रहे हैं। हालांकि, वे पर्याप्त संख्या में अलग-थलग करने के लिए उन्हें विस्तार से अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो जाता है, इसलिए, इन विट्रो मॉडल विकसित किया गया है। अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृतियों प्रतिरक्षा अध्ययन के लिए अच्छी तरह से स्थापित और मूल्यवान तरीके हैं। इधर, संवर्धन और साइटोकाइन granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) का उपयोग प्राथमिक माउस अस्थि मज्जा की कोशिकाओं का एक ही संस्कृति से दोनों डीसी और मैक्रोफेज की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है। इस प्रोटोकॉल की स्थापना की प्रक्रिया पहले लुट्ज़ एट अल द्वारा विकसित पर आधारित है। अस्थि मज्जा व्युत्पन्न DCs के लिए 1999 में। संस्कृति विषम है, और MHCII और fluoresceinated हयालूरोनान (FL-हा) अपरिपक्व और परिपक्व डीसी से मैक्रोफेज भेद करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। ये जीएम- CSF व्युत्पन्न मैक्रोफेज समर्थकइन विट्रो व्युत्पन्न मैक्रोफेज है कि निकट दोनों phenotype और समारोह में वायुकोशीय मैक्रोफेज के समान के लिए एक सुविधाजनक स्रोत ख़बरदार।

Introduction

कई इन विट्रो संस्कृति तरीकों अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न DCS (BMDCs) एक या विकास के कारकों के संयोजन का उपयोग उत्पन्न करने के लिए वर्णित किया गया है। BMDMs या तो बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) या जीएम- CSF 1,2 का उपयोग कर अस्थि मज्जा की कोशिकाओं संवर्धन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। BMDCs के लिए, अस्थि मज्जा संस्कृति को FLT3 ligand के अलावा गैर पक्षपाती शास्त्रीय और plasmacytoid डीसी को जन्म (CD11c उच्च / MHCII उच्च और CD11c लो, B220 + क्रमशः) देता संस्कृति 3,4 9 दिनों के बाद। इसके विपरीत, गैर पक्षपाती कोशिकाओं अकेले जीएम- CSF 5,6 के साथ संस्कृति में 7 से 10 दिनों के बाद उत्पन्न, जीएम-सीएसएफ और आईएल 4 से 7, या जीएम- CSF और FLT3 ligand 8,9 उत्पन्न BMDCs अधिक बारीकी से भड़काऊ डीसी जैसी (CD11c उच्च, MHCII उच्च CD11b +) 10। इन विट्रो में संस्कृतियों मैक्रोफेज उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है याडीसी, यह स्पष्ट नहीं है, तो प्रत्येक संस्कृति शुद्ध आबादी को जन्म देता है। उदाहरण के लिए, हालांकि जीएम- CSF संस्कृतियों में पक्षपाती कोशिकाओं मैक्रोफेज 5, एक ही संस्कृति से गैर पक्षपाती कोशिकाओं डीसी 6,11-13 के रूप में उपयोग किया जाता है, अनुमान है कि वे सजातीय हैं और किसी भी मनाया परिवर्तनशीलता है साथ होने के लिए वर्णित हैं कारण विकास 14,15 के विभिन्न चरणों के लिए। इसके अलावा, अध्ययन विवो 16,17 में वायुकोशीय मैक्रोफेज के विकास के लिए एक आवश्यक विकास कारक हो जीएम- CSF पाया है, और वायुकोशीय तरह मैक्रोफेज 16,17,18 उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो में इस्तेमाल किया जा सकता है।

पालन ​​के अलावा, जीएम- CSF इलाज किया अस्थि मज्जा संस्कृतियों से मैक्रोफेज और DCS पैदा करने के लिए प्रक्रिया बहुत विविधता का सुझाव जीएम- CSF अस्थि मज्जा संस्कृतियों के भीतर मौजूद हो सकता है के समान हैं। यह वास्तव में के रूप में दो पत्र BMDC संस्कृतियों की गैर पक्षपाती अंश में BMDMs की उपस्थिति की रिपोर्ट का मामला प्रतीत हो रहा है। एक पत्र में, वे identifiप्रवर्तन निदेशालय के रूप CD11c +, CD11b +, MHCII मध्य, MerTK +, और CD115 +, जो एक जीन की अभिव्यक्ति के हस्ताक्षर है कि सबसे निकट वायुकोशीय मैक्रोफेज मची और टी कोशिकाओं 19 को सक्रिय करने के लिए एक कम क्षमता थी व्यक्त कोशिकाओं की आबादी। (CD11c +, MHCII मध्य / कम, फ्लोरिडा हा उच्च) कि अपरिपक्व से अलग किया गया था (CD11c +, MHCII मध्य, फ्लोरिडा हा कम) और परिपक्व दूसरे का इस्तेमाल किया MHCII और फ्लोरिडा हा कागज एक वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका की तरह जनसंख्या की पहचान करने के लिए DCS (CD11c +, MHCII उच्च), दोनों phenotypically और कार्यात्मक 18। इन पत्रों में दोनों उदाहरण देकर स्पष्ट करना है कि जीएम-सीएसएफ BMDC संस्कृतियों विषम हैं, दोनों मैक्रोफेज और उस देखभाल का संकेत है जब BMDC संस्कृतियों से डेटा की व्याख्या लिया जाना चाहिए डीसी आबादी से युक्त।

इस प्रोटोकॉल का वर्णन अस्थि मज्जा, जीएम- CSF में संस्कृति अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए कैसे, और वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका तरह की पहचानअपरिपक्व और परिपक्व बंधन और MHCII अभिव्यक्ति FL-हा का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा अस्थि मज्जा संस्कृति में डीसी से आबादी। । यह प्रक्रिया लुट्ज़ एट अल 6 की स्थापना की प्रक्रिया पर आधारित है और 5 उत्पन्न करने में सक्षम है - 10 x 10 6 गैर पक्षपाती एक 10 मिलीलीटर संस्कृति के 7 दिन पर कोशिकाओं। संस्कृति दिनों से 7 से 10 प्रयोग करने योग्य है और 7. यह आगे बढ़ने और बड़ी मात्रा में अलग-थलग इन विट्रो वायुकोशीय तरह मैक्रोफेज के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है दिन में मैक्रोफेज, अपरिपक्व और परिपक्व DCs, साथ ही कुछ progenitors के एक विषम आबादी पैदावार।

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Protocol

चूहे ब्रिटिश कोलंबिया पशु की देखभाल समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं द्वारा नैतिक पशु अनुसंधान के लिए पशु की देखभाल के दिशा-निर्देशों पर कनाडा परिषद के अनुसार euthanized थे।

1. माउस फीमर और टिबिया से एक एकल कोशिका अस्थि मज्जा सस्पेंशन हासिल करना

  1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) कैबिनेट हवा शुद्ध और 70% इथेनॉल के साथ, तो साफ / स्प्रे बीएससी सतह से हवा का प्रवाह स्थिरीकरण के लिए अनुमति देने के लिए प्रक्रिया के शुरू करने के लिए 15 मिनट से पहले पर स्विच। सब कुछ प्रोटोकॉल की सम्पूर्णता के लिए संभव के रूप में बाँझ रखें। गैर बाँझ शर्तों के तहत हड्डियों में कटौती न करें।
  2. 70% इथेनॉल में भिगोने से विच्छेदन उपकरण तैयार, 5% भ्रूण बछड़ा सीरम (HBSS-एफसीएस), बाँझ पेट्री डिश (100 मिमी x 15 मिमी), 1 साथ हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (विच्छेदन कैंची, संदंश की 2 जोड़े की 1 जोड़ी) मिलीलीटर सीरिंज, 26½ गेज सुई, शंक्वाकार संग्रह ट्यूब (15 मिलीलीटर या 50 मिलीलीटर), और कागज तौलिए बीएससी में।
  3. का उपयोग कर माउस euthanizeसंस्था के पशु अनुसंधान आचार समिति ने मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल। बीएससी में लाने के लिए, एक या दो कागज तौलिये के शीर्ष पर जगह और स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ माउस।
  4. ढकने के लिए 2 मिलीलीटर - बीएससी में, एक बाँझ पेट्री डिश aseptically, विभाज्य आधार करने के लिए HBSS-एफसीएस के 10 मिलीग्राम और 1 खुला।
  5. वापस ऊपर का सामना करना पड़ के साथ अपने पेट पर माउस प्लेस और गैर प्रमुख हाथ की उंगलियों के साथ वक्ष वर्गों के आसपास की त्वचा उठा। एक चीरा जहां त्वचा को उठा लिया जाता है सुनिश्चित करने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
  6. कटौती के दोनों सिरों, एक हाथ के साथ एक छोर को पकड़ो और ध्यान से पेट के पीछे से माउस के आसपास की त्वचा अलग खींच, पेट में चीरा मिलने के दोनों सिरों तक खींच जारी है।
  7. का सामना करना पड़ पेट के लिए माउस फ्लिप, और एक हाथ से पैर की ओर नीचे त्वचा के निचले आधे पुल, जब तक पैरों को उजागर कर रहे हैं त्वचा वापस खींच रखने के लिए।
  8. माउस के पैर पकड़ लिए और कटौती टखने संयुक्त ऊपर दुखती tendons औरमांसपेशियों को जोड़ने स्नायुबंधन कैंची से टिबिया के निचले सिरे पर पैर करने के लिए। यह पैर की हड्डियों से पैर loosens।
  9. पैर से पैर पकड़ अप करते हैं, कम पैर से जांघ की मांसपेशियों तोड़ फीमर के निचले अंत में सभी संयुक्त घुटने के आसपास की मांसपेशियों और कैंची के साथ स्नायुबंधन काटा। संदंश का प्रयोग धीरे ढीला मांसपेशियों अनुजंघास्थिक और ऊरु सतहों से दूर खींचने के लिए। देखभाल और्विक धमनी तोड़ भारी खून बह रहा से बचने के लिए नहीं ले लो।
  10. एक हाथ पैर पर पकड़ के साथ, प्रेस कूल्हे पर फीमर के शीर्ष अंत में नीचे खुला कैंची, पैर और बारी बारी से मुक्त करने के लिए अंतिम कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करते हुए धीरे से खींच संयुक्त कूल्हे से फीमर अलग करने के लिए शरीर से पैर।
  11. इस बिंदु के बाद से, केवल बाँझ संदंश के साथ ऊतक पकड़। एक छोर पर पैर को पकड़ो और अन्य पर पैर खींच।
    नोट: यह अधिक बल की आवश्यकता नहीं करना चाहिए के रूप में जोड़ने स्नायुबंधन कदम में कटौती कर रहे हैं1.9। वैकल्पिक रूप से, बस टखने जहां हड्डी जुड़े हुए है ऊपर टिबिअ काटा।
  12. संदंश का एक सेट और टिबिया और एक अन्य के साथ बहिर्जंघिका के समीपस्थ अंत के साथ फीमर के बाहर का अंत से पैर पकड़ो, ध्यान से टिबिया और संयुक्त घुटने उन्हें फीमर और पटेला से अलग करने की विपरीत दिशा में मोड़ बहिर्जंघिका।
  13. शेष लिगामेंट और मांसपेशियों को अभी भी कम पैर की हड्डियों से जुड़ी नीचे खींचने के लिए संदंश का प्रयोग करें। इधर, संदंश के साथ संयोजी ऊतक के साथ बहिर्जंघिका को हटाने के रूप में यह बहुत छोटा अस्थि मज्जा कोशिकाओं के लिए प्लावित किया जा रहा है। उल्टे पेट्री डिश के ढक्कन पर साफ टिबिअ रखें।
  14. संदंश का एक सेट और एक अन्य के साथ पटेला साथ फीमर के निचले अंत पकड़ो, पटेला और हटाने के लिए संयुक्त के विपरीत दिशा में आसपास के ऊतकों मोड़। तब फीमर से संयोजी ऊतक शेष साफ; संदंश के साथ उन्हें दूर खींच रहा है, और उल्टे पेट्री डिश ढक्कन पर जगह है। पटेला त्यागें।
  15. दोहराएँ 1.7- दूसरे पैर से 1.13 अगर जरूरत है। 1.6 मिलीलीटर microcentrifuge परिवहन के लिए 1 मिलीलीटर बाँझ HBSS-एफसीएस युक्त यदि आवश्यक ट्यूबों के लिए हड्डियों स्थानांतरण।
  16. उल्टे पेट्री डिश के ढक्कन पर हड्डियों की जगह 1 के साथ -, संदंश का उपयोग किसी भी अवशिष्ट ऊतक अभी भी टिबिया और फीमर से जुड़ी साफ करने के लिए HBSS-एफसीएस के 2 मिलीलीटर, तो HBSS- के 10 मिलीग्राम से युक्त पेट्री डिश के आधार करने के लिए हड्डियों का स्थानांतरण एफसीएस। वैकल्पिक रूप से, हड्डियों को साफ और एक 70% इथेनॉल लथपथ ऊतक का उपयोग कर संलग्न मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें।
  17. कैंची के साथ आधे में हड्डियों के प्रत्येक कटौती। आंशिक रूप से एक बाँझ ढक्कन के साथ पेट्री डिश ढाल सुनिश्चित करने के लिए हड्डियों डिश में रहने जबकि काटने। वैकल्पिक रूप से, अगले चरण में निस्तब्धता अनुमति देने के लिए प्रत्येक हड्डी के अंत में कटौती।
  18. 1 मिलीलीटर सिरिंज पर 26½ जी सुई देते हैं, और पेट्री डिश से 1 मिलीलीटर HBSS-एफसीएस आकर्षित। एक हड्डी टुकड़ा के अंत में सुई की नोक डालें और अस्थि मज्जा की कोशिकाओं (हड्डियों के अंदर नरम लाल ऊतक) को बाहर निकलवाने। सिर में सुई डालेंहड्डी और खुले अंत के लिए, जब तक सभी लाल रंग की मज्जा निकाल दिया जाता है। रंग में सफेद के रूप में हड्डियों का निरीक्षण करें।
  19. एक एकल कोशिका निलंबन के रूप में एक बार कुछ सिरिंज के माध्यम से अस्थि मज्जा के किसी भी दृश्य झुरमुटों गुजरती हैं।
  20. प्लावित हड्डियों को त्यागें। अच्छी तरह से सेल निलंबन मिश्रण और संग्रह ट्यूब को हस्तांतरण करने के लिए एक 10 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग करें। HBSS-एफसीएस के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार पेट्री डिश कुल्ला डिश में अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए। बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
    नोट: अस्थि मज्जा सेल निलंबन अगर 2 के लिए भंडारित अभी भी व्यवहार्य है - 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा।

2. चढ़ाना और संवर्धन अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की (बीएमसी)

  1. निम्नलिखित अभिकर्मकों और आपूर्ति तैयार करें।
    1. 2 मिमी Tris पीएच 7.2 की एक अंतिम समाधान में 0.84% ​​अमोनियम क्लोराइड बनाकर लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर तैयार करें, तो एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से छान कर बाँझ।
    2. उनका कहना है 10% एफसीएस, 20 मिमी HEPES, 1x अनावश्यक अमीनो एसिड, 55 & # द्वारा बीएमसी मीडिया तैयार181, एम 2-मर्केप्टोइथेनाल, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और 2 मिमी एल glutamine RPMI मध्यम 1640 को।
    3. प्राप्त व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनः संयोजक जीएम- CSF या AG8.653 मायलोमा जीएम- CSF जीन 20 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला युक्त का उपयोग जीएम- CSF। एलिसा द्वारा सतह पर तैरनेवाला में जीएम-सीएसएफ की एकाग्रता का निर्धारण और बीएमसी मीडिया के लिए 20 एनजी / एमएल के बराबर जोड़ें।
  2. 5 मिनट के लिए 314 XG पर अस्थि मज्जा की कोशिकाओं स्पिन। गोली लाल रक्त कोशिकाओं के कारण लाल है। बीएससी में, एक बाँझ गिलास पाश्चर विंदुक सक्शन वैक्यूम, दोहन से गोली ढीला, तो आरबीसी lysis बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ने से जुड़ी का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला aspirate। भंवर कोशिकाओं resuspend और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आरबीसी lysis बफर में सेते हैं।
  3. 10 मिलीलीटर जोड़ने के HBSS-एफसीएस तो 5 मिनट के लिए 314 XG पर कोशिकाओं स्पिन और सतह पर तैरनेवाला aspirate। सफेद रंग के रूप में सेल गोली का निरीक्षण करें। बीएमसी मीडिया के वांछित मात्रा में कोशिकाओं Resuspend।
  4. resu गणनाspended कोशिकाओं 0.4% trypan नीले रंग के साथ मृत कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद एक hemocytometer का उपयोग।
    नोट: एक पैर (एकल टिबिया और फीमर) से अस्थि मज्जा प्रयोग किया जाता है, तो बीएमसी मीडिया के 5 मिलीलीटर में resuspend सेल निलंबन के 10 μl ले और नीले 0.4% trypan के 70 μl के साथ पतला, मिश्रण अच्छी तरह से और के 10 μl हस्तांतरण hemocytometer चैम्बर के लिए 1/8 सेल कमजोर पड़ने। चार quadrants में व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना: चार चतुर्थ भाग में गिना जाता है की औसत x कमजोर पड़ने कारक x 10 = 4 मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की संख्या। आरबीसी lysis के बाद 4 10 x 7 कोशिकाओं - एक फीमर और एक पैर से एक टिबिअ आम तौर पर लगभग 2 निकलेगा।
  5. अस्थि मज्जा संस्कृति के अंत में प्रयोगों के लिए आवश्यक कुल कोशिकाओं की संख्या के आधार पर बहाव के प्रयोगों के लिए आवश्यक संस्कृतियों के 10 मिलीलीटर व्यंजनों की संख्या का अनुमान है।
    नोट: प्रत्येक पकवान प्रारंभिक बोने पर 2 एक्स 10 6 अस्थि मज्जा की कोशिकाओं और पैदावार 5 की आवश्यकता है - 7 दिन से कम 10 x 10 6 कोशिकाओं।
    1. अलीएक नया ट्यूब में चढ़ाना के लिए कोशिकाओं की कुल संख्या quot, 5 मिनट के लिए 314 XG पर नीचे स्पिन, सतह पर तैरनेवाला aspirate, और बीएमसी मीडिया में 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल में कोशिकाओं resuspend।
  6. बीएमसी मीडिया के 9.5 मिलीलीटर जीएम-सीएसएफ (पुनः संयोजक या जीएम- CSF सतह पर तैरनेवाला युक्त से) के 200 एनजी युक्त के साथ एक नया बाँझ 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश तैयार करें। 10 मिलीलीटर में 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए पेट्री डिश के केंद्र के लिए 4 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के 500 μl जोड़ें।
    नोट: यह एक बाँझ पेट्री डिश नहीं एक टिशू कल्चर पकवान का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, जब कोशिकाओं को जोड़ने, यह सुनिश्चित कोशिकाओं केंद्र पर केंद्रित रहते हैं और बोने के बाद और मीडिया परिवर्तन के दौरान बर्तन करने के लिए अशांति कम से कम। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं। इस संस्कृति में 0 दिन है।
  7. 3 दिन, कोशिकाओं में से प्रत्येक डिश के लिए जीएम-सीएसएफ के 200 एनजी युक्त ताजा बीएमसी मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें। अशांति ओ को कम करने के ख्याल रखनाकोशिकाओं निलंबन में केंद्रित च। सेल संस्कृति की कुल मात्रा 20 मिलीग्राम है।
  8. 100X बढ़ाई प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें। कई गैर पक्षपाती कोशिकाओं (दौर) और कुछ पक्षपाती कोशिकाओं (फ्लैट) का निरीक्षण करें। एक फूल के तीन या चार जैसी पंखुड़ियों के समूह में कोशिकाओं को देखा जा सकता है, प्रसार का संकेत है।
  9. 6 दिन पर एक आधा मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करते हैं। ध्यान से, एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मीडिया के 10 मिलीलीटर हटाने 5 मिनट, महाप्राण के लिए 314 XG पर नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  10. जीएम-सीएसएफ, धीरे भंवर और 20 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए मूल सेल संस्कृति पकवान में जोड़ने के 20 एनजी / एमएल युक्त ताजा बीएमसी मीडिया के 10 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend। खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
    नोट: 7 दिवस संस्कृति या पक्षपाती फ्लैट कोशिकाओं और दौर गैर पक्षपाती कोशिकाओं के घने बादलों के साथ confluency में अधिक से अधिक 70% से कम होना चाहिए।

3. एकत्रित और से फ्लो के लिए BMDC और BMDMs तैयारी

    <li> 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी बफ़र्स रखें।
  1. 10 दिन के लिए 7 दिन से कोशिकाओं फसल कोशिकाओं, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार संग्रह ट्यूब के लिए संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के पहले स्थानांतरण 10 मिलीलीटर फसल, तो लगभग 30 डिग्री से खड़ी पकवान झुकाव और शेष 10 मिलीलीटर pipetting द्वारा पकवान धोने डिश के ऊपर से संस्कृति का। इस धोने दोहराएँ 5 बार, हर बार एक तिहाई से पकवान घूर्णन।
  2. एक ही संग्रह ट्यूब कोशिकाओं के शेष 10 मिलीलीटर स्थानांतरण और प्लेट और पक्षपाती कोशिकाओं को त्यागें।
    ध्यान दें: washes गैर पक्षपाती और शिथिल पक्षपाती कोशिकाओं को हटा देगा; फ्लैट पक्षपाती कोशिकाओं washes के लिए प्रतिरोधी रहे हैं। आमतौर पर, 5 के बीच - 10 x 10 6 गैर पक्षपाती कोशिकाओं दिन 7 और 2 पर एक थाली से उम्मीद कर रहे हैं - 10 दिन में 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं, हालांकि लुट्ज़ एट अल। 10 दिन में सूचना 10 x 10 6 कोशिकाओं पक्षपाती कोशिकाओं को सामान्य रूप से नहीं ले रहे हैं। हालांकि, गैर पक्षपाती कोशिकाओं की तुलना में किया जा करने के लिए इन कोशिकाओं की जरूरत है, वे इस प्रकार हटाया जा सकता है। 1x पीबीएस, पकवान के बाद गैर पक्षपाती कोशिकाओं को हटा रहे हैं करने के लिए 7.4 पीएच में 0.7 मिमी EDTA के 5 मिलीलीटर जोड़ें, 5 मिनट, पिपेट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते ऊपर और नीचे एक अलग ट्यूब में पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने और इकट्ठा करने के लिए।
  3. 5 मिनट के लिए 314 XG पर एकत्र कोशिकाओं नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला aspirate। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिलीलीटर बाँझ बीएमसी मीडिया में Resuspend, भंवर धीरे मिश्रण, और trypan नीले और hemocytometer का उपयोग गिनती करने के लिए।
    नोट: प्रत्येक पकवान 5 निकलेगा - एक दिन 7 संस्कृति से 10 x 10 6 गैर पक्षपाती कोशिकाओं। अब से, 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी चरणों को पूरा।
  4. प्रवाह cytometric विश्लेषण, 5 मिलीलीटर polystyrene दौर नीचे ट्यूब में प्रत्येक नमूना के लिए 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं हस्तांतरण के लिए, प्रत्येक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (1x फॉस्फेट बफर खारा, 2 मिमी EDTA और 2% गोजातीय सीरम albumin) पर FACS बफर के 300 μl जोड़ने नमूना।
  5. 5 मिनट के लिए 314 XG पर स्पिन कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला aspirate। पर एक दृश्य सफेद, अपारदर्शी गोली का निरीक्षणट्यूब के नीचे।
  6. लेबल हटाया गया एफसी रिसेप्टर Ab के 100 μl में Resuspend कोशिकाओं एफसी रिसेप्टर बंधन (2.4G2 मायलोमा सेल लाइन निर्माण से उपयोग 1/10 सतह पर तैरनेवाला) ब्लॉक और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। फिर, प्रत्येक नमूना, धीरे भंवर FACS बफर के 300 μl जोड़ने फिर कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 314 XG पर नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  7. 0.2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में CD11c-PeCy7 के 100 μl में Resuspend कोशिकाओं, 0.25 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में Gr1 प्रशांत ब्लू, 0.05 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में MHCII एपीसी, और फ्लोरिडा हेक्टेयर में लगभग 2 माइक्रोग्राम / एमएल मैक्रोफेज और डीसी की पहचान।
    नोट: FL-हा fluorescein और मुर्गा कंघी hyaluronic एसिड सोडियम नमक का उपयोग घर में तैयार किया गया था के रूप में पहले 21 में वर्णित है।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते सेल सतह के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देते हैं। प्रत्येक नमूने के लिए FACS बफर के 300 μl जोड़ें, धीरे भंवर, तो कोशिकाओं नीचे 314 XG पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला aspirate नोट:। अगर जैवtinylated एंटीबॉडी 3.8 में उपयोग किया जाता है, 3.8 दोहराने - 9 फ्लोरोसेंट streptavidin के साथ।
  9. मिश्रण और 5 मिनट के लिए 314 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन करने के लिए FACS बफर का एक और 300 μl, धीरे भंवर के साथ कोशिकाओं को धो लें। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 0.1 युक्त FACS बफर के 200 μl में कोशिकाओं resuspend - propidium आयोडाइड या DAPI की मिलीलीटर प्रति 0.2 माइक्रोग्राम nonviable कोशिकाओं लेबल। कोशिकाओं को अब प्रवाह cytometric विश्लेषण 22 के लिए तैयार हैं।
    ध्यान दें: परिणाम देखने और आबादी की जानकारी के लिए चित्रा 3 और कैसे कोशिकाओं gated थे।

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Representative Results

इस विधि के प्रमुख कदम का सारांश एक फ़्लोचार्ट चित्र 1 में दिखाया गया है। संस्कृति के अलग अलग समय पर घनत्व और अस्थि मज्जा संस्कृति की आकृति विज्ञान चित्रा 2 में दिखाया जाता है। 1 दिन में, कोशिकाओं, छोटे और विरल लेकिन 3 दिन से कर रहे हैं अधिक कोशिकाओं, वहाँ कुछ बड़ा कर रहे हैं और कुछ का पालन करने के लिए शुरू कर दिया है। 6 दिन तक एक निश्चित पक्षपाती और गैर पक्षपाती अंश (2A चित्रा) है। संस्कृति दिन 7 से काटा जा सकता है - दिन से 10 चित्रा 2 बी में उपस्थित CD11c + कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत के साथ 10 फसल से पहले दिन 7 संस्कृति, साथ ही अलग पक्षपाती और गैर पक्षपाती सेल अंशों से पता चलता है। पक्षपाती अंश कोशिकाओं प्रकाश washes कि गैर पक्षपाती अंश निकालने के बाद छोड़ दिया है के होते हैं। गैर पक्षपाती अंश बहुत एक वृक्ष के समान आकृति विज्ञान, जो डिजिटल बढ़ाया IM में अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है के साथ कोशिकाओं के लिए समृद्ध हैचित्रा 2 बी में insets में उम्र। एक बार गैर पक्षपाती अंश निकाल दिया जाता है (दिन 7 या दिन 10), कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा कुंजी कोशिका की सतह मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट लेबलिंग के बाद, जैसा कि ऊपर वर्णित विश्लेषण कर रहे हैं। चित्रा 3 गैर पक्षपाती के भूखंडों cytometry प्रतिनिधि प्रवाह चलता दिन 7 और 10 दिन में संस्कृति का अंश।

पर CD11c + और ​​दोनों मैक्रोफेज और डीसी की पहचान, फाटक के लिए Gr1 - कोशिकाओं के आकार और जीवित कोशिकाओं (चित्रा 3 ए और बी) पर पहले gating के बाद। दिन 7 संस्कृतियों में, CD11c + Gr1 - गैर पक्षपाती सेल अंश में आबादी कुल जीवित कोशिकाओं के लिए आम तौर पर 60 से 70% है, और इस दिन 10 (चित्रा 3 बी) पर 90% या उससे अधिक की वृद्धि हुई है। CD11c + Gr1 - दिन 7 और 10 दिन में जनसंख्या तीन मुख्य सबसेट MHCII और फ्लोरिडा हा बिंदी का उपयोग करने में विभाजित किया जा सकताएनजी: MHCII मध्य / कम FL-हा बाध्यकारी उच्च मैक्रोफेज (P1), MHCII मध्य फ्लोरिडा हा बाध्यकारी कम (p2) कोशिकाओं अपरिपक्व डीसी युक्त, और MHCII उच्च FL-हा बाध्यकारी कम परिपक्व DCS (पी 3) (चित्रा 3 सी और संदर्भ के 18 )। फ्लोरिडा हा कम, MHCII कम आबादी (P0) 7 दिन में मनाया P1-पी 3 कोशिकाओं 18 के लिए पूर्वज होते दिखाया गया है। इस आबादी जिसका अर्थ है कि संस्कृति के आगे परिपक्वता हुआ है 10 दिन में स्पष्ट नहीं है। यह भी संस्कृति में CD11c कोशिकाओं का अधिक से अधिक प्रतिशत के रूप में अच्छी तरह से दिन में P2 और पी 3 डीसी आबादी के थोड़ा अधिक प्रतिशत से 10 चित्रा 3 डी MerTK पता चलता है, एक बृहतभक्षककोशिका मार्कर माना द्वारा समर्थित है, अत्यधिक दोनों बृहतभक्षककोशिका पर व्यक्त की है और अपरिपक्व डीसी आबादी (P1 और P2), लेकिन परिपक्व DCS (पी 3 कोशिकाओं) पर एक कम हद तक व्यक्त किया है। विशेष रूप से, पक्षपाती अंश का विश्लेषण P0, P1 की उपस्थिति का पता चलता है औरइस p2 आबादी है, लेकिन नहीं पी 3 परिपक्व डीसी आबादी (डेटा) नहीं दिखाया। इस प्रकार मैक्रोफेज पक्षपाती और गैर पक्षपाती भागों में मौजूद हैं, लेकिन केवल परिपक्व DCs गैर पक्षपाती अंश में मौजूद हैं।

आकृति 1
। चित्रा 1: एक प्रवाह चार्ट विधि की महत्वपूर्ण कदम का संकेत प्राथमिक कोशिकाओं, अस्थि मज्जा से काटा चढ़ाया और 7 के लिए संस्कृति में रखा जाता है - 10 दिन जब वे आगे के प्रयोगों, शुद्ध या FACS विश्लेषण में इस्तेमाल के लिए उपयोग में काटा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: GM-सीएसएफ का सूक्ष्म परीक्षण व्युत्पन्न अस्थि मज्जा की कोशिकाओं। ए) दिन 1, 3, और 6 में अस्थि मज्जा संस्कृति सेल नंबर, आकृति विज्ञान में परिवर्तन, और अलग पक्षपाती और गैर पक्षपाती अंशों के उद्भव में वृद्धि दर्शाता है। बी) वाम पैनल दिन 7 अस्थि मज्जा संस्कृति और ठेठ सेल घनत्व से पता चलता है। मध्यम पैनल दिन गैर पक्षपाती अंश और सही पैनल की कटाई के बाद 7 पक्षपाती कोशिकाओं से पता चलता गैर पक्षपाती अंश दिन में काटा 7. Insets डिजिटल वृक्ष के समान आकृति विज्ञान के साथ इस अंश में कोशिकाओं की छवियों को बढ़ाया जाता है पता चलता है। सफेद पैमाने बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: 7 दिन और दिन से 10 पर जीएम-सीएसएफ संस्कृति का प्रतिनिधि Phenotype गैर पक्षपातीसंस्कृति से कोशिकाओं CD11c, Gr1, MHCII, FL-हा, और MerTK दिन 7 या 10 दिन में और प्रवाह cytometry। ए) द्वारा उनके phenotype कोशिकाओं को पहले आकार पर gated थे तो कोशिकाओं रहते हैं। बी के लिए विश्लेषण) एक शो के साथ चिह्नित कर रहे हैं जनसंख्या मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं से युक्त - CD11c और Gr1 (न्युट्रोफिल / monocyte मार्कर) के साथ gated कोशिकाओं की साजिश और CD11c + Gr1 को पहचानती है। इस आबादी, सी) पर gating MHCII और फ्लोरिडा हा बाध्यकारी है, जो अपरिपक्व DCS (p2 से वायुकोशीय तरह मैक्रोफेज (P1) के अलग होने से पता चलता का प्रवाह cytometry साजिश) से पता चलता है और पून में वर्णित के रूप में डीसी (पी 3 परिपक्व), एट अल। 18। डी) दिन 7 दिन और 10 पर P2 (अपरिपक्व DCs), और पी 3 आबादी (परिपक्व DCs) P1 के बीच MerTK अभिव्यक्ति की तुलना (मैक्रोफेज), histograms इस figu का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंफिर से।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम एक माउस अस्थि मज्जा संस्कृति है कि लुट्ज़ एट अल। 6 से अनुकूलित है से जीएम- CSF व्युत्पन्न मैक्रोफेज और DCS पैदा करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं। MHCII अभिव्यक्ति और फ्लोरिडा हा इस संस्कृति में अपरिपक्व डीसी और मैक्रोफेज के बीच अलग से बाध्यकारी है, जो पहले से मुश्किल हो गया है (चित्रा -3 सी देखें)। यह, एक साथ Helft एट अल। 19 से एक और रिपोर्ट के साथ, जीएम-सीएसएफ प्रेरित BMDC संस्कृतियों है कि पहले से ही डीसी होने लगा रहे थे भीतर विविधता को दर्शाता है। Helft एट अल। 19 काफी अलग संस्कृति की स्थिति में इस्तेमाल किया BMDCs उत्पन्न करने के लिए अभी तक भी एक महत्वपूर्ण बृहतभक्षककोशिका आबादी पाया। जीएम-सीएसएफ प्रेरित मैक्रोफेज वायुकोशीय मैक्रोफेज जैसे लगते हैं और जीएम-सीएसएफ प्रेरित डीसी डीसी भड़काऊ जैसे लगते हैं, जबकि FLT3 ligand पूरक BMDC संस्कृतियों शास्त्रीय और plasmacytoid डीसी 3,4 का उत्पादन। अलग डीसी और बृहतभक्षककोशिका आबादी भी विवो संयुक्त राष्ट्र में मनाया जाता हैder होमियोस्टैटिक और भड़काऊ शर्तों, और वहाँ क्या एक डीसी और एक बृहतभक्षककोशिका 10 को परिभाषित करता है के रूप में क्षेत्र में काफी चर्चा है। यह विशेष रूप से सच है जब यह एककेंद्रकश्वेतकोशिका निकाली गई भड़काऊ डीसी करने के लिए आता है और यह भी इस बीएमसी में प्रासंगिक है। इस प्रकार यह एक विशेष आबादी को चिह्नित करने के लिए कई प्ररूपी मार्कर, कार्यात्मक डेटा, और संभवतः जीन अभिव्यक्ति डेटा का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह भी संभव है कि इन विट्रो में डीसी और बृहतभक्षककोशिका आबादी आगे उप-विभाजित अधिक कार्यात्मक और प्ररूपी मार्कर के रूप में खोज कर रहे हैं हो सकता है।

इस विधि में, मार्कर CD11c, Gr1, MHCII, और फ्लोरिडा हा बीएमसी संस्कृति की गैर पक्षपाती अंश में अपरिपक्व और परिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं से मैक्रोफेज भेद करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यह परिपक्व डीसी से एक बृहतभक्षककोशिका आबादी भेद करने के लिए Helft एट अल। 19, जो मार्कर CD11c इस्तेमाल किया, CD11b, CD115, CD135, MerTK, और MHCII के लिए अलग है। MerTK अभिव्यक्ति के स्तर distinguis कर सकता है(P1) और डीसी (पी 3) परिपक्व मैक्रोफेज के बीच ज, लेकिन अपरिपक्व नहीं DCS (P2) (चित्रा 3 डी)। इस प्रकार FL-हा और MHCII दोनों अपरिपक्व और परिपक्व डीसी आबादी से मैक्रोफेज भेदभाव करने के लिए उपयोगी मार्करों हैं। ये मैक्रोफेज भी इस बीएमसी संस्कृति में डीसी से कार्यात्मक रूप में अलग हैं और इस और अधिक विस्तार में कहीं 18 प्रदर्शन किया है। संक्षेप में, LPS उत्तेजना के बाद बीएमसी मैक्रोफेज परिपक्व डीसी से अलग साइटोकिन्स का उत्पादन और भोले टी कोशिकाओं 18 सक्रिय नहीं करते। ये मैक्रोफेज भी बारीकी से दोनों बाँध FL-हा के रूप में वायुकोशीय मैक्रोफेज जैसे लगते हैं, दोनों phenotypically और कार्यात्मक और CD11c, MerTK, CD200R, CD206 और F4 / 80 एक्सप्रेस और बाद LPS उत्तेजना उपज TNF-α अभी तक भोले टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के 18 में असमर्थ हैं। हालांकि, वहाँ भी मतभेद रहे हैं: बीएमसी मैक्रोफेज CD11b + कर रहे हैं और पूर्व vivo वायुकोशीय मैक्रोफेज की तुलना में Siglec एफ के निचले स्तर पर है, इन कोशिकाओं का सुझाव समान है लेकिन पहचान नहीं हैंवायुकोशीय मैक्रोफेज के लिए कैलोरी।

इस प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। यह बाद अस्थि मज्जा को प्रकाश में लाने से बाँझपन बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। जब में और बीएससी के बाहर घूम रहा है, स्प्रे दस्ताने हाथ और 70% इथेनॉल के साथ वस्तुओं। हालांकि यह 70% इथेनॉल में उपकरण कुल्ला करने के लिए बाँझ के लिए उपयोगी है, इथेनॉल ताकि उपकरण हवा सूखी और यह सुनिश्चित इथेनॉल उन लोगों के साथ संपर्क में हड्डियों या कोशिकाओं लाने से पहले हवा हो गया है अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को विषैला होता है। इसके अलावा, अस्थि मज्जा फसल के दौरान गैर बाँझ उपकरण या हाथों से माउस ऊतकों या कोशिकाओं से संपर्क करने से बचें। हालांकि पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन पूरकता मीडिया में प्रदान की जाती है, कोशिकाओं के लापरवाह हैंडलिंग खमीर या फंगल संक्रमण हो सकता है। इसके अलावा, क्योंकि phagocytic गतिविधि के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं इस संस्कृति में उत्पन्न कर रहे हैं, मामूली प्रदूषण को बस microscopically सेल संस्कृति के अवलोकन से पता नहीं किया जा सकता है, इस प्रकार यह टी की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैवह संदूषण के संकेत। उदाहरण के लिए, सेल नंबर कम किया जा सकता है और जब प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण ऐसे CD40 और CD86 के रूप में सेल सक्रियण मार्कर की अभिव्यक्ति वृद्धि हो सकती है। मीडिया रंग भी संदूषण की वजह से एक पीएच परिवर्तन को दर्शाती पीले रंग की बारी हो सकती है। जब संदूषण होता है, बीएमसी संस्कृति व्यर्थ है। प्रयोगात्मक निरंतरता बनाए रखने के लिए, यह vortexing द्वारा अस्थि मज्जा से एक एकल कक्ष निलंबन पैदा करते हैं और एक सटीक कोशिका गिनती प्राप्त बीएमसी संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अगर हड्डी से किसी भी संयोजी ऊतक एकल कक्ष निलंबन में समाप्त होता है, इसे दूर करने के लिए एक बाँझ 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर। 10 x 10 6 कोशिकाओं - 7 दिन में गैर पक्षपाती अंश में से एक थाली के लिए ठेठ सेल पैदावार 5 के बीच हैं। सेल नंबर आमतौर पर एक अच्छा संकेत है कि प्रोटोकॉल अच्छी तरह से काम कर रहा है। लुट्ज़ 10 x 10 6 कोशिकाओं की रिपोर्ट है, जबकि 5 एक्स 10 6 से 10 दिन पर कोशिकाओं - इस प्रक्रिया के साथ हम आम तौर पर 2 के बीच प्राप्त करते हैं। हम वें पर आरबीसी सेल प्रदर्शनई लुट्ज़ एट अल द्वारा प्रोटोकॉल जबकि प्रारंभिक अस्थि मज्जा कोशिकाओं। नहीं है और इसलिए यह कदम वैकल्पिक हो सकता है करता है। CD11c कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से संख्या और मैक्रोफेज और DCS के अनुपात के प्रतिशत में बदलाव विभिन्न स्रोतों या एफसीएस के बैच से पैदा कर सकते हैं और इसलिए यह लगातार प्रयोगात्मक परिणामों के लिए बीएमसी संस्कृतियों पर एफसीएस के नए बैच का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। जीएम- CSF एकाग्रता 5 एनजी / एमएल से 40 एनजी / एमएल के लिए विविध किया गया था और यह काफी सेल उपज को प्रभावित नहीं किया। सेल घनत्व भी संस्कृति की परिपक्वता को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, Helft एट अल। 4 मिलीलीटर मीडिया है जो उच्च MHCII अभिव्यक्ति 19 के साथ कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत उत्पादन में 1 10 x 7 कोशिकाओं वरीयता प्राप्त। समय बिंदु जब कोशिकाओं काटा जाता है भी गैर पक्षपाती अंश में वर्तमान आबादी के प्रतिशत को प्रभावित कर सकते हैं। कोशिकाओं को आमतौर पर दिन 7 के बीच एकत्र कर रहे हैं - 10 25-27, लेकिन कुछ अध्ययनों दिन 6 19,23,24 पर बीएमसी इकट्ठा। अधिक कोशिकाओं की जरूरत है, संस्कृति बीएमसीबड़े 150 मिमी x 15 मिमी पेट्री ही घनत्व में 40 मिलीलीटर में बर्तन में। इस मामले में एक आधा मात्रा मीडिया परिवर्तन पर किया जाता है दोनों दिन 3 और 6 दिन (यानी, हटा मीडिया, कोशिकाओं नीचे घूमती है और नए सिरे से 20 मिलीलीटर मीडिया 20 एनजी / एमएल RGM-सीएसएफ के साथ पूरक के साथ प्रतिस्थापित के 20 मिलीलीटर)। 6 10 x 7 पकवान प्रति 7. दिन में कोशिकाओं FL-हा बीएमसी संस्कृति में अपरिपक्व और परिपक्व डीसी से मैक्रोफेज भेद करने के लिए, एक महत्वपूर्ण अभिकर्मक है एक साथ MHCII के साथ - ये प्लेटें आमतौर पर 3 उत्पन्न करते हैं। इस प्रकार एक बार यह किया जाता है, इस तरह के वायुकोशीय मैक्रोफेज 18 या BW5147 टी कोशिकाओं के रूप में अनिवार्यता से हा बाध्य करने के लिए जाना जाता कोशिकाओं पर इस्तेमाल के लिए फ्लोरिडा हा titrate और या तो एक हा-अवरुद्ध CD44 एंटीबॉडी का उपयोग कर अपनी विशिष्टता की पुष्टि (KM-81, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध), लेबल हटाया गया हेक्टेयर या एक CD44 कमी सेल। CD11c - संस्कृति में Gr1 + कोशिकाओं गैर हा बाध्यकारी कोशिकाओं के लिए एक आंतरिक नियंत्रण, और एक प्रतिदीप्ति शून्य से एक नियंत्रण (FMO) या CD44 कमी बीएमसी संस्कृतियों के रूप में कार्य कर सकते हैं बेहद सटीक settin के लिए सिफारिश कर रहे हैंफ्लोरिडा हा बाध्यकारी फाटक के जी।

हालांकि प्रयोगों एक विषम संस्कृति का उपयोग किया जा सकता है, यह डीसी या बृहतभक्षककोशिका आबादी या तो प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी या एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोती 18 CD11c की अभिव्यक्ति पर आधारित का उपयोग कर, Gr1, MHCII, और हा बाइंडिंग के लिए संतुष्ट करने के लिए सलाह दी जाती है। संभावित प्रयोगों ऐसे एलपीएस के रूप में टोल की तरह रिसेप्टर एगोनिस्ट सक्रियण और साइटोकाइन उत्पादन, टी सेल सक्रियण assays, या प्रवाह cytometry द्वारा अतिरिक्त लक्षण वर्णन को मापने के लिए के साथ उत्तेजना शामिल हैं। उदाहरण के लिए, उत्तेजना के 8 या 24 घंटे के बाद, प्रवाह cytometry 18 में वर्णित है, साइटोकिन्स और / या ऐसे CD40 और CD86 के रूप में सह उत्तेजक अणुओं की सतह लेबलिंग के लिए intracellular धुंधला को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Intracellular साइटोकाइन लेबलिंग प्रक्रियाओं Brefeldin ए, जो स्राव को रोकता है और साइटोकाइन सेल के अंदर का निर्माण करने की अनुमति देता है के साथ कोशिकाओं के pretreatment की आवश्यकता होती है। टी सेल सक्रियण लोआ शामिल assays के लिएएक प्रतिजन के डिंग इस तरह के एक प्रतिजन सेल द्वारा ओवीए पेप्टाइड के रूप में, शुद्ध मैक्रोफेज MHCII और हा के आधार पर बाध्यकारी टी कोशिकाओं को सक्रिय नहीं होंगे, जबकि अपरिपक्व और DCS 18 होगा परिपक्व। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अकेले छँटाई प्रक्रिया कुछ हद तक वृक्ष के समान कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं यह महत्वपूर्ण है सभी प्रयोगों में नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए कर रही है।

किसी भी इन विट्रो विधि के साथ के रूप में, वहाँ फायदे और नुकसान विवो या पूर्व विवो कोशिकाओं में उपयोग की तुलना में कर रहे हैं। नुकसान यह वास्तव में नकल विवो कोशिकाओं लेकिन वे लाभ यह है कि वे पर्याप्त संख्या में उत्पन्न किया जा सकता कार्यात्मक और जैव रासायनिक विश्लेषण अनुमति देने के लिए, कुछ अक्सर पूर्व vivo कोशिकाओं के साथ संभव नहीं है कि नहीं हो सकता है इन विट्रो ली गई कोशिकाओं में है। मैक्रोफेज और डीसी पहचान का यह तरीका पहले से underappreciated असमलैंगिक के साथ एक संस्कृति से अधिक समरूप सेल आबादी प्राप्त करने के लिए भविष्य के अनुसंधान के लिए अनुमति देगाgeneity। इस जीएम- CSF संस्कृति से शुद्ध मैक्रोफेज बारीकी से फेफड़ों के 18 से वायुकोशीय मैक्रोफेज जैसे लगते हैं, यह इन विट्रो विश्लेषण के लिए वायुकोशीय तरह मैक्रोफेज के लिए एक सुविधाजनक स्रोत प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, इन हा बाध्यकारी मैक्रोफेज दवाओं वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका समारोह को संशोधित कि के लिए स्क्रीन और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के संक्रमण और प्रतिरोध के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हाल ही में खोज की है कि जीएम-सीएसएफ और एम सीएसएफ अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज प्रत्यारोपण चूहों 28,29 में फेफड़े के proteinosis कम कर सकते हैं को देखते हुए, जीएम- CSF संस्कृतियों से मैक्रोफेज की पहचान करने के लिए इस विधि इस प्रस्तावित चिकित्सा की प्रभावकारिता को बढ़ाने में मदद कर सकता है।

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Acknowledgements

इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) (ग्रांट एमओपी 119,503) और कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग परिषद (NSERC) की कनाडा के संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था। NSERC भी गर्मियों studentships समर्थित यार्ड के लिए और ए.ए. वाई.डी. ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय (यूबीसी) एक 4 साल फैलोशिप पुरस्कार के साथ द्वारा समर्थित है, ए.ए. एक स्नातक छात्र मास्टर पुरस्कार (सीजीएस-एम) के साथ CIHR द्वारा समर्थित है। हम चित्रा 2 में छवियों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के साथ सहायता के लिए केल्विन Roskelley धन्यवाद। हम यह भी यूबीसी पशु और से फ्लो सुविधाओं से समर्थन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flow Cytometer BD  LSR-II
Automated Inverted Microscope  Leica  DMI4000 B
Centrifuge  Thermo Fisher ST-40R
Biosafety Cabinet Nuaire NU-425-600
Syringe 1 ml BD 309659
26 1/2 Gauge Needle BD 305111
50 ml Conical Tube  Corning 357070 *Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml) Corning MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes Corning 352052
Dissection Tools Fine Science Tools  *Various  *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep 
Hemocytometer  Reichert 1490
Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish Corning 351029 *Falcon brand
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher 21985-023
Ammonium Chloride BDH BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1600-1
Brefeldin A Sigma B7651-5MG
EDTA Sigma E5134-1KG Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 16000-044
Hank's Balanced Salt Solution Thermo Fisher 14175-095 
HEPES Thermo Fisher 15630-080 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine Sigma G8540-100G
LPS Ultrapure Invivogen tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Thermo Fisher 11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x Thermo Fisher 15140-122
Potassium Phosphate Monobasic BDH BDH0268-500G
Potassium Chloride BDH BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF Peprotech 315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate  Sigma H5388-1G *Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640  Thermo Fisher 21870-076 No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using.
Sodium Chloride Fisher  5271-10  
Sodium Phosphate Dibasic Sigma 50876-1Kg
Sodium Pyruvate Sigma P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Fisher Bioreagents BP152-5
Trypan Blue Sigma T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant N/A N/A Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7 eBioscience 25-0114-82 Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450 eBioscience 48-5931-82 Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC eBioscience 17-5321-82 Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK Abcam BAF591 Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE eBioscience 12-4317-87
Propidium Iodide Sigma P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-5MG

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References

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