Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

1Microbiology and Immunology, University of British Columbia
Published 6/25/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Dong, Y., Arif, A. A., Poon, G. F., Hardman, B., Dosanjh, M., Johnson, P. Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (112), e54194, doi:10.3791/54194 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

, Makrofajlar ve dendritik hücreler (DC'ler) patojenlere karşı savunmada temel bir rol oynar doku ve lemfoid organlarda bulunan doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, bu nedenle, in vitro modeller geliştirilmiştir, detaylı bir şekilde ele alınması için yeterli sayıda izole edilmesi zordur., Kemik iliği türevli makrofajlar ve dendritik hücrelerin in vitro kültürler immünolojik çalışmalar için köklü ve değerli yöntemlerdir. Burada, kültür ve sitokin granülosit makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) kullanılarak primer, fare kemik iliği hücrelerinin tek bir kültür DH'lerin ve makrofajlar hem belirlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol ilk olarak Lutz ve arkadaşları tarafından geliştirilen kurulan prosedüre dayanmaktadır. Kemik iliği kaynaklı DC'ler için 1999 yılında. kültür heterojen ve MHC II ve floresanlı hyaluronan (FL-HA) ergin ve DC'lerden makrofajlar ayırt etmek için kullanılır. Bu, GM-CSF türetilmiş makrofajlar proyakından fenotip ve işlevsel olarak alveoler makrofajları andıran, in vitro türetilmiş makrofaj uygun bir kaynak vide.

Introduction

Çeşitli in vitro kültür yöntemleri, kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar (BMDMs) ve bir veya büyüme faktörlerinin bir kombinasyonu kullanılarak, kemik iliğinden türetilmiş, DCS (BMDCs) oluşturmak üzere tarif edilmiştir. BMDMs makrofaj koloni uyarıcı faktörü (M-CSF) veya GM-CSF 1,2 kullanarak kemik iliği hücrelerinin kültürlenmesi ile elde edilebilir. BMDCs, kemik iliği kültür FLT3 ligandı eklenmesi (B220 +, sırasıyla CD11c / yüksek MHC II, yüksek ve CD11c LO) kültür 3,4 9 gün sonra yapışmayan klasik ve plazmasitoid DC yol açar. Bunun aksine, yapışmayan hücreleri tek başına GM-CSF 5,6 ile kültür içinde 7 ila 10 gün sonra üretilen GM-CSF ve IL-4 ile 7 ya da GM-CSF ve FLT3 ligandı 8,9 BMDCs daha yakından enflamatuar DCler benzeyen oluşturmak (CD11c yüksek, MHC II yüksek CD11b +) 10. Bu in vitro kültür makrofajlar oluşturmak için kullanılan birlikte veyaHer kültürün saf popülasyonları yol verirse DC'ler, belli değildir. Örneğin GM-CSF kültürlerde yapışan hücreler de homojen ve herhangi bir gözlenen değişkenliği olan varsayıma sahip makrofajlar 5, DCler 6,11-13 olarak kullanılan aynı kültürden yapışmayan hücreler, olduğu tarif edilmektedir, ancak nedeniyle gelişme 14,15 farklı aşamalarına. Ayrıca, araştırmalar in vivo 16,17 alveoler makrofaj gelişimi için önemli bir büyüme faktörü olarak GM-CSF bulduk ve alveolar makrofajlar gibi 16,17,18 oluşturmak için in vitro olarak kullanılabilir.

yapışma dışında, GM-CSF ile tedavi, kemik iliği kültürleri makrofajlar ve DCS üretilmesi için işlemler, GM-CSF, kemik iliği kültürleri içinde mevcut olabilir heterojen öne çok benzerdir. Bu gerçekten iki kağıtları BMDC kültürlerin yapışmaz fraksiyonunda BMDMs varlığını rapor olarak durum gibi görünüyor. bir yazıda, bunlar identifiEd en yakın makrofajların andıran ve T hücrelerini 19 aktif hale getirmek için daha düşük bir yeteneğine sahip bir gen sentezleme imza ifade CD11c +, CD11b +, MHC II orta, MerTK + ve CD115 + gibi bir hücre popülasyonu. MHC II ve FL-HA kullanılan ikinci kağıt bir alveoler makrofaj benzeri nüfusu tanımlamak için (CD11c +, MHC II orta / düşük, FL-HA yüksek) olgunlaşmamış farklı oldu (CD11c +, MHC II orta, FL-HA düşük) ve olgun DC'ler (CD11c +, MHC II yüksek), hem fenotipik ve fonksiyonel 18. Bu kağıtlar hem makrofaj ve BMDC kültürlerden gelen verileri yorumlanırken alınması gerektiğini bakım belirten DC popülasyonları ikisini de içeren, GM-CSF BMDC kültürleri heterojen olduğunu göstermektedir.

Bu protokol kemik iliği, GM-CSF kültür kemik iliği hücreleri izole ve alveol makrofaj benzeri nasıl belirleneceği açıklanırbağlayıcı ve MHC II ifadesi FL-HA kullanılarak flow sitometri ile kemik iliği kültürü olgunlaşmamış ve olgun DCler nüfus. . Bu prosedür, Lutz et al 6 kurulan prosedüre göre ve 5 üretebilir - bir 10 mi kültür 7. günde 10 x 10 6 yıkanarak yapışmayan hücreler. Kültür gün ile 7 10 kullanışlı ve 7 gün Bu büyüme ve büyük miktarlarda in vitro alveoler makrofajlar gibi izole etmek için basit bir yöntem sağlar, makrofajlar, olgun olmayan ve olgun DClerin, yanı sıra, bazı soylarının heterojen bir popülasyonu verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fareler British Columbia Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan prosedürlere göre etik hayvan araştırmaları için Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi uyarınca ötenazi edildi.

1. Fare Femur ve Tibia bir Tek Hücre Kemik iliği Süspansiyon Kazanılması

  1. biyolojik güvenlik kabini (BSC)% 70 etanol ile, daha sonra temiz / sprey BSC yüzeyi kabine havayı temizlemek ve hava akış stabilizasyonu için izin prosedürü başlatmak için önce 15 dakika çalıştırınız. protokol bütünlüğü için mümkün olduğunca steril her şeyi tutmak. steril olmayan koşullarda kemikleri kesmeyin.
  2. % 70 etanol içinde ıslatarak diseksiyon araçları hazırlanması,% 5 fetal dana serumu (HBSS-FCS), steril bir Petri kutularına (100 mm x 15 mm), 1 Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (diseksiyon makas forseps 2 çift 1 çift) BSC ml şırıngalar, 26½ gauge iğne konik toplama tüpleri (15 ml veya 50 mi), ve kağıt havlu.
  3. kullanarak fare EuthanizeKurumun hayvan araştırma etik kurulu tarafından onaylandı protokolleri. BSC getirmek bir ya da iki kağıt havlu üstüne yerleştirin ve% 70 etanol ile fare püskürtün.
  4. Kapağın 2 ml - BSC, kısım, tabana HBSS-FCS ve 10 mL 1 steril bir Petri kabı aseptik açın.
  5. yukarı bakacak şekilde arka ile karnına fare yerleştirin ve non-dominant elin parmakları ile göğüs bölümleri çevresindeki deri kaldırın. cilt kaldırıldığı bir kesi yapmak için makas kullanın.
  6. mide de kesi buluştuğu iki bitene kadar çekerek devam mide arkasından fare çevresindeki deri dışında çekin dikkatle kesilmiş iki ucunda, her el ile bir ucuna üzerinde tutmak ve.
  7. yukarı bakacak şekilde mide fareyi Flip ve tek elle aşağı bacak doğru cilt alt yarısını çekme bacaklar maruz kadar deriyi geri çekerek tutun.
  8. Fare up ayak tutun ve ayak bileği ekleminin üzerinde Aşil tendon kesilmiş vekasları bağlantı ligament makas ile tibia alt ucunda ayak. Bu bacak kemiklerinden ayak gevşetir.
  9. yürüyerek bacak tutarken, alt bacak uyluk kaslarını koparmaya femur alt ucunda tüm diz eklem çevresindeki makasla kasları ve bağları kesti. nazikçe fibular ve femoral yüzeylerden gevşetti kasları çekmek için forseps kullanabilir. ağır kanamaya önlemek için femoral arter koparmaya dikkat edin.
  10. Bir yandan ayak üzerinde tutan, kalça ekleminin femur üst ucunda bastırın açık makas, bacak döndürmek ve ücretsiz nihai kesim yapmak için makas kullanırken kalça ekleminden femur ayırmak için nazikçe çekin vücuttan bacak.
  11. Bu noktadan itibaren, sadece steril forseps ile doku tutun. bir ucunda bacak üzerinde tutmak ve diğer ayak çekin.
    NOT: bağlantı ligament adımda kesilir gibi bu kadar kuvvet gerektirmeyecektir1.9. Alternatif olarak, sadece kemik kaynaşmıştır ayak bileği üzerinde tibia kesti.
  12. bir forseps seti ve birbirleri ile tibia ve fibula proksimal ucu femur distal sonuna kadar bacak tutun, dikkatle femur ve patella onları ayırmak için diz ekleminin ters yönde tibia ve fibula bükün.
  13. hala alt bacak kemikleri bağlı kalan ligament ve kasların aşağı çekmek için forseps kullanabilir. kemik iliği hücreleri için temizlenip için çok küçük olarak burada, forseps ile bağ dokuları ile birlikte fibula çıkarın. ters Petri kabı kapağı temizlenmiş tibia yerleştirin.
  14. bir forseps seti ve birbirleri ile patella ile femur alt ucunu tutun kaldırılması için eklemin ters yönde Patellayı ve çevre dokulara bükün. Sonra femur gelen bağ dokuları kalan kapalı temiz; forseps ile onları uzağa çekerek ve ters Petri kabı kapağı üzerine yerleştirin. patellayı atın.
  15. 1.7 tekrarlayın- Diğer bacak ile 1.13 gerekirse. Gerekirse ulaşım için 1 ml steril HBSS-FCS içeren 1.6 ml mikrosantrifüj tüplerine kemikleri aktarın.
  16. 1 ile ters Petri kabı kapağı kemikleri yerleştirin - HBSS-FCS 2 ml hala tibia ve femur bağlı herhangi bir kalıntı doku temizlemek için forseps kullanabilir, daha sonra HBSS- 10 ml içeren Petri kabı tabanına kemikleri aktarmak FCS. Alternatif olarak, kemikleri temizlemek ve% 70 etanol batırılmış doku kullanılarak ekli kas doku kaldırmak.
  17. makasla ikiye kemiklerin her kesin. kemikler çanak kalmak sağlamak için keserken Kısmen steril kapaklı Petri kabı kalkan. Seçenek olarak ise, bir sonraki aşamada yıkama izin vermek için her bir kemik ucu kesin.
  18. 1 ml şırınga üzerine 26½ G iğne takın ve Petri kabı, 1 ml HBSS-FCS hazırlar. Bir kemik parçasının ucuna iğne ucu yerleştirin ve kemik iliği hücreleri (kemiklerin içindeki yumuşak kırmızı doku) dışarı floş. kafasının içine iğne takınkemik ve açık ucun, tüm kırmızı renkli ilik kaldırılıncaya kadar. renk beyaz olarak kemikleri gözlemleyin.
  19. tek bir hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere şırınga ile bir kaç kez kemik iliği görünür bir kümeleri geçirin.
  20. kızarmış kemikleri atın. iyi hücre süspansiyonu karıştırın ve toplama tüpüne transfer etmek için 10 ml pipet kullanın. çanak artık hücreleri toplamak için HBSS-FCS 5 ml ile bir kez Petri kabı durulayın. buz üzerinde hücreleri yerleştirin.
    Not: 2 saklandığında kemik iliği hücre süspansiyonu hala canlı olması - 4 ° C'de 3 saat süredir.

Kemik İliği Hücrelerinin 2. Kaplama ve Kültürleme (BMCs)

  1. Aşağıdaki reaktifler ve sarf malzemeleri hazırlayın.
    1. 2 mM Tris pH 7.2 nihai bir çözelti içinde% 0.84 amonyum klorür yaparak kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu, daha sonra bir 0.2 mikron filtre içinden süzme ile sterilize edin.
    2. % 10 FCS, 20 mM HEPES, 1 x esansiyel olmayan amino asit, 55 ve # ekleyerek BMC ortamı hazırlamak181; RPMI ortamı 1640 M 2-merkaptoetanol, 50 U / ml penisilin ve streptomisin, 1 mM sodyum piruvat ve 2 mM L-glutamin.
    3. Ticari olarak temin edilebilir biraraya getiren GM-CSF elde edilir veya GM-CSF geninin 20 ile transfekte AG8.653 miyeloma hücreleri süpernatant içeren GM-CSF kullanımı. ELISA ile yüzer GM-CSF konsantrasyonu belirlemek BMC ortamına 20 ng / ml eşdeğer ekleyin.
  2. 5 dakika boyunca 314 xg'de kemik iliği hücreleri aşağı doğru döndürün. pelet nedeniyle RBCs için, kırmızıdır. BSC, emme vakum dokunarak pelet gevşetin ve RBC parçalama tamponu 10 ml bağlanmış bir steril cam Pasteur pipet kullanılarak süpernatan aspire. Girdap hücreleri tekrar süspansiyon ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında RBC liziz tamponunda inkübe edilmesi.
  3. HBSS-FCS sonra 5 dakika boyunca 314 xg'de hücreleri dönmeye ve süpernatant aspire 10 ml ekleyin. beyaz renk olarak hücre pelet gözlemleyin. BMC ortamı istenen hacmi içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  4. resu Sayısı% 0.4 tripan mavisi ile ölü hücreleri boyandıktan sonra bir hemositometre kullanılarak spended hücreleri.
    NOT: Bir bacak (tek tibia ve femur) kemik iliği kullanılırsa, BMC ortam 5 ml içinde tekrar süspansiyon hücre süspansiyonu 10 ul alır ve mavi% 0.4 tripan 70 ul ile seyreltilmiş, iyice karıştırın ve 10 ul transfer hemositometre haznesine 1/8 hücre dilüsyonu. Dört çeyrek daireye canlı hücreleri saymak: dört kadran sayımı ortalama seyreltme faktörü x 10 4 = ml başına hücre sayısını x. RBC Parçalama işleminden sonra 4 x 10 7 hücre - Bir femur ve bir bacak bir tibia genellikle yaklaşık 2 verecektir.
  5. Kültür sonunda deneyler için gerekli olan toplam hücre sayısına göre alt deneyler için gerekli olan kemik iliği kültürleri 10 mi yemekler kestirilebilir.
    NOT: Her yemeğin 2 x 10 6 kemik iliği ilk tohumlama hücreleri ve verimleri 5 gerektirir - 7. günde 10 x 10 6 hücre.
    1. Ali5 dakika boyunca 314 x g hızında aşağı spin, yeni bir tüp içine kaplama hücrelerin toplam sayısı quot süpernatan aspire ve BMC medya 4 x 10 6 hücre / ml'de tekrar süspansiyon hücreleri.
  6. BMC ortamı 9.5 ml GM-CSF (rekombinant ya da süpernatan içeren GM-CSF ile ilgili), 200 ng içeren yeni bir steril 100 mm x 15 mm Petri kabı hazırlanır. 10 ml, 2 x 10 5 hücre / ml nihai konsantrasyon için Petri kabı merkezine 4 x 10 6 hücre / mL, kemik iliği hücrelerinin 500 ul ekle.
    NOT: steril Petri kabı değil bir doku kültürü çanak kullanmak önemlidir. Hücreleri eklerken Ayrıca, hücreler merkezde konsantre kalmasını sağlamak ve tohumlama sonrası ve ortam değişiklikleri sırasında yemekleri rahatsızlığı en aza indirmek. 37 ° C'de ve% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. Bu kültürde gün 0'dır.
  7. 3. günde, hücreler her bir tabak için, GM-CSF, 200 ng içeren taze BMC, 10 mL ortam ilave edin. rahatsızlık o en aza indirmek için özensüspansiyon içinde konsantre hücre f. Hücre kültürünün toplam hacmi artık 20 ml'dir.
  8. 100X büyütmede ışık mikroskobu altında hücreleri gözlemleyin. Çok sayıda yapışmaz hücreler (yuvarlak) ve birkaç yapışık hücrelere (düz) dikkat edin. Bir çiçeğin üç ya da dört benzer yaprakları gruplarda hücre proliferasyon gösteren görülebilir.
  9. 6. günde bir buçuk medya değişikliğini gerçekleştirmek. Dikkatle 5 dakika, aspirat için 314 xg aşağı spin, steril 50 ml konik tüp içine medya 10 ml kaldırmak ve supernatant atın.
  10. GM-CSF, yavaşça girdap ve 20 ml toplam hacim için orijinal hücre kültür çanağı ekle 20 ng / ml ihtiva eden taze ortam, BMC, 10 ml hücre pelletini. mikroskop altında hücreleri gözlemleyin.
    NOT: Günlük 7 kültür% 70 olması ya da yapışık yassı hücreler ve yuvarlak yapışmayan hücrelerin yoğun bulutlar confluency daha fazla olmalıdır.

3. Toplama ve Akış Sitometri için BMDC ve BMDMs hazırlama

    <li> 4 ° C'de tüm tamponları tutun.
  1. hücreler, 50 ml'lik konik bir toplama tüpüne kültür süpernatanının ilk transfer 10 mi hasat için günde 10 gün 7 hücreleri hasat, daha sonra yaklaşık 30 derece dikey çanak eğilme ve kalan 10 ml pipetleme bulaşık yıkama çanak üst kültürü. Bu yıkama 5 kez, üçte bir oranında çanak dönen her zaman tekrarlayın.
  2. Aynı toplama tüpüne hücrelerin kalan 10 ml aktarın ve plaka ve yapışık hücreleri atın.
    NOT: yıkar yapışmayan ve gevşek yapışmış olan hücrelerin kaldıracaktır; Düz yapışmayan hücreler yıkama dayanıklıdır. Tipik olarak, 5 ila - 10 x 10 6 yapışmayan hücreler gün 7 ve 2 de bir plaka beklenen -, 10. günde 5 x 10 6 hücre Lutz ve ark, ancak. 10. günde bildirilmiştir 10 x 10 6 hücre yapışan hücreler, normal olarak alınmamıştır. Bununla birlikte, bu hücreler, gerekirse yapışmayan hücreler ile karşılaştırıldığında gerekenaşağıdaki gibi, çıkarılabilir. 1 x PBS, yapışmayan hücreler çıkarıldı sonra çanak pH 7.4 içinde 0.7 mM EDTA 5 ml, ayrı bir tüp içinde yapışmayan hücreler giderilmiş ve toplamak için yukarı ve aşağı 5 dakika, pipet için 37 ° C'de inkübe edin.
  3. 5 dakika boyunca 314 xg'de toplanan hücreleri aşağı spin ve süpernatant aspire. 4 ° C'de 5 ml steril BMC medyada süspanse, vorteks hafifçe karıştırın ve tripan mavi ve hemasitometre kullanarak saymak.
    NOT: 5 verecektir Her yemeğin - Bir gün 7 kültüründen 10 x 10 6 yapışmayan hücreler. Şu andan itibaren, 4 ° C'de tüm adımları uygulayın.
  4. Akış sitometrik analizi, 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüp içine 2 x 10 5 hücre her bir örnek için transferi için, her bir 4 ° C (1 x fosfat tamponlu tuzlu su, 2 mM EDTA ve% 2 sığır serum albümini) FACS tampon 300 ul örnek.
  5. 5 dakika boyunca 314 xg'de hücreleri aşağı Spin ve süpernatant aspire. bir görünür beyaz, opak pelet gözlemlemekTüpün alt.
  6. Etiketlenmemiş Fc reseptörü Ab 100 ul içinde süspanse hücreleri (miyelom hücre çizgisi üreten 2.4G2 kullan 1/10 süpernatant) Fc reseptörü bloke etmek ve 4 ° C de 20 dakika inkübe etmek. Daha sonra 5 dakika boyunca 314 xg'de hücreleri aşağı spin, her bir örnek, yavaşça girdap için FACS tampon 300 ul ekleyin ve süpernatant aspire.
  7. 0.2 ug / ml'de CD11c-PeCy7 100 ul içinde süspanse hücreleri, 0.25 mg / ml'de Gr1 Pasifik Mavi, 0.05 ug / ml'de MHC II-APC, ve FL-HA yaklaşık / mL 2 ug makrofajlar ve DCS tespit etmek.
    NOT: FL-HA floresein ve horoz tarak hiyalüronik asit sodyum tuzu kullanılarak evde hazırlanan önceden 21 nitelendirdi.
  8. Hücre yüzeyine bağlanmaya imkan vermek için, 4 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir. Her bir örnek FACS tampon 300 ul ekleyin, yavaşça girdap, sonra 4 ° C'de 5 dakika 314 xg'de hücreleri aşağı spin ve süpernatant aspire NOT:. Bio EğerFloresan-streptavidin ile 9 - tinylated antikorlar 3.8'de kullanılan, 3.8 tekrarlayın.
  9. karıştırın ve 5 dakika boyunca 314 xg'de hücreleri aşağı spin FACS tampon başka 300 ul, yavaşça girdap hücreleri yıkayın. Süpernatant aspire ve 0.1 içeren FACS tamponda 200 ul hücrelerin tekrar süspansiyon - cansız hücreleri etiketlemek için propidyum iyodür veya DAPI ml'si başına 0.2 ug. Hücreler artık akım sitometri analizi 22 için hazır.
    Sonuçları gör ve popülasyonların ayrıntılar için Şekil 3 ve hücreler nasıl kapı edildi: NOT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yöntemin en önemli adımları özetleyen bir akış şemasıdır, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kültür farklı zamanlarda, kemik iliği kültür yoğunluğu ve şekil Şekil 2'de gösterilmektedir. Gün 1' de hücreler küçük ve seyrek ama 3 gün cinsindendir orada daha fazla hücre, bazı büyük olan ve birkaç uymak başladı. 6. günde tarafından kesin bir yapışkan ve yapışkan parça (Şekil 2A) bulunmaktadır. Kültür 7. günde hasat edilebilir - gün 10 Şekil 2B mevcut CD11c + hücrelerinin daha yüksek bir yüzdesi 10 hasat öncesi gün 7 kültür olarak ayrılmış yapışkan olmayan yapışık hücre fraksiyonları gösterir. yapışık fraksiyon yapışmayan kısmını kaldırmak ışık yıkamadan sonra sol hücrelerden oluşur. Yapışmayan fraksiyon büyük dijital büyütülmüş im daha açık bir şekilde görülebilir bir dendritik morfolojik yapıdaki hücreleri için zenginleştirilmişŞekil 2B ilavelerde yaşları. Yapışmayan fraksiyon (gün 7 ve gün 10) çıkarıldıktan sonra, yukarıda tarif edildiği gibi, hücreler, sitometrisi temel hücre yüzey belirteçleri karşı floresan antikorlar ile işaretlendikten sonra akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Şekil 3 yapışmayan bir sitometrisi lekeleri Örnek akışını gösterir gün 7 ve 10. günde kültür fraksiyonu.

CD11c + ve üzerinde makrofajlar ve DC'lerin hem tanımlanması, kapısı Gr1 - hücrelerin boyutu ve canlı hücreleri (Şekil 3A ve B) ilk perdeleme sonra. Gün 7 kültürlerinde, CD11c + Gr1 - Nüfus yapışmayan hücre fraksiyonundan toplam canlı hücre tipik olarak 60 ila 70%, ve bu 10 gün (Şekil 3B) üzerinde% 90 ya da daha fazla arttırılır. CD11c + Gr1 - 7. günde ve 10. günde nüfusun MHCII ve FL-HA Bindi kullanılarak üç alt-grup halinde ayrılabilirng: MHC II orta / düşük FL-HA yüksek makrofajlar (P1) bağlayıcı, MHC II orta FL-HA olgunlaşmamış DCler içeren düşük (P2) hücreleri bağlayan ve MHC II yüksek FL-HA bağlayıcı düşük olgun DH'ler (P3) (Şekil 3C ve 18 referans ). 7. günde gözlenen FL-HA düşük MHC II düşük nüfus (P0) P1-P3 hücre 18 için progenitörlerin içeren gösterilmiştir. Bu popülasyon kültürünün başka olgunlaşma oluştu ima 10. günde belirgin değildir. Bu, aynı zamanda, bir makrofaj işaretleyici olarak kabul 10. Şekil 3B MerTK gösteren kültür CD11c hücrelerin daha büyük bir yüzdesi olarak günde P2 ve P3 DC popülasyonları biraz daha büyük bir çoğunluğu tarafından desteklenen yüksek hem makrofaj ifade edilir ve olgunlaşmamış DC popülasyonları (P1 ve P2), fakat olgun DH'ler (P3 hücreleri) daha düşük bir dereceye kadar ifade edilir. Özellikle, yapışık fraksiyonun analizi P0, P1 varlığını ortaya çıkarır veP2 popülasyonları, ancak P3 olgun DC popülasyon (veriler gösterilmemiştir). Böylece makrofajlar yapışkan ve yapışkan fraksiyonlar bulunur, ama sadece olgun DH'ler yapışmayan fraksiyonunda yer almaktadır.

Şekil 1
. Şekil 1: - bunlar başka deneyler, saflaştırılmış ya da FACS analizinde kullanılan kullanılmak üzere hasat edilir, 10 gün Yöntem temel adımlarını gösteren bir akış şemasını Birincil hücreler, kemik iliğinden hasat edilen kaplanmış ve 7 kültür içinde muhafaza edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Kemik İliği Hücreleri Türetilmiş GM-CSF mikroskopik incelenmesi. A) Hücre sayısı, morfoloji değişiklikleri ve tat yapışık ve yapışmayan kısımların çıkışında bir artış gösteren bir gün 1, 3 ve 6 kemik iliği kültürü. B) Sol panel gün 7 kemik iliği kültürü ve tipik hücre yoğunluğu göstermektedir. orta panel Day Yapışmayan fraksiyon ve sağ panel hasattan sonra 7 yapışmayan hücreler gösterir 7. Insets dijital dendritik morfolojiye sahip bu fraksiyonun hücre görüntü büyütülmüş günde hasat yapışmayan bölümünü göstermektedir. Beyaz ölçek çubuğu 50 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: Gün 7 ve gün 10 de, GM-CSF Kültür Örnek fenotipik yapışmayankültürden hücreler CD11c, Gr1, MHC II, FL-HA ve MerTK gün 7 veya 10. günde ve hücreler ilk önce. B hücrelerini canlı boyutuna kapı edildi akışı sitometri. A) kendi fenotip için analiz) bir gösterir etiketlenmiştir nüfus makrofaj ve dendritik hücreler içeren - CD11c ve GR1 (nötrofil / monosit işaretleyici) ile Geçitli hücrelerin arsa ve CD11c'nin + GR1 tanımlar. Bu nüfus, C) Yolluk olgun olmayan DH'lere (P2 alveoler makrofajlar gibi (P1) ayrılmasını göstermektedir bağlama MHCII ve FL-HA, akış sitometrisi grafiğini göstermektedir) ile Poon de tarif edildiği gibi), DCler (P3 olgun ve ark., 18. D) 7. günde ve 10. günde, (makrofajlar) P1 arasında P2 (olgunlaşmamış DC) ve P3 popülasyonları (DC'ler olgun) MerTK ifade karşılaştıran histogramlar bu figu büyük halini görmek için tıklayınızyeniden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, Lutz ve ark., 6 uyarlanmış olan bir tek bir fare kemik iliği kültürü GM-CSF türetilmiş makrofajlar ve DCS üretilmesi için bir yöntem sağlar. Bu kültürde olgunlaşmamış DC'lere ve makrofajlar olarak ayrılır bağlayıcı MHC II ifadesi ve FL-HA, daha önce zor olmuştur (Şekil 3C). Bu arada helft ve ark., 19 başka rapor ile, daha önce sadece DC'ler olduğu düşünülen GM-CSF kaynaklı BMDC kültürlerin içinde heterojeniteyi göstermektedir. Helft ve ark., 19 de henüz belirgin bir makrofaj nüfus bulundu BMDCs oluşturmak için oldukça farklı kültür koşullarını kullanılır. GM-CSF kaynaklı makrofajlar makrofajların benzeyen ve FLT3 ligandı takviye BMDC kültürleri klasik ve plazmositoid DC'lerin 3,4 üretmek ise GM-CSF kaynaklı DH'ler, inflamatuar DC'ler benzerler. Farklı DC ve makrofaj popülasyonları da in vivo un gözlenmektedirhomeostatik ve enflamatuar durumların der ve DC ve makrofaj 10 tanımlar ne gibi alanında pek çok tartışma var. Monosit türetilmiş enflamatuar DCler gelir ve bu da, bu BMC ilgili olduğunda bu durum özellikle geçerlidir. Belirli bir nüfus karakterize etmek için birden fazla fenotipik işaretleyiciler fonksiyonel veriler, ve büyük olasılıkla gen ekspresyon verileri kullanmak oldukça önemlidir. In vitro olarak DC ve makrofaj popülasyonu alt bölünmüş daha işlevsel ve fenotipik işaretleyiciler olarak keşfedilen fazla olabilir da mümkündür.

Bu yöntemde, belirteçler CD11c Gr1, MHC II ve FL-HA BMC kültür Yapışmayan fraksiyon olgunlaşmamış ve olgunlaşmış dendritik hücrelerin makrofajlar ayırt etmek için kullanılır. Bu olgun DH'ler bir makrofaj popülasyonu ayırt etmede CD11c kullanılan helft ve ark., 19, CD11b, CD115, CD135, MerTK ve MHC II farklıdır. MerTK ekspresyon seviyeleri distinguis olabilirmakrofajlar ile H (P1) ve DCS (P3) olgun ama olgun olmayan DH'ler (P2) (Şekil 3B). Böylece FL-HA ve MHC II olgunlaşmamış ve olgun DC nüfus hem makrofajlar ayırt etmek kullanışlı göstergeleridir. Bu makrofajlar Bu BMC kültüründe DCS işlevsel farklıdır ve başka bir yerde, 18 daha ayrıntılı olarak gösterilmektedir. Kısaca, LPS uyarıldıktan sonra BMC makrofajlar olgun DCler farklı sitokinler üretmek ve naif T hücrelerini aktive 18 yok. TNF-α LPS stimülasyonu üretmek henüz naif T hücrelerini aktive 18 edemiyoruz sonra bu makrofajlar de yakından hem bağlama FL-HA hem fenotipik ve fonksiyonel, makrofajların benzeyen ve CD11c, MerTK, CD200R, CD206 ve F4 / 80 ifade ve. Ancak, aynı zamanda farklılıklar vardır: BMC makrofajlar CD11b + ve bu hücrelerin düşündüren, ex-vivo alveoler makrofajlar kıyasla Siglec F düzeyi düşük olan benzer fakat tanımladı değilAlveoler makrofajlar cal.

Bu protokolün başarı sağlamak için birkaç önemli adımlar vardır. Itibaren kemik iliği açığa gelen kısırlık korumak için çok önemlidir. ve BSC dışına taşırken, eldivenli elleri ve% 70 etanol ile nesneleri sprey. o sterilize etmek için% 70 etanol araçları durulama yararlı olmasına rağmen araçlar, hava-kurutun ve etanol onlarla temas kemikleri veya hücreleri getirmeden önce buharlaştı sağlamak, böylece, etanol, kemik iliği hücrelerine toksiktir. Buna ek olarak, kemik iliği hasat sırasında steril olmayan ekipman veya elleri ile fare doku ve hücrelerinin temas kaçının. penisilin ve streptomisin ilave ortam sağlanan, ancak, hücrelerin dikkatsiz kullanım maya veya mantar kirlenmeye yol açabilir. fagositik aktivite ile bağışıklık hücreleri bu kültürde üretilen bu yana ek olarak, küçük kirlilik sadece mikroskobik hücre kültürü gözlemleyerek tespit edilemeyebilir, böylece önemli t tespit etmektiro kontaminasyon imzalar. Örneğin, hücre sayısı azaltılabilir ve akış sitometrisi ile analiz edildiğinde CD40 ve CD86 gibi hücre aktivasyon markerlerinin ifadesi arttırılabilir. Medya rengi de kirlenme nedeniyle pH değişikliği yansıtan sarı dönüşebilir. kirlenme meydana geldiğinde, BMC kültür kullanılamaz. Deneysel tutarlılığı korumak için, vorteks ile kemik iliğinden tek bir hücre süspansiyonu üretmek ve BMC kültürleri kurmak için doğru bir hücre sayısını elde etmek için önemlidir. kemikten herhangi bağ dokusu tek bir hücre süspansiyonu biter Ayrıca, eğer, bunu kaldırmak için steril bir 70 mikron filtre ile filtre. 10 x 10 6 hücre - 7. günde yapışmayan fraksiyonunun bir plaka için normal hücre verimi 5 arasındadır. Hücre sayıları genellikle protokol de çalıştığını iyi bir göstergesidir. Lutz 10 x 10 6 hücre raporları ise, günde 10 6 10 x 5 hücre - Bu prosedür ile biz genellikle 2 ila edinin. Biz th RBC lizis gerçekleştirmekLutz ve ark protokolü ise E başlangıç ​​kemik iliği hücreleri. değil ve bu yüzden bu adım isteğe olabilir etmez. CD11c hücrelerinin yanısıra numaralarına makrofaj ve DH'lerin oranlarda yüzdesi olarak varyasyonlar değişik kökenli ya da FCS gruplar ortaya ve böylece tutarlı deney sonuçları BMC kültürlerinde FCS yeni toplu test etmek için çok önemlidir. GM-CSF ml 40 ng / ml, 5 ng / arasında değişiyordu, bu önemli ölçüde hücre verimi etkilemedi. Hücre yoğunluğu da kültür olgunlaşmasını etkileyebilir. Örneğin, Helft ve diğ. Yüksek MHC II ifadesi 19, hücrelerin daha büyük bir yüzde üretilen 4 mi ortam içinde 1 x 10 7 hücre tohumlanır. Hücreler hasat zaman noktası, aynı zamanda yapışmayan fraksiyonunda popülasyonlarının yüzdesini etkileyebilir. Hücreler genellikle günler 7 arasında toplanan - 25-27 Ekim, ancak bazı çalışmalar günde 6 19,23,24 de BMCs toplamak. daha fazla hücre kültür BMCs gerekli iseAynı yoğunlukta 40 ml daha büyük, 150 mm x 15 mm Petri tabaklarda. Bu durumda, bir yarım hacmi ortam değiştirme yapılır iki gün 3 ve gün 6 (yani, çıkarılan ortam, hücreleri, aşağı döndürülmüştür ve 20 ng / ml rgm-CSF ile takviye edilmiş 20 ml taze ortam ile değiştirilir 20 mi). FL-HA BMC kültür olgunlaşmamış ve olgun DC'lerden makrofajlar ayırt etmek, birlikte MHCII ile, önemli bir ayıraç günün 7'de çanak başına 6 x 10 7 hücre - Bu plakalar genellikle 3 üretir. Yapıldığı Böylece bir kez, bu tür alveoler makrofajlar 18 veya BW5147 T hücreleri gibi yapısal HA bağlandığı bilinen hücreler üzerinde kullanılmak üzere FL-HA titre ve HA-engelleme CD44 antikoru kullanarak kendi özgünlüğünü teyit (KM-81, piyasada mevcut), etiketlenmemiş HA veya CD44 eksikliği olan bir hücre. CD11c - kültürde Gr1 + hücreleri olmayan HA bağlayıcı hücreler için bir iç kontrol ve bir floresan eksi bir kontrol (FMO) ya da CD44 eksikliği olan BMC kültürleri olarak işlev görebilir son derece hassas Batan önerilmektedirFL-HA bağlama kapının örn.

Deneyler heterojen kültürü kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak Gr1, MHC II ve HA bağlama DC veya floresan aktive hücre sınıflandırma ve CD11c sentezlenmesi göre antikor kaplı manyetik boncuklar 18 kullanarak, makrofaj popülasyonu için zenginleştirmek için tavsiye edilir. Olası deneyler akış sitometrisi ile aktivasyonun ve sitokin üretimi, T hücresi aktivasyon deneyleri veya ek karakterizasyonu ölçmek için LPS gibi Toll-benzeri reseptör agonistleri ile uyarılması. Örneğin, uyarım 8 veya 24 saat sonra, akış sitometrisi 18 de tarif edildiği gibi, sitokinler ve / veya CD40 ve CD86 gibi ko-stimülatör moleküllerinin yüzey etiketlemesi için hücre içi boyama ölçmek için kullanılabilir. Hücre içi sitokin etiketleme prosedürleri salgılanmasını engeller ve sitokin hücre içinde birikmesine olanak verir Brefeldin A, hücrelerin ön hazırlık gerektirmez. uzunlu içeren T hücresi aktivasyon deneyleri içinbir antijen Ding gibi bir antijen oluşturucu hücrenin OVA peptidi olarak saflaştırılmış makrofajlar olgunlaşmamış ise T hücrelerini aktive edecek 18 DCler olgun olmaz bağlama MHCII ve HA göre. Tek başına sıralama işlemi önemli tüm deneylerde negatif kontroller için yapım ölçüde dendritik hücreleri aktive olabileceğini belirtmek gerekir.

Herhangi bir in vitro yöntem ile olduğu gibi, avantaj ve dezavantajları in vivo veya ex vivo hücrelerinde ile karşılaştırıldığında vardır. Dezavantajı nitro türevi hücrelerde tam olarak taklit eden in vivo hücre ancak işlevsel ve biyokimyasal analiz imkan vermek için yeterli sayıda üretilebilir avantajı, çoğu zaman ex-vivo hücreleri ile değil, mümkün bir şey yok olmasıdır. makrofaj ve DC kimlik Bu yöntem gelecekteki araştırma önceden underappreciated hetero bir kültürden daha homojen hücre popülasyonlarının elde etmek için izin verirlışmaların. Bu, GM-CSF kültüründen saflaştınldı makrofajlar yakın akciğer 18 alınmış alveol makrofajlarının, benzer olarak, in vitro analizi için, alveolar makrofaj benzeri uygun bir kaynak sağlar. Örneğin, bu HA bağlayıcı makrofajlar alveol makrofaj işlevini değiştirmek ilaçlar için ekrana ve Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunun ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir. GM-CSF ve M-CSF, kemik iliğinden türetilmiş makrofaj nakli farelerde 28,29 pulmoner proteinozisli hafifletebilir son keşif göz önüne alındığında, GM-CSF kültürlerinden makrofajlar tanımlamak için bu yöntem bu önerilen tedavi etkinliğinin artmasına yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) (Hibe MOP-119503) ve Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Konseyi (NSERC) Kanada Enstitüleri tarafından finanse edildi. NSERC ayrıca YD yaz studentships desteklenen ve AA YD 4 yıllık dostluk ödülü British Columbia Üniversitesi (UBC) tarafından desteklenen, AA lisans öğrencisi yüksek lisans ödülü (CGS-M) ile CIHR tarafından desteklenmektedir. Biz Şekil 2'de görüntüler oluşturmak için kullanılan mikroskop ile yardım için Calvin Roskelley teşekkür ederiz. Biz de UBC Hayvan ve Sitometrisi Tesisleri destek kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flow Cytometer BD  LSR-II
Automated Inverted Microscope  Leica  DMI4000 B
Centrifuge  Thermo Fisher ST-40R
Biosafety Cabinet Nuaire NU-425-600
Syringe 1 ml BD 309659
26 1/2 Gauge Needle BD 305111
50 ml Conical Tube  Corning 357070 *Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml) Corning MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes Corning 352052
Dissection Tools Fine Science Tools  *Various  *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep 
Hemocytometer  Reichert 1490
Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish Corning 351029 *Falcon brand
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher 21985-023
Ammonium Chloride BDH BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1600-1
Brefeldin A Sigma B7651-5MG
EDTA Sigma E5134-1KG Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 16000-044
Hank's Balanced Salt Solution Thermo Fisher 14175-095 
HEPES Thermo Fisher 15630-080 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine Sigma G8540-100G
LPS Ultrapure Invivogen tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Thermo Fisher 11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x Thermo Fisher 15140-122
Potassium Phosphate Monobasic BDH BDH0268-500G
Potassium Chloride BDH BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF Peprotech 315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate  Sigma H5388-1G *Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640  Thermo Fisher 21870-076 No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using.
Sodium Chloride Fisher  5271-10  
Sodium Phosphate Dibasic Sigma 50876-1Kg
Sodium Pyruvate Sigma P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Fisher Bioreagents BP152-5
Trypan Blue Sigma T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant N/A N/A Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7 eBioscience 25-0114-82 Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450 eBioscience 48-5931-82 Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC eBioscience 17-5321-82 Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK Abcam BAF591 Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE eBioscience 12-4317-87
Propidium Iodide Sigma P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-5MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178, (8), 5245-5252 (2007).
  2. Lari, R., et al. Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and. Bone. 40, (2), 323-336 (2007).
  3. Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96, (9), 3029-3039 (2000).
  4. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175, (1), 189-195 (2005).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, (6), 1693-1702 (1992).
  6. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223, (1), 77-92 (1999).
  7. Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. J Immunol. 162, (1), 168-175 (1999).
  8. Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes. J Immunol Methods. 239, (1-2), 95-107 (2000).
  9. Brasel, K., et al. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 90, (9), 3781-3788 (1997).
  10. Segura, E., Amigorena, S. Inflammatory dendritic cells in mice and humans. Trends Immunol. 34, (9), 440-445 (2013).
  11. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, (5687), 1153-1157 (2004).
  12. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, (2), 179-189 (2006).
  13. Goodridge, H. S., et al. Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse. Nature. 472, (7344), 471-475 (2011).
  14. Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation. Nature. 510, (7505), 363-369 (2014).
  15. Vander Lugt, B., et al. Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation. Nat Immunol. 15, (2), 161-167 (2014).
  16. Shibata, Y., et al. GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1. Immunity. 15, (4), 557-567 (2001).
  17. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models. J Immunol. 188, (11), 5752-5765 (2012).
  18. Poon, G. F., et al. Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures. J Immunol. 195, (2), 632-642 (2015).
  19. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, (6), 1197-1211 (2015).
  20. Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. cells solicit their own help from T cells. J. Exp. Med. 183, (3), 891-899 (1996).
  21. de Belder, A. N., Wik, K. O. Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate. Carbohydr Res. 44, (2), 251-257 (1975).
  22. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).
  23. Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells. Immunology. 126, (4), 475-484 (2009).
  24. Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting. J Immunol. 188, (12), 5981-5989 (2012).
  25. Contreras, I., et al. Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions. PLoS Negl Trop Dis. 8, (9), (2014).
  26. Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid. J Immunol. 185, (10), 5915-5925 (2010).
  27. Grauer, O., et al. Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique. Histochem Cell Biol. 117, (4), 351-362 (2002).
  28. Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514, (7523), 450-454 (2014).
  29. Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6, (250), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats