代和GM-CSF的鉴定源性肺泡状巨噬细胞和树突状细胞从小鼠骨髓

1Microbiology and Immunology, University of British Columbia
Published 6/25/2016
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Immunology and Infection

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Dong, Y., Arif, A. A., Poon, G. F., Hardman, B., Dosanjh, M., Johnson, P. Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (112), e54194, doi:10.3791/54194 (2016).

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Abstract

巨噬细胞和树突状细胞(DC)是在组织和淋巴器官发挥抵御病原体是重要角色发现先天免疫细胞。然而,它们难以在足够数量的分离,以研究它们的详细,因此, 在体外模型已经制定出来。 体外骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞的培养物用于免疫学研究成熟的和有价值的方法。这里,描述了用于培养和使用该细胞因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的原代小鼠骨髓细胞的单培养识别两者的DC和巨噬细胞的方法。此协议是基于首先由Lutz 等人开发的既定程序。在1999年的骨髓来源的DC。培养是异质的,并且MHCII和荧光标记的透明质酸(FL-HA)是用来区分未成熟和成熟DC的巨噬细胞。这些GM-CSF巨噬细胞亲韦迪体外衍生的巨噬细胞可以非常类似于在两个表型和功能肺泡巨噬细胞的一个方便的来源。

Introduction

几个体外培养的方法已被描述,以产生骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),并使用一种或生长因子的组合骨髓衍生的DC(DC培养上清)。 BMDMs可以通过使用细胞巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)或GM-CSF 1,2-培养骨髓细胞生成。为DC培养上清,加入FLT3配体与骨髓培养产生了非粘附经典和浆的DC(CD11c的 / MHCII 和CD11c的LO,B220分别+)后的培养3,4- 9天。与此相反,后7至10天在培养与单独的GM-CSF 5,6-产生的非贴壁细胞,GM-CSF和IL-4 7,或GM-CSF和FLT3配体8,9-生成的BMDCs更密切类似的炎症的DC (CD11c的 MHCII +细胞CD11b)10。而这些在体外培养物被用于产生巨噬细胞或区议会,目前还不清楚,如果每一种文化产生了纯洁的人群。例如,虽然在GM-CSF培养贴壁细胞被描述为巨噬细胞5中 ,从相同的培养非粘附细胞用作树突6,11-13,与推定它们是均匀和任何观察到的变异性是由于发展14,15的不同阶段。此外,研究发现GM-CSF是用于体内 16,17肺泡巨噬细胞发展的一个重要的生长因子,并可以在体外用于生成肺泡状巨噬细胞16,17,18。

除了坚持,从GM-CSF治疗骨髓的文化产生巨噬细胞和DC的过程非常相似的异质性暗示可能GM-CSF骨髓文化中存在。这确实似乎是的情况下为两个论文报告BMDMs在BMDC培养物的非粘附部分的存在。在一个论文中,他们identifi编细胞的CD11c +,CD11b+ MHCII 中旬 ,MERTK +和CD115 +,它表示最密切相似肺泡巨噬细胞,不得不激活T细胞19的能力下降的基因表达特征的群体。使用MHCII和FL-HA的第二个文件,以便找出一个肺泡巨噬细胞样的人口(的CD11c +,MHCII 中/低 ,FL-HA 高点 ),这是由不成熟的不同(的CD11c +,MHCII 中旬 ,FL-HA 低点 )和成熟的DC(CD11c的+,MHCII ),这两个表型和功能18。这些论文都表明,GM-CSF BMDC文化是异质的,含有巨噬细胞和DC群表示从BMDC文化解读数据时,应采取照顾。

这个协议描述如何分离骨髓,培养骨髓细胞在GM-CSF,以及识别肺泡巨噬细胞样人口由在骨髓培养未成熟和成熟DC通过流式细胞术采用FL-HA结合和MHCII表达。这个过程是基于Lutz 等人 6的既定的程序,并能产生5 -在一个10毫升培养的第7天10×10 6个非贴壁细胞。培养是可用的从数天7到10和在7这提供了一种简单的方法来生长,并在大量隔离在体外肺泡状巨噬天产生巨噬细胞,未成熟和成熟DC,以及一些前体细胞的异质群体。

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Protocol

小鼠按照加拿大理事会关于道德的动物研究动物护理指南由不列颠哥伦比亚省的动物护理委员会的批准大学的程序进行安乐死。

1.获得从小鼠股骨和胫骨单细胞骨髓暂停

  1. 开关上的生物安全柜(BSC)之前15分钟开始的过程的吹扫柜内空气,并允许空气流稳定,用70%的乙醇,然后清洁/喷雾BSC表面。一切都保持无菌尽可能为协议的全部内容。不切非无菌条件下的骨头。
  2. 通过在70%乙醇中浸泡制备清扫工具(1对解剖剪,2对镊子的),汉克平衡盐溶液,用5%胎牛血清(HBSS-FCS),无菌培养皿中英寸(100毫米×15毫米),1-毫升注射器,26½表针,圆锥形收集管(15毫升或50毫升)中,并纸巾在BSC。
  3. 使用安乐死鼠标由该机构的动物研究伦理委员会批准的协议。带入BSC,放置在一个或两个纸巾顶部和喷雾用70%乙醇鼠标。
  4. 在BSC中,打开一个无菌培养皿无菌,等分试样10毫升HBSS-FCS的到基和1 - 2 ml至盖子。
  5. 放置在其朝上的背面胃鼠标和解除胸椎部分周围的皮肤与非优势手的手指。使用剪刀,使那里的皮肤被提起的切口。
  6. 持到切口的两端,一端与每个手和小心从背面到胃拉开周围鼠标皮肤,继续拉动直到在胃切口相遇的两端。
  7. 翻转朝上鼠标胃,并用一只手拉扯皮肤向下朝着腿的下半部分,保持拉回皮肤直至腿部被暴露。
  8. 按住鼠标向上的脚,减少跟腱踝关节上方,连接的肌肉韧带在用剪刀胫骨的下端脚。这从松动的腿骨脚下。
  9. 在保持腿由脚,切开肌肉和韧带用剪刀周围所有的膝关节在股骨的下端以从小腿断绝大腿肌肉。使用镊子轻轻一拉肌肉放松从腓骨和股骨的表面。注意不要割断股动脉,避免大量出血。
  10. 用一只手抓着脚,按下开剪刀在髋关节股骨上端,旋转腿,轻轻拉,同时用剪刀晋级决赛自由股骨从髋关节分离从主体的腿。
  11. 从这时开始,只持有与无菌镊子组织。紧握腿一端与拉断脚另一方。
    注:这应该不会需要太多的力量,作为连接韧带步骤削减1.9。可替代地,切只是其中骨融合脚踝上方的胫骨。
  12. 持通过用一种组镊子和胫骨和腓骨与另一个的近端股骨的远端的腿,小心弯曲膝关节将它们从股骨和髌骨分离的相反方向上的胫骨和腓骨。
  13. 使用镊子拔下来剩下的韧带和肌肉还连着小腿骨头。这里,取出腓骨带钳子结缔组织沿着它太小,被刷新为骨髓细胞。放置在倒置培养皿盖的清洗胫骨。
  14. 保持与一组镊子,并用另一个髌骨股骨下端,弯曲的关节除去的相反方向上的髌骨及周围组织。然后擦去剩余从股骨结缔组织;拉着他们走用镊子,并把它放在倒置的培养皿的盖子。丢弃髌骨。
  15. 重复1.7如果需要的话1.13与另一条腿 - 。转移骨头含有1毫升无菌HBSS-FCS运输如果需要1.6毫升离心管。
  16. 放置在倒置培养皿盖骨,用1 - 2毫升HBSS-FCS的,使用镊子清洁仍连接到胫骨和股骨的任何残留组织,然后骨骼转移至培​​养皿含有10ml HBSS-的基FCS。此外,清洁骨骼和用70%乙醇浸泡过的组织去除附着的肌肉组织。
  17. 用剪刀剪下每个骨骼的一半。局部用无菌保护盖培养皿同时削减,以确保骨头留在菜。可替代地,切割每个骨的端部,以允许冲洗在下一步骤。
  18. 连接到1毫升注射器的26½摹针,并从培养皿制定1毫升HBSS-FCS。插入针的前端到骨片的端部和排出来的骨髓细胞(骨骼内软红组织)。针插入头部骨和开口端的,直到所有的红色骨髓被除去。观察骨骼白色的。
  19. 通过注射器几次传骨髓任何可见团块以形成单细胞悬液。
  20. 丢弃冲洗骨头。用10毫升吸管很好混合细胞悬浮液并转移至收集管。用5毫升HBSS-FCS的冲洗培养皿一次可收集残余细胞的菜。细胞置于冰上。
    注意:如果存放2骨髓细胞悬浮液仍然是可行-在4℃下3小时。

2.电镀和培养骨髓细胞(骨髓细胞)

  1. 准备以下试剂和耗材。
    1. 通过在2毫摩尔Tris pH值7.2的终溶液制备0.84%氯化铵制备红细胞(RBC)溶胞缓冲液,然后通过0.2微米的过滤器过滤灭菌。
    2. 通过添加10%FCS,20mM的HEPES,1×非必需氨基酸,55#制备的BMC媒体181,M 2-巯基乙醇,50单位/ ml青霉素和链霉素,1mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺向RPMI培养基1640。
    3. 获得市售重组GM-CSF或使用的GM-CSF从与GM-CSF基因20转AG8.653骨髓瘤细胞含有上清液。确定GM-CSF的中通过ELISA上清液中的浓度为20纳克/毫升的等效添加到BMC介质。
  2. 降速骨髓细胞以314×g离心5分钟。粒料是红色的,由于红细胞​​。在BSC,使用连接到真空抽吸,通过敲击松开沉淀,然后加入10 mL RBC裂解缓冲液的无菌玻璃巴斯德吸管吸出上清液。涡旋悬浮细胞并在室温下在RBC裂解缓冲液孵育5分钟。
  3. 加入10毫升的HBSS-FCS,然后在314 xg离心旋转细胞5分钟,吸出上清液。观察细胞沉淀,为白色的颜色。重悬BMC媒体所需的音量细胞。
  4. 算上地区环境部门一道使用血球染色死细胞用0.4%台盼蓝后spended细胞。
    注意:如果使用从一条腿(单胫骨和股骨)的骨髓,悬浮在5毫升BMC媒体,取10微升细胞悬液与70微升0.4%台盼的稀释蓝色,拌匀转移10微升1/8细胞稀释到血细胞计数器室。计数存活的细胞在四个象限:四个象限计数的平均×稀释因子×10 4 =每毫升的细胞数。股骨和从一条腿胫骨通常会产生约2 - RBC裂解后4×10 7个细胞。
  5. 估计所需的基于在培养结束所需的实验的总细胞数下游实验骨髓培养10毫升餐具的数量。
    注意:各盘需要在最初的接种2×10 6个骨髓细胞和产量5 - 10×10 6个细胞在第7天。
    1. 阿里QUOT细胞的总数为镀到一个新的管中,在314 xg离心降速5分钟,吸出上清液,并在BMC媒体4×10 6个细胞/ ml重悬细胞。
  6. 准备一个新的无菌100毫米×15毫米的培养皿9.5 BMC介质毫升含200毫微克的GM-CSF(重组或从含有上清液GM-CSF)的。加入500微升4×10 6个细胞/ ml的骨髓细胞的培养皿的中心为2×10 5个细胞/ ml在10ml的终浓度。
    注意 :要使用无菌培养皿不是一个组织培养皿中是很重要的。此外,加入细胞时,细胞确保在中心仍然集中和播种之后,并在媒体的变化最小化干扰的菜肴。孵育细胞在37℃和5%的CO 2。这是在培养0天。
  7. 在第3天,加入10毫升含200毫微克的GM-CSF的细胞的每道菜新鲜BMC介质。请注意,以尽量减少干扰Ø˚F浓缩悬浮液中的细胞。细胞培养物的总体积现在是20毫升
  8. 观察放大100倍的光学显微镜下的细胞。观察大量非贴壁细胞(圆形)以及几个贴壁细胞(平)。在花的三个或四个类似瓣组细胞可以看出,指示增殖。
  9. 在第6天进行一半媒体的变化。小心取出的10ml媒体到无菌50ml锥形管中,在314 XG降速5分钟,吸弃上清。
  10. 重悬细胞沉淀在10ml含有20纳克/毫升GM-CSF,轻轻涡旋并添加到原始细胞培养皿为20ml的总体积的新鲜的BMC介质。观察在显微镜下的细胞。
    注:第7天培养应在70%以上在汇合粘连扁平细胞和圆形非粘附细胞的稠密云。

3.收集和准备BMDC和BMDMs的流式细胞仪

    <李>保持所有的缓冲区,在4℃。
  1. 收获从第7天的细胞,第10天为收获细胞,将培养物上清液先将10毫升至50毫升的锥形收集管中,然后通过大约30度垂直地倾斜的菜,吹打其余10 1ml洗涤餐具从盘顶部的文化。重复此洗涤5次,每次由三分之一转动盘。
  2. 传输剩余的10萃取池的到同一收集管并弃去板和贴壁细胞。
    注:洗涤将除去非粘附和松散粘附的细胞;平贴壁细胞是对洗涤抗性。通常情况下,在5 - 10×10 6个非粘附细胞从一个板预期在第7天与2 -在第10天5×10 6个细胞,虽然Lutz 等人 。报告了10×10 6细胞在第10天的贴壁细胞通常不采取。然而,如果这些细胞需要进行比较,以非贴壁细胞,它们可以如下除去。添加5毫升0.7毫摩尔EDTA的在1×PBS中,pH为7.4至非贴壁细胞被除去后的盘,孵育在37℃下5分钟,吸液管上下以除去粘附的细胞,并收集在一个单独的试管中。
  3. 降速收集的细胞在314×g离心5分钟,吸出上清液。悬浮在5毫升无菌BMC媒体在4°C,涡轻轻混合,并用台盼蓝和血球计数。
    注意:每个培养皿将产生5 - 10×10 6个非粘附细胞从第7天培养。从现在起,执行4℃的所有步骤。
  4. 对于流式细胞仪分析,转印每个样品2×10 5个细胞到5毫升聚苯乙烯圆底管,在4℃下(1×磷酸盐缓冲盐水,2毫摩尔EDTA和2%牛血清白蛋白)中添加300μl的FACS缓冲液中向每个样品。
  5. 旋转细胞向下在314×g离心5分钟,吸出上清液。观察在可见白色的,不透明的粒料管的底部。
  6. 在100μl未标记Fc受体Ab的悬浮细胞阻断Fc受体结合(从2.4G2产生骨髓瘤细胞系使用1/10上清液),并在4℃下孵育20分钟。然后加入300μl的FACS缓冲液中向每个样品,轻轻涡旋,然后旋细胞向下在314×g离心5分钟,吸出上清液。
  7. 悬浮细胞在100μl的CD11c-PeCy7的0.2微克/毫升,Gr1的太平洋蓝0.25微克/毫升,MHCII-APC在0.05微克/毫升,和FL-HA在大约2微克/毫升,以确定巨噬细胞和树突状。
    注:FL-HA用荧光素和鸡冠的透明质酸钠盐在室内制备如前所述21。
  8. 孵育20分钟,在4℃下,以允许结合到细胞表面。添加300μl的FACS缓冲液中向每个样品,轻轻涡旋,然后旋细胞向下在314×g离心5分钟,在4℃,吸出上清液。注意:如果生物tinylated抗体在3.8时,重复3.8 - 9与荧光链霉。
  9. 洗涤细胞与另一300μl的FACS缓冲液中,轻轻涡旋混合并在314 xg离心降速细胞5分钟。吸出上清液并悬浮细胞在200μl含有0.1 FACS缓冲液 - 每ml碘化丙锭或DAPI 0.2微克到标签不能存活的细胞。细胞现在准备流式细胞仪分析22。
    注:参见结果与图3为群体的细节和细胞如何门控。

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Representative Results

总结了该方法的主要步骤的流程图如图1所示。在培养的不同时间的骨髓培养物密度和形态在图2中示出。在第1天,将细胞小和稀疏,用3天有更多的细胞,一些较大和一些已开始附着。第6天有一定的粘附和非粘附部分( 图2A)。培养可以从第7天收获- 10与存在于第10天。图2B的CD11c +细胞的比例更高示收获前一天7培养,以及将分离的贴壁和非贴壁细胞级分。粘附组分包括光洗涤该除去非粘附级分后剩下的细胞。非粘附部分被大大富集细胞与树枝状形态,其可以在数字放大即时更清楚地看出年龄在图2B中的插图。一旦非粘附部分被去除(第7天或第10天),将细胞通过流式细胞用抗关键细胞表面标志物的荧光抗体标记后术分析,如上所述, 图3示出了代表流式细胞非粘附的曲线在第7天与10日文化的一部分。

为确定两个巨噬细胞和DC的,门上的CD11c +和Gr1的-细胞大小和活细胞( 图3A 和B)第一门控后。在第7天培养物,该表面CD11c + Gr1的-人口中的非粘附细胞级分是总活细胞的通常为60%至70%,这是提高到90%或更多在第10天( 图3B)。所述的CD11c + Gr1的-在第7天及10日人口可分为使用MHCII和FL-HA宾迪三个主要子集NG:MHCII 中/低 FL-HA结合巨噬细胞(P1),MHCII 中旬 FL-HA结合 (P2)细胞中的未成熟DC,和MHCII FL-HA结合成熟DC(P3)( 图3C和参考18 )。在FL-HA ,MHCII 在第7天观察到的人口(P0)已被证明含有为P1到P3细胞18祖细胞。这一人群不是在第10天明显暗示发生了培养的进一步成熟。这也由CD11c的细胞的培养液中的较大百分比,以及在一天的P2和P3 DC群的略微更高的百分比。 图3D示出MERTK,认为是一种巨噬细胞标记支承,在两个巨噬细胞中高度表达和未成熟DC群体(P1和P2),但表示对成熟DC(P3细胞)程度较低。值得注意的是,粘附级分的分析揭示了P0,P1的存在和P2人群,但不是P3成熟DC群(未示出数据)。因此巨噬细胞是存在于贴壁和非贴壁部分,但只有成熟DCs存在于非粘附部分。

图1
图1:流程图表示的方法的主要步骤的原代细胞是从骨髓中收获的,电镀,在培养保持7 - 10天的时间,他们收获在进一步的实验中,纯化的或在FACS分析中使用的使用。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2: 衍生骨髓细胞GM-CSF镜检。一个) 骨髓培养物在1天,3,和6表示细胞数,在形态变化,和不同的粘附和非粘附的级分的出现而增加。 B)左侧面板显示的第7天骨髓的文化和典型的细胞密度。中间面板显示当天非粘附部分和右面板的收获后7贴壁细胞显示在一天收获的非粘附部分7.插图被数字在该馏分与树枝状形态放大细胞图像。白色的比例尺条为50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:在7日和10日的GM-CSF文化代表表型非粘附从培养细胞的标记的CD11c,Gr1的,MHCII,FL-HA和MERTK在第7天或第10天通过流式细胞仪。A)其表型细胞首先选通大小,然后活细胞; B分析显示门控细胞的CD11c和Gr1的(中性粒细胞/单核细胞标记物)的情节和标识的CD11c + Gr1的-人口含有巨噬细胞和树突状细胞。在这个人群中,C)的选通显示MHCII和FL-HA结合,这表明从不成熟DC(P2肺泡状巨噬细胞(P1)的分离的流式细胞仪曲线)和成熟的DC(P3),如在潘描述 18 D)柱状图在7天和10天之间P1比较MERTK表达式(巨噬细胞),P2(未成熟DC)和P3群体(成熟DC) 请点击这里查看此figu的放大版本回覆。

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Discussion

在这个手稿,我们提供了从正在从Lutz 等人6适于单个小鼠骨髓培养产生的GM-CSF衍生的巨噬细胞和DC的方法。 MHCII表达和FL-HA结合未成熟DC和巨噬细胞区分在这种文化中( 见图3C),而此前已经很难。这一点,与Helft 19另一份报告,都表明以前被认为只的DC GM-CSF诱导BMDC文化中的异质性。 Helft 19用完全不同的培养条件下产生的BMDCs但也发现了显著巨噬细胞群。 GM-CSF诱导巨噬细胞类似于肺泡巨噬细胞和GM-CSF诱导的DC类似炎症的DC,而FLT3配体补充BMDC文化产生经典和浆的DC 3,4。不同的DC和巨噬细胞群体在体内未还观察明镜稳态和炎性病症,并且在该领域,以什么限定了DC和巨噬细胞10的讨论。当涉及到单核细胞衍生的炎性DC和这也是在本BMC相关,这是特别真实的。它是使用几个表型标记,功能数据,和可能的基因表达数据来表征一个特定人口重要的。它也可能是这些体外 DC和巨噬细胞群体可以进一步细分为多个功能和表型标记被发现。

在该方法中,标记的CD11c,Gr1的,MHCII,和FL-HA被用于区分从未成熟和成熟树突细胞巨噬细胞在BMC培养的非粘附部分。这是Helft 19,谁使用标记的CD11c,CD11b的,CD115,CD135,MERTK和MHCII不同,从成熟DC区别巨噬细胞群。 MERTK表达水平可能distinguis(P1)和成熟的DC(P3)的巨噬细胞之间小时,但不未成熟DC(P2)( 图3D)。因此,FL-HA和MHCII是有用的标记来区分来自未成熟和成熟DC群的巨噬细胞。这些巨噬细胞也可从区议会功能不同在这BMC的文化,这是体现在更详细的其他地方18。简单地说,LPS刺激后巨噬细胞BMC产生不同的细胞因子比成熟DC和不激活幼稚T细胞18。这些巨噬细胞也酷似肺泡巨噬细胞,这两种表型和功能上既是结合FL-HA和表达的CD11c,MERTK,CD200R,CD206和F4 / 80和LPS刺激产生TNF-α后还无法激活幼稚T细胞18。然而,也有不同之处:BMC的巨噬细胞是细胞CD11b +和相比离体肺泡巨噬细胞具有的Siglec F的下水平,提示这些细胞相似但不鉴定CAL到肺泡巨噬细胞。

还有,以确保该协议的成功的几个重要步骤。从开始曝光骨髓保持无菌是很重要的。当移动进出BSC的,喷戴手套的手并用70%的乙醇的对象。虽然是有帮助的漂洗在70%的乙醇的工具来消毒,乙醇是有毒的骨髓细胞,所以风干的工具,并确保使骨骼或细胞与它们接触之前的乙醇蒸发。此外,避免骨髓收获期间非无菌设备或手接触鼠标的组织或细胞。虽然青霉素和链霉素补充在媒体被提供,该细胞的不小心处理可能导致酵母或真菌的污染。另外,由于免疫细胞与吞噬活性在该培养中产生,轻微污染可能无法通过简单地观察细胞培养显微镜检测,因而是重要的识别吨他签署的污染。例如,细胞数目可以减少,并且当通过流式细胞术分析可以增加的细胞活化标记如CD40和CD86的表达。媒体颜色也变黄反映因污染pH变化。当污染发生时,BMC文化是不可用的。为了保持试验的一致性,这是重要的,以产生从通过涡旋骨髓单细胞悬浮液,将获得一个精确的细胞计数以设置BMC培养物。此外,如果从骨的任何结缔组织中的单细胞悬液最终,通过无菌70微米的过滤器过滤以除去它。对于非粘附部分的一个板典型细胞产量在第7天5之间- 10×10 6个细胞。手机号码通常是一个很好的迹象,该协议运作良好。与此过程,我们通常得到介于2 -细胞在第10天6 5×10,而鲁兹报告10×10 6个细胞。我们在执行第RBC裂解Ë最初的骨髓细胞,而由Lutz 等人的协议。不因此该步骤可以是可选的。在CD11c的细胞以及数字和巨噬细胞和DC的比例的百分之变化可以从不同的来源或FCS的批次出现,因此,关键是要在BMC培养物一致的实验结果进行测试的FCS的新的批次。 GM-CSF的浓度从5纳克/毫升变化到40毫微克/毫升,这并没有显著影响细胞产量。细胞密度也可影响培养的成熟。例如,Helft 。接种1×10 7个细胞,其中产生的细胞的高MHCII表达19有较大百分比4毫升介质。当收获细胞的时间点也可影响存在于非粘附部分种群的百分比。细胞通常收集天7在- 10 25-27日 ,但一些研究收集在第6天19,23,24骨髓细胞。如果需要更多的细胞,培养骨髓细胞在40毫升的相同的密度较大150毫米×15毫米的培养皿中。在这种情况下,一个半体积媒体变化上完成两天3和第6天(即 20毫升去除培养基,将细胞离心下来,用补充有20毫微克/毫升RGM-CSF的新鲜20毫升培养基替换)。这些板块通常会产生3 - 6×10 7每盘细胞在7天FL-HA是一个重要的试剂,与MHCII一起,从BMC文化不成熟,成熟DC区别巨噬细胞。因此一旦它被制成,滴定在FL-HA上使用公知的组成型结合的HA的细胞,如肺泡巨噬细胞18或BW5147的T细胞,并使用任一个的HA-阻断CD44抗体证实了其特异性(KM-81,商购),未标记的HA或CD44缺陷细胞。的CD11c -的Gr1 +细胞的培养可以作为内部对照的非HA-结合的细胞,并在荧光减一控制(FMO)或CD44的缺陷BMC文化功能是高度推荐的精确设置搜索克FL-HA结合大门。

尽管可以使用非均相培养来进行的实验中,最好是富集的DC或用任一荧光激活细胞分选或根据CD11c的表达抗体包被的磁珠18巨噬细胞群,Gr1的,MHCII,和HA结合。可能实验包括Toll样受体激动剂,例如脂多糖以测量活化和细胞因子产生,T细胞活化测定法,或附加的表征通过流式细胞术刺激。例如,刺激后的8或24小时,流式细胞仪可用于测量细胞因子和/或共刺激分子如CD40和CD86的表面标记细胞内染色,如在18中所述。细胞内细胞因子标记程序要求用布雷菲德菌素A,其阻止分泌,并允许细胞因子建立的细胞内的细胞的预处理。对于涉及洛阿T细胞活化测定法抗原丁诸如通过抗原呈递细胞的OVA肽,纯化的巨噬细胞的基础上MHCII和HA结合不会激活T细胞,而未成熟和成熟的DC将18。应当注意的是,仅在排序过程可激活树突状细胞在一定程度上,使得它必须包括在所有实验中的阴性对照。

如同任何的体外方法,有优点和缺点与使用在体内离体细胞。的缺点是, 在体外的细胞可能不会完全模拟体内细胞,但它们具有它们能在足够数目的生成,以允许功能和生化分析的优点,而这是经常与离体细胞是不可行的。巨噬细胞和DC识别这种方法将使未来的研究从文化与此前被低估的异质获得更均匀的细胞群均质性。如从该GM-CSF的培养物中纯化的巨噬细胞从肺18酷似肺泡巨噬细胞,它提供了用于在体外分析肺泡状巨噬细胞的一个方便的来源。例如,这些HA结合的巨噬细胞可用于筛选修改肺泡巨噬细胞功能的药物,并调查结核分枝杆菌感染和耐药机制。鉴于最近的发现,即GM-CSF和M-CSF骨髓移植的巨噬细胞可缓解小鼠肺28,29蛋白沉积,此方法从GM-CSF培养检测巨噬细胞可能有助于提高这一提议治疗的疗效。

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Acknowledgements

这项工作是由卫生研究院(CIHR)(批准MOP-119503)和加拿大自然科学与工程理事会(NSERC)的加拿大学院资助。 NSERC还支持夏季助学金为YD和AA YD是由英属哥伦比亚大学(UBC)大学用4年的奖学金奖励支持,AA由CIHR与研究生硕士奖(CGS-M)的支持。我们感谢卡尔文Roskelley与用于生成图2中的图像在显微镜的帮助。我们也承认从UBC动物和流式细胞仪设备的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flow Cytometer BD  LSR-II
Automated Inverted Microscope  Leica  DMI4000 B
Centrifuge  Thermo Fisher ST-40R
Biosafety Cabinet Nuaire NU-425-600
Syringe 1 ml BD 309659
26 1/2 Gauge Needle BD 305111
50 ml Conical Tube  Corning 357070 *Falcon brand
Eppendorf tubes (1.5 ml) Corning MCT-150-C
5 ml polystyrene round bottomed tubes Corning 352052
Dissection Tools Fine Science Tools  *Various  *Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep 
Hemocytometer  Reichert 1490
Sterile 100 mm x 15 mm Petri Dish Corning 351029 *Falcon brand
2-Mercaptoethanol Thermo Fisher 21985-023
Ammonium Chloride BDH BDH0208-500G
Bovine Serum Albumin Fisher Bioreagents BP1600-1
Brefeldin A Sigma B7651-5MG
EDTA Sigma E5134-1KG Ethylenediaminetetraacetic acid
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 16000-044
Hank's Balanced Salt Solution Thermo Fisher 14175-095 
HEPES Thermo Fisher 15630-080 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
L-Glutamine Sigma G8540-100G
LPS Ultrapure Invivogen tlrl-3pelps
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Thermo Fisher 11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x Thermo Fisher 15140-122
Potassium Phosphate Monobasic BDH BDH0268-500G
Potassium Chloride BDH BDH9258-500G
Recombinant GM-CSF Peprotech 315-03-A
Rooster Comb Sodium Hyaluronate  Sigma H5388-1G *Used to make fluoresceinated hyaluronan
RPMI-1640  Thermo Fisher 21870-076 No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37 °C before using.
Sodium Chloride Fisher  5271-10  
Sodium Phosphate Dibasic Sigma 50876-1Kg
Sodium Pyruvate Sigma P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Fisher Bioreagents BP152-5
Trypan Blue Sigma T8154
Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant N/A N/A Clone: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7 eBioscience 25-0114-82 Clone: N418
Anti-Gr-1 efluor450 eBioscience 48-5931-82 Clone: RB6-8C5
Anti-MHCII APC eBioscience 17-5321-82 Clone: M5/114.15.2
Biotinylated Anti-MerTK Abcam BAF591 Goat polyclonal IgG
Streptavidin PE eBioscience 12-4317-87
Propidium Iodide Sigma P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-5MG

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References

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