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1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

Medicine

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Summary

मधुमेह अनुसंधान के क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण चुनौतियों आणविक तंत्र है कि आइलेट β-सेल प्रतिकृति को विनियमित करने और β-सेल पुनर्जनन उत्तेजक के लिए तरीकों को विकसित करने के लिए समझने के लिए कर रहे हैं। इस के साथ साथ एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग विधि की पहचान करने और आकलन छोटे अणुओं के β-सेल प्रतिकृति को बढ़ावा देने गतिविधि प्रस्तुत किया है।

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Zhao, Z., Abdolazimi, Y., Armstrong, N. A., Annes, J. P. A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform. J. Vis. Exp. (113), e54298, doi:10.3791/54298 (2016).

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Abstract

Introduction

मधुमेह बाधित ग्लूकोज homeostasis के आम अंत बिंदु बांटने के विकारों का एक संग्रह शामिल हैं। हालांकि मधुमेह उपप्रकार के रोगजनक तंत्र अलग कर रहे हैं, वे कम β-कोशिका द्रव्यमान है, यानी, इंसुलिन उत्पादन क्षमता 1,2 के नुकसान के परिणाम का हिस्सा है। वर्तमान में, मधुमेह उपचार रणनीतियों बहिर्जात इंसुलिन, इंसुलिन के उत्पादन या इंसुलिन के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि की pharmacologic उत्तेजना की पुरानी प्रशासन पर भरोसा करते हैं, और शायद ही कभी, अग्नाशय के टापू या पूरे अग्न्याशय 3,4 के प्रत्यारोपण। अफसोस, इन रणनीतियों की सफलता कम रहता है और / या पर्याप्त अंतर्जात इंसुलिन के उत्पादन के समारोह पुनरावृत्ति करने में विफल रहता। β-सेल पुनर्जनन को प्रोत्साहित करने के लिए एक विधि को विकसित करने की उपयोगिता के बावजूद, इस तरह का कोई दृष्टिकोण से मौजूद है। नतीजतन, एक प्रमुख मधुमेह अनुसंधान लक्ष्य तरीकों को विकसित करने के लिए नए-β कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए या अंतर्जात β-सेल जन 5 का विस्तार करने के लिए है 6.7 सहित वैकल्पिक रणनीतियों, का पीछा करते हैं। महत्वपूर्ण बात है, विवो में नए β-कोशिकाओं का प्रमुख स्रोत पूर्व मौजूदा विशेष पूर्वज कोशिकाओं 8,9 β-कोशिकाओं के बजाय है। हालांकि β कोशिकाओं सीमित प्रतिकृति क्षमता, β-सेल मास में एक छोटे से वृद्धि दिखाई देते हैं (~ 30%) कई मधुमेह रोगियों में ग्लूकोज homeostasis बहाल करने के लिए पर्याप्त हो सकता है। इसके अलावा, β-सेल मास के सीटू pharmacologic उत्तेजना में एक संभावित सस्ती और स्केलेबल उपचार की रणनीति है। इस के साथ साथ की पहचान करने और छोटे अणुओं है कि β-सेल के विकास को प्रोत्साहित निस्र्पक के लिए एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग विधि प्रस्तुत किया है।

इन विट्रो प्रयोगात्मक विधियों की एक किस्म जीन उत्पादों और / या अणुओं Tha की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैटी प्राथमिक β-सेल प्रतिकृति को बढ़ावा देने के। Β-सेल प्रतिकृति प्रेरण को मापने के लिए प्रारंभिक प्रयासों, भ्रूण कृंतक Pancreata संस्कृति या बरकरार पृथक आइलेट संस्कृतियों का इस्तेमाल किया विशेष उपचार की स्थिति में 10 के जवाब में [3 एच] thymidine निगमन, BrdU एल्डिहाइड-thionine या इंसुलिन दाग आबादी के भीतर समावेश या mitotic शव को मापने के लिए 11। ये इन विट्रो दृष्टिकोण और करीबी विविधताओं उसके कई सीमाएं हैं। प्रमुख तत्वों की कमी (1) भ्रूण कोशिकाओं जो, परिपक्व β-कोशिकाओं के विपरीत, एक उच्च बेसल β-सेल प्रतिकृति दर प्रदर्शित करने और एक अलग तरीके से 12 में विनियमित विकास कर रहे हैं का उपयोग शामिल है; (2) β-सेल प्रतिकृति घटनाओं के प्रयोगकर्ता निर्भर अधिनिर्णय के व्यक्तिपरक प्रकृति; (3) श्रम और β-सेल प्रतिकृति घटनाओं के प्रयोगकर्ता निर्भर मतगणना के समय गहन प्रकृति प्रयोगात्मक throughput अवरूद्ध; (4) परमाणु समावेश / दाग़ / उपस्थिति का उपयोग भी प्रतिकृति की पहचान करने के लिएटीएस और एक गैर अतिव्यापी cytoplasmic दाग β-कोशिकाओं की पहचान करने के लिए आसन्न गैर-β-सेल प्रतिकृति घटनाओं बीटा कोशिकाओं के misattribution की ओर जाता है।

अभी हाल ही में परिपक्व प्राथमिक β कोशिकाओं β-सेल प्रतिकृति 13-16 पर अधिक अभिव्यक्ति ट्रांस्जीन के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से जीन उत्पाद या यौगिक उपचार आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन अध्ययनों से यह भी प्रतिकृति घटनाओं, β-सेल पहचान और / या श्रम प्रधान कदम है कि throughput की सीमा है, जैसे, कोशिकाओं या बरकरार आइलेट के व्यक्तिगत स्लाइड अच्छी तरह से चढ़ाना के लिए cytoplasmic staining- या गैर विशिष्ट तरीके के व्यक्तिपरक गिनती पर भरोसा किया है आयल एम्बेडिंग और प्रसंस्करण के 17। विशेष रूप से, एक छवि के आधार पर मानव β-सेल प्रतिकृति स्क्रीनिंग पद्धति, इस के साथ साथ प्रस्तुत एक के समान, 18 प्रकाशित किया गया है; हालांकि, इस परख के सफल प्रयोग का प्रदर्शन नहीं किया गया है और प्राथमिक जांच के लिए मानव टापू के उपयोग के लिए मोटे तौर पर नहीं किया जा सकता FEAअसंभव।

प्रतिकृति को बढ़ावा देने पदार्थों की पहचान करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति β-सेल लाइनों के विकास प्रेरण का आकलन करने के लिए है। प्रारंभिक प्रयासों जैसे min6 कोशिकाओं या आईएनएस 832/13-कोशिकाओं का इस्तेमाल किया 14,19-21 तब्दील β सेल लाइनों। हालांकि, इन सेल लाइनों अनर्गल विकास का प्रदर्शन और अच्छी तरह से भेदभाव कर β-कोशिकाओं को 22 के लिए छोटे सादृश्य भालू। नतीजतन, विकास प्रेरण क्षमता, कम से कम अस्पष्ट प्रासंगिकता की और कभी कभी पुनरावृत्ति करना मुश्किल है। सेल लाइन आधारित स्क्रीनिंग के लिए एक बेहतर रणनीति कोशिकाओं है कि टेट्रासाइक्लिन (डॉक्सीसाइक्लिन) के अभाव में गिरफ्तार विकास निर्भर SV40 टी प्रतिजन अभिव्यक्ति 23,24 कर रहे हैं "reversibly तब्दील" इस्तेमाल करता है। हालांकि, यह इन कोशिकाओं को एक "सामान्य" β-सेल की तरह डॉक्सीसाइक्लिन हटाने पर राज्य को वापस है कि क्या स्पष्ट नहीं है। दुर्भाग्य से, इन कोशिकाओं के उपयोग सामान्यीकृत विकास को बढ़ावा देने यौगिकों कि तत्काल उपयोगिता है प्रकट नहीं करते प्राप्त हुए है24। कुल मिलाकर, सेल लाइनों का उपयोग एक सेल प्रकार न्यूनतम सहज प्रतिकृति गतिविधि को प्रदर्शित करने के विकास के विनियमन का अध्ययन करने के लिए सीमित प्रयोज्यता हो सकता है।

Β-सेल प्रतिकृति स्क्रीनिंग के साथ साथ प्रस्तुत मंच जहां तक संभव हो, वंश-प्रतिबंधित विकास को बढ़ावा देने की गतिविधियों की पहचान सकें मिश्रित सेल प्रकार की रचना आइलेट सेल संस्कृतियों, बहु को विवो विकास नियमन में बनाए रखने के लिए परिपक्व प्राथमिक चूहे β-कोशिकाओं का इस्तेमाल -अच्छी तरह पूर्वाग्रह को खत्म करने और throughput की सुविधा के लिए throughput और स्वचालित विश्लेषण अधिकतम करने के लिए स्वरूपण। इस मंच के सफल प्रयोग कई यौगिकों कि β-सेल प्रतिकृति 25,26 को बढ़ावा देने की पहचान के लिए सक्षम है। इसके अतिरिक्त, परख संरचना गतिविधि संबंध के अध्ययन और रासायनिक एपिस्टासिस प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है β-सेल प्रतिकृति की आणविक विनियमन में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। प्रस्तुत मंच सफलतापूर्वक के लिए अनुकूलित किया गया थाβ-सेल प्रतिकृति के आर lentiviral आरएनएआई आधारित जांच 25 रास्ते। परख की सीमाएं प्रतिबंधित scalability शामिल (प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग), बल्कि मानव आइलेट कोशिकाओं (हालांकि परख मानव आइलेट के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है), खर्च एंटीबॉडी आधारित इमेजिंग और प्राथमिक आइलेट उपयोग, उपयोग के साथ जुड़े से कृंतक का उपयोग बिखरे टापू (बाधित आइलेट आर्किटेक्चर) स्वचालित छवि अधिग्रहण और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण क्षमता के साथ एक स्वचालित माइक्रोस्कोप की उपलब्धता पर निर्भरता की सुविधा के लिए की। हालांकि जीन उत्पादों या यौगिकों कि बगल में β-सेल पुनर्जनन को प्रोत्साहित पहचान के लिए एक सतही इन विवो स्क्रीनिंग कार्यप्रणाली आदर्श होगा, इस तरह के एक मंच अभी तक उपलब्ध नहीं है 27। नतीजतन, वर्णित मंच β-सेल प्रतिकृति की सबसे पहलुओं की जांच में रुचि शोधकर्ता के लिए उपयुक्त है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन के साथ अनुसार किया जाता था। 300 ग्राम (8 - - 9 सप्ताह पुराना) पुरुष Sprague Dawley चूहों, जो आइलेट सेल प्रतिकृति मूल्यांकन के लिए एक 384 अच्छी तरह से थाली के 228 कुओं उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है वर्णित प्रोटोकॉल छह 250 से आइलेट अलगाव के लिए बढ़ाया है।

1. सामग्री तैयारी

  1. एक 15 सेमी टिशू कल्चर पकवान 28 में 804G चूहे मूत्राशय कार्सिनोमा 3 दिन के लिए संगम पर बनाए रखा कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया (RPMI1640 के 20 मिलीलीटर) को इकट्ठा करके आइलेट अलगाव की शुरुआत करने से पहले कोटिंग मीडिया तैयार करें। बाँझ फिल्टर और दुकान (-20 डिग्री सेल्सियस) बाद में उपयोग के लिए वातानुकूलित मीडिया।
  2. सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित (एक 12 सेमी दांतेदार ऊतक संदंश, एक 11.5 सेमी ठीक कैंची, एक 14.5 सेमी शल्य कैंची, दो 16 सेमी घुमावदार संदंश, एक 12 सेमी घुमावदार hemostat, एक 12 सेमी छुरी संभाल) और एक 30 जाल ऊतक चलनी init करने से पहलेआइलेट अलगाव iating।
  3. 1x हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 60 मिलीलीटर कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पूरक में - वर्ग द्वितीय collagenases (400,000 इकाइयों 300,000 की कुल collagenase गतिविधि): एक 60% भंग द्वारा अग्नाशय पाचन समाधान तैयार: शुद्ध वर्ग मैं का 40% मिश्रण। लोड एक 1 "22 जी सुई और बर्फ पर जगह के साथ 10 मिलीलीटर सीरिंज (छह) में अग्नाशय पाचन बफर के 10 मिलीलीटर।
    नोट: पाचन समाधान के 10 मिलीलीटर चूहे प्रति इंजेक्शन है। तदनुसार पैमाने।
  4. मिश्रण ketamine के 1.3 मिलीग्राम (100 मिलीग्राम / एमएल), xylazine की 0.2 मिलीग्राम (100 मिलीग्राम / एमएल) और पीबीएस के 3 मिलीग्राम से एक हवादार हुड में संवेदनाहारी कॉकटेल के 4.5 मिलीलीटर की तैयारी। आइलेट अलगाव की शुरुआत की 1 घंटा के भीतर संवेदनाहारी कॉकटेल तैयार करें।
  5. HBSS के 500 मिलीलीटर के लिए नवजात बछड़ा सीरम के 25 मिलीलीटर जोड़कर धो बफर तैयार करें। बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर धो बफर रखें।
  6. आइलेट माध्यम है जो कम ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 5 की 500 मिलीलीटर है की 1 बोतल तैयार0 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन की 5,000 इकाइयों / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन की 5000 माइक्रोग्राम / एमएल।
  7. कार्यक्षमता / व्यवहार्यता समाधान (500 मिलीलीटर) 2% FBS, 2 मिमी glutamine, 5 मिमी ग्लूकोज, पेनिसिलिन की 5,000 इकाइयों / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन की 5000 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ से आइलेट समारोह के माध्यम से तैयार। स्टोर बाद में उपयोग के लिए आइलेट समारोह मीडिया (4 डिग्री सेल्सियस)।
  8. 1x फॉस्फेट बफर खारा के 37.38 मिलीलीटर (पीबीएस) के लिए 2.5 मिलीलीटर गधा सीरम और 0.12 मिलीग्राम ट्राइटन X-100 जोड़कर बफर अवरुद्ध 40 मिलीलीटर की तैयारी। स्टोर अवरुद्ध बफर (4 डिग्री सेल्सियस) बाद में उपयोग के लिए।
  9. प्रोटोकॉल की शुरुआत करने से पहले आवश्यक एंटीबॉडी प्राप्त करते हैं।
    नोट: PDX-1 (TRITC) और की-67 (FITC) के सह-धुंधला प्राथमिक β-सेल प्रतिकृति स्क्रीनिंग के लिए प्रयोग किया जाता है। परमाणु (DAPI), PDX (Cy5) और की-67 (FITC) धुंधला के साथ-साथ, वंश विशेष प्रतिकृति विश्लेषण के लिए, अतिरिक्त सेल पहचान मार्कर (TRITC इंसुलिन, ग्लूकागन, vimentin या सोमेटोस्टैटिन) के लिए immunofluorescence धुंधला प्रदर्शन करते हैं। वैकल्पिक प्रतिनिधिlication मार्कर, जैसे, PCNA, भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  10. प्रत्येक उपचार के चार प्रतियों में प्रदर्शन शर्त के साथ एक 228-अच्छी तरह से उपचार योजना तैयार करें। (: 666 कमजोर पड़ने DMSO 1) कुओं positive- (5-Iodotubercidin [1 माइक्रोन] या dipyridamole [15 माइक्रोन के]) और वाहन नियंत्रण शामिल हैं।

2. अग्न्याशय का छिड़काव

  1. पतला संवेदनाहारी कॉकटेल समाधान (0.30 मिलीग्राम / 100 ग्राम शरीर के वजन) के आईपी इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize। एक बार चूहा पूरी तरह से anesthetized और हानिकारक उत्तेजनाओं के लिए अनुत्तरदायी है, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं।
  2. कागज तौलिया के ढेर पर लापरवाह स्थिति (कपाल दुम ओरिएंटेशन) में euthanized चूहे की जगह और स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ पेट क्षेत्र।
  3. एक यू-चीरा (जघन क्षेत्र के आधार पर) के साथ उदर गुहा खोलें और उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए सीने पर व्याख्यान चबूतरे दिशा में त्वचा वापस लेना।
  4. ध्यान से, ग्रहणी घुमावदार संदंश के दो जोड़े का उपयोग हड़पने आम बी के ग्रहणी प्रविष्टि का पता लगानेइले वाहिनी (Oddi की दबानेवाला यंत्र) और एक घुमावदार hemostat के साथ अंकुरक पर ग्रहणी उद्घाटन दबाना।
  5. घुमावदार आम पित्त नली अंकुरक दबाना और जिगर के करीब पित्त नली एक घुमावदार संदंश का उपयोग हड़पने के लिए इस्तेमाल किया hemostat लिफ्ट। अलग और पित्त नली का पर्दाफाश करने के लिए घुमावदार संदंश के साथ कुंद विच्छेदन का प्रयोग करें।
  6. सिर और पैर समीपस्थ बाहर का साथ चूहे का स्थान बदलें।
  7. एक अग्नाशय पाचन समाधान के साथ पित्ताशय और आम यकृत नलिकाओं का जंक्शन पर आम पित्त नली (सीबीडी) या सिर्फ बाहर का Cannulate 10 मिलीलीटर सिरिंज -loaded और धीरे धीरे अग्नाशय पाचन समाधान के 10 मिलीलीटर इंजेक्षन। इंजेक्शन लगाने जबकि, एक छुरी संभाल के साथ सीबीडी समर्थन करते हैं। सुई का स्थान बदलें यदि वाहिनी और अग्न्याशय बढ़ करने के लिए असफल।
  8. घुमावदार संदंश और ठीक कैंची का उपयोग उतरते पेट, आंतों, पेट और तिल्ली से अलग करने के लिए फुलाया अग्न्याशय निकालें। बर्फ पर फुलाया अग्न्याशय के 5 मिलीलीटर युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें नोट: अधिकतम आइलेट उपज के लिए, प्रत्येक 50 मिलीलीटर पाचन नली में 30 मिनट और जगह केवल 1 या 2 Pancreata के भीतर सभी Pancreata इकट्ठा।

3. अग्न्याशय की हदबंदी

  1. एक बार सभी Pancreata, एकत्र 15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पाचन ट्यूबों की जगह होते हैं। धीरे ट्यूबों हर 3 मिनट ज़ुल्फ़।
  2. 15 मिनट के बाद, सख्ती से हिला (खड़ी) नलियों में 10 बार और ठंड धो बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें। सख्ती ट्यूबों के एक अतिरिक्त 5 बार मिलाने और बर्फ पर जगह है।
  3. नलियों inverting 5 बार से ठंड धो बफर और मिश्रण के साथ 50 मिलीलीटर पाचन नलियों भरें।
  4. 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 97 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला टपकना। सावधान pelleted ऊतक को बेदखल करने के लिए नहीं हो सकता है।
  5. 25 मिलीलीटर धो बफर जोड़ें और धीरे vortexing द्वारा ऊतक फिर से निलंबित। दो बार दोहराएँ अधिक 3.4 और 3.5 कदम।
  6. एक सेंट पर एक 30 जाल ऊतक चलनी रखें250 मिलीलीटर बीकर erile और चलनी पर ऊतक निलंबन डालना। धोने बफर के एक अतिरिक्त 20 मिलीलीटर के साथ पाचन ट्यूब कुल्ला और जाल पर डाल देना। पचाया अग्नाशय और वसा ऊतकों के इस कदम पर निकाल रहे हैं।
  7. दो ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूबों में फ़िल्टर सामग्री डालो और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 97 XG पर कताई द्वारा ऊतक गोली। छानना सतह पर तैरनेवाला और पलटना नलियों अतिरिक्त बफर के निकास के लिए।

4. आइलेट्स की शुद्धि

  1. pelleted अग्नाशय के ऊतकों को (1.119 ग्राम / मिलीलीटर घनत्व) ठंड polysucrose / सोडियम diatrizoate समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ें। Homogenously धीरे से ऊपर pipetting द्वारा और पांच बार नीचे प्रत्येक ट्यूब की सामग्री को फिर से निलंबित।
  2. धीरे 10 मिलीलीटर HBSS के साथ polysucrose / सोडियम diatrizoate समाधान उपरिशायी। धीरे-धीरे ट्यूब की दीवार के साथ HBSS जोड़कर एक तेज तरल इंटरफेस को बनाए रखें।
  3. धीमी गति त्वरण और कोई ब्रेक के साथ 15 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 560 XG पर पचता Pancreata अपकेंद्रित्र।
  4. सहताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 10 मिलीलीटर पिपेट और जगह टापू का उपयोग कर अंतरफलक से आइलेट परत llect। इस चरण में टापू पूल नहीं है।
  5. धो बफर के 40 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस पर 140 XG पर 1 मिनट के लिए प्रत्येक 50 मिलीलीटर ट्यूब और स्पिन में जोड़े।
  6. सतह पर तैरनेवाला डालो और ट्यूबों कई बार inverting से धो बफर के 50 मिलीलीटर में जमा टापू फिर से निलंबित। 4 डिग्री सेल्सियस पर 97 XG पर 1 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र एक गोली में टापू इकट्ठा करने के लिए।
  7. धो बफर डालो और धोने दोहराएँ। टिशू कल्चर हुड में टापू ले आओ और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  8. आइलेट माध्यम के 6 मिलीलीटर में टापू के प्रत्येक ट्यूब फिर से निलंबित।
  9. छह अच्छी तरह से टिशू कल्चर डिश के एक कुएं में प्रत्येक 50 मिलीलीटर ट्यूब से टापू स्थानांतरण। 6 अच्छी तरह से पकवान भंवर में अच्छी तरह से के बीच में टापू इकट्ठा करने और एक माइक्रोस्कोप के नीचे आइलेट गुणवत्ता और शुद्धता का निरीक्षण करने के लिए।
  10. मैन्युअल 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग टापू को इकट्ठा करने और आसन्न में उठाया टापू हस्तांतरणअच्छी तरह से आइलेट मीडिया के 6 मिलीग्राम से युक्त। दोहराएँ आइलेट घूमता और> जब तक 90% शुद्धता उठा हासिल की है।
  11. एक 10 सेमी टिशू कल्चर आइलेट माध्यम के 20 मिलीलीटर युक्त डिश के लिए शुद्ध टापू स्थानांतरण।
  12. एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में जगह टापू (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) रातोंरात (चित्रा 1 ए)।
  13. आइलेट कोशिकाओं, कोट अच्छी तरह से प्रति 804G वातानुकूलित मीडिया के 40 μl के साथ एक 384 अच्छी तरह से थाली के कुओं चढ़ाना की तैयारी में। एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते हैं।

5. फैलाव और आइलेट कोशिकाओं के चढ़ाना

  1. अगले दिन, धीरे से एक सेल खुरचनी के साथ 10 सेमी पकवान से टापू अलग और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में टापू हस्तांतरण।
  2. कमरे के तापमान पर 22 XG पर 1 मिनट के लिए centrifugation द्वारा टापू गोली। सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  3. गर्म पीबीएस के 20 मिलीलीटर के साथ टापू को धो लें और ऊपर के रूप में छानना।
  4. पुनः निलंबित 0.25% trypsin में टापू (चूहा अग्न्याशय प्रति 150 μl) और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पिपेट टापू और नीचे में 10 बार के बाद ऊष्मायन के 5 और 10 मिनट के 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग।
  5. 10 मिनट के बाद, खुर्दबीन के नीचे trypsinized टापू की एक 20 μl नमूना का मूल्यांकन पूरा पाचन सुनिश्चित करने के लिए और एक hemocytometer का उपयोग आइलेट कोशिकाओं की गिनती करने के लिए। 5 मिनट और पिपेट ऊपर और नीचे 10 से अधिक बार - अगर पचाया टापू बने हुए हैं, एक अतिरिक्त 3 के लिए ऊष्मायन जारी है। आवश्यक के रूप में दोहराएँ।
    नोट: ठेठ उपज ~ 125,000 है - चूहे प्रति 150,000 आइलेट कोशिकाओं।
  6. इनक्यूबेटर से 804G वातानुकूलित मीडिया लेपित 384 अच्छी तरह से थाली निकालें और एक 12 अच्छी तरह से कई गुना खींचने की मशीन का उपयोग कर मीडिया को हटा दें।
  7. आइलेट समारोह माध्यम में मिलीलीटर प्रति 45,000 कोशिकाओं के घनत्व पर आइलेट कोशिकाओं को निलंबित और एक मल्टीचैनल पिपेट (चित्रा 1 बी) के साथ अच्छी तरह से प्रति 70 μl (3,150 कोशिकाओं) थाली।
    नोट: क्योंकि बाहरी कुओं में स्थित β कोशिकाओं एन और स्तंभों से 4 प्लेट उपयोग पंक्तियों सी की परिधि की ओर पलायन करते हैं21 आइलेट कोशिकाओं 6 चूहों से अलग से 228 कुओं थाली करने के लिए।
  8. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली 48 घंटे के लिए जगह कोशिका आसंजन की अनुमति है।

6. आइलेट सेल संस्कृति उपचार, फिक्सेशन और धुंधला

  1. (उपचार की स्थिति चार प्रतियों में प्रदर्शन कर रहे हैं) आइलेट समारोह के माध्यम में एक 2x एकाग्रता में वाहन और यौगिकों के 200 μl तैयार करें। बहु अच्छी तरह से pipetting की सुविधा के लिए एक बाँझ 96 अच्छी तरह से थाली में यौगिकों की व्यवस्था।
  2. ध्यान से एक 12 अच्छी तरह से कई गुना खींचने की मशीन के साथ आइलेट मध्यम हटाने और आइलेट समारोह मध्यम (35 μl / अच्छी तरह से) 12 अच्छी तरह से पिपेट का उपयोग के साथ बदलें। निकालें और सुखाने (चित्रा 1 सी) के जोखिम को सीमित करने के लिए एक समय में एक पंक्ति से मीडिया की जगह।
  3. अच्छी तरह से 35 μl / स्थानांतरित 2x यौगिक समाधान द्वारा उपचार आरंभ करें। 48 घंटा उपचार की अवधि के लिए इनक्यूबेटर थाली लौटें।
  4. इलाज के 48 घंटे के बाद, प्लेट inverting द्वारा उपचार मीडिया छानना। </ Li>
  5. धीरे 1x पीबीएस (1 मिनट) की अच्छी तरह से प्रति 50 μl के साथ आइलेट कोशिकाओं धो लें। पीबीएस एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर जोड़ें।
  6. पीबीएस छानना और 1x पीबीएस में पतला ठंड 4% paraformaldehyde (पीएफए) की अच्छी तरह से प्रति 50 μl जोड़कर कोशिकाओं को ठीक। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  7. प्लेट inverting पीएफए ​​दूर करने के लिए और धीरे से ऊपर के रूप में अच्छी तरह से प्रति पीबीएस के 60 μl जोड़कर कोशिकाओं को तीन बार (5 मिनट प्रत्येक) को धो लें।
  8. 14.25 मिलीलीटर formamide और 0.75 मिलीग्राम 0.15 एम सोडियम साइट्रेट (पीएच 6) के मिश्रण से 15 मिलीलीटर प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान तैयार है। उपयोग करने से पहले प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान तुरंत बनाओ।
  9. कुओं से पीबीएस निकालें inverting थाली से और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 60 μl प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान जोड़ें। 45 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में प्लेट हीट। बहु अच्छी तरह से थाली के warping रोकने के लिए इस गर्मी के दौरान प्लेट के शीर्ष पर एक हीटिंग ब्लॉक रखें।
    नोट: पानी आधे रास्ते तक प्लेट स्कर्ट होना चाहिए; प्लेट जलमग्न नहीं किया जाना चाहिए।
  10. 1x पीबीएस तीन बार की अच्छी तरह से प्रति 60 μl (5 मिनट प्रत्येक) के साथ कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस एक मल्टी चैनल विंदुक के साथ जोड़ें और inverting थाली से पीबीएस छानना।
  11. अवरुद्ध बफर के प्रति अच्छी तरह से 40 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते एक मल्टी चैनल पिपेट का प्रयोग करें। inverting थाली और decanting द्वारा अवरुद्ध बफर निकालें।
  12. और बकरी विरोधी मानव PDX-1 (1: 100): माउस विरोधी मानव Ki-67 (200 1) के 40 μl जोड़े प्रत्येक अच्छी तरह से अवरुद्ध बफर में पतला एंटीबॉडी और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  13. अगले दिन, जैसा कि ऊपर वर्णित विरोधी शरीर समाधान छानना और तीन बार (5 मिनट प्रत्येक) 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस छानना।
  14. बफर अवरुद्ध में: (200 1) biotinylated गधा विरोधी माउस आईजीजी और rhodamine संयुग्मित गधा विरोधी बकरी आईजीजी पतला की अच्छी तरह से प्रति 40 μl जोड़ें। 1 घंटे के लिए सेतेकमरे के तापमान पर।
  15. 1x पीबीएस के साथ तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक कोशिकाओं को धो लें। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए fluorescein संयुग्मित streptavidin: (बफर अवरुद्ध में 400 1) का पतला 40 μl जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  16. 1x पीबीएस के साथ तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक कोशिकाओं को धो लें। DAPI की अच्छी तरह से (बफर अवरुद्ध में 300 एनएम) प्रति 40 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  17. 1x पीबीएस के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और पीबीएस 1x 40 μl में कोशिकाओं को छोड़ दें। प्लेट अब विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार है।

7. β-सेल प्रतिकृति विश्लेषण

नोट: एक परख प्रोटोकॉल β-सेल प्रतिकृति को मापने के लिए इस्तेमाल किया उच्च सामग्री स्क्रीनिंग माइक्रोस्कोप के लिए स्थापित किया जाना चाहिए। अपने सरल संरचना, इस प्रोटोकॉल एक दो रंग परख जहां एक पहचान मार्कर β-कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है (PDX-1 + -cells) और एक प्रतिकृति मार्कर (केआई 67) कोशिका विभाजन की घटनाओं को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

  1. वस्तुओं (β-कोशिकाओं) averag पर आधारित पहचानें(: चौड़ाई <1.6 लंबाई) एक β-सेल नाभिक (2A चित्रा) की उम्मीद है और पिक्सेल क्षेत्र के भीतर लगभग एक सर्कल के भीतर PDX-1 धुंधला (549 एनएम फिल्टर) के ई प्रतिदीप्ति तीव्रता।
  2. अगले, प्रतिकृति घटनाओं (की-67-सकारात्मकता) औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (485 एनएम फिल्टर) पर आधारित PDX-1 + क्षेत्र (चित्रा 2 बी) के भीतर की पहचान करने के लिए सेटिंग्स की स्थापना।
    नोट: जोखिम बार छवियों भर पिक्सेल तीव्रता तुलना अनुमति देने के लिए तय किया जाना चाहिए। परख प्रोटोकॉल मानकों को समायोजित कर रहे हैं कि इस तरह की मशीन कॉल लगातार अविशिष्ट धुंधला हो जाना, मलबे और सेल समुच्चय है कि प्रतिकूल डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है बाहर।
  3. अच्छी तरह से प्रति 500 ​​β-कोशिकाओं की एक न्यूनतम विश्लेषण सटीकता और सीमा परिवर्तनशीलता को अधिकतम करने के लिए।
    नोट: चूहा आइलेट संस्कृतियों में बेसल β-सेल प्रतिकृति सूचकांक होने की उम्मीद है 0.5 - 3%। आमतौर पर, अच्छी तरह से प्रति 40 छवियों 500 β-कोशिकाओं की पहचान करने के लिए पर्याप्त से अधिक है।
  4. विश्लेषण करने से पहलेपूरी थाली, चयनित negative- (DMSO के इलाज) और सकारात्मक नियंत्रण का विश्लेषण (5-iodotubercidin [1 माइक्रोन] या dipyridamole [15 माइक्रोन के]) कुओं परख प्रोटोकॉल की वैधता का आकलन करने के -treated। जब परख सही ढंग से स्थापित है, सकारात्मक नियंत्रण यौगिकों में कम से कम β-कोशिकाओं को दोहरा के प्रतिशत में दो गुना वृद्धि प्रेरित।
  5. पूरी थाली पढ़ें एक बार परख प्रोटोकॉल मान्य है।

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Representative Results

β-सेल या α-सेल प्रतिकृति का आकलन करने के लिए, एक चार रंग परख प्रोटोकॉल की आवश्यकता है। सबसे पहले, वस्तुओं DAPI धुंधला (चैनल 1, 386 एनएम) द्वारा पहचाने जाते हैं। अगले, β-कोशिकाओं (घटना 1) गिने जाते हैं: वस्तुओं है कि सह-अभिव्यक्त PDX-1 + (चैनल 2, 650 एनएम) और पेरी परमाणु इंसुलिन (चैनल 3, 549 एनएम)। बाद में, नकल β-कोशिकाओं (घटना 2) गिने जाते हैं: बीटा कोशिकाओं (घटना 1) कि सह एक्सप्रेस की-67 (चैनल 4, 485 एनएम) (चित्रा 3)। β-कोशिकाओं को दोहरा का प्रतिशत गणना की है: (घटना 2 / घटना 1) x 100 α-सेल प्रतिकृति यों, कुल वस्तुओं DAPI धुंधला द्वारा पहचाने जाते हैं (चैनल 1) और फिर α-कोशिकाओं (घटना 1) द्वारा प्रगणित रहे हैं PDX-1 धुंधला की अनुपस्थिति (2 चैनल) और perinuclear ग्लूकागन धुंधला की उपस्थिति (चैनल) 3। नकल α-कोशिकाओं (घटना 2) α-कोशिकाओं है कि सह-एक्सप्रेस Ki-67 (चैनल 4) (चित्रा 4) की संख्या में हैं।नकल α-कोशिकाओं का प्रतिशत गणना की है: (घटना 2 / घटना 1) x 100।

प्रयोग की शुरुआत से पहले, एक यौगिक उपचार योजना (तालिका 1 ए) बनाया गया है। इधर, एक छोटे पैमाने पर परख नकारात्मक नियंत्रण (DMSO के इलाज) और सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर चला गया था (dipyridamole इलाज [15 माइक्रोन के]) की स्थिति PDX-1, β सेल और एक 384 अच्छी तरह प्रारूप में α-सेल प्रतिकृति (आकलन करने के लिए अच्छी तरह से प्रति 49 चित्र)। प्रायोगिक डेटा dipyridamole चुनिंदा PDX-1 + सेल और β-सेल प्रतिकृति नहीं बल्कि α-सेल प्रतिकृति को बढ़ावा देने के लिए प्रदर्शित करता है। अच्छी तरह से प्रति पहचान PDX-1-कोशिकाओं की औसत संख्या 5541 ± 555 DMSO के इलाज और 6439 ± 363 dipyridamole इलाज स्थितियों के लिए (पी <0.01) के लिए किया गया था; PDX-1 सेल नंबर (तालिका 1 बी, ऊपर) में एक dipyridamole निर्भर वृद्धि का प्रदर्शन है। औसत प्रतिशत PDX-1 + सेल प्रतिकृति (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + </ sup> / DMSO + PDX-1 +) के लिए 3.35 ± 0.50% है DMSO के इलाज और dipyridamole इलाज की स्थिति (पी <0.01) (तालिका 1 बी, नीचे) के लिए 10.10 ± 0.98%। DMSO = 3.3 ± 0.66 (पंक्तियों सीएफ) और 3.4 ± 0.23 (पंक्तियों: महत्वपूर्ण बात, वहाँ समान PDX-1 कुओं में + सेल प्रतिकृति दरों बाद में β-सेल (पंक्तियों सीएफ) और α-सेल प्रतिकृति (पंक्तियों जी जे) के लिए विश्लेषण कर रहे हैं जी जे) (पी = 0.80); dipyridamole = 9.8 ± 0.86 (पंक्तियों सीएफ) और 10.4 ± 0.1.1 (पंक्तियों जी जे) (पी = 0.43)। इसलिए, इन कुओं, हालांकि अलग सेल-वंश मार्कर (इंसुलिन और ग्लूकागन) के लिए दाग, नशीली दवाओं के उपचार के लिए इसी तरह जवाब दिया।

Β-कोशिकाओं और α-कोशिकाओं की प्रतिकृति दरों अगली कच्चे डेटा (तालिका 2) से गणना की गई। Β-कोशिकाओं (घटना 1) की औसत संख्या dipyridamole उपचार के जवाब में वृद्धि की गई थी: DMSO 3930 ± 488 बनाम। dipyridamole 4589 ± 218 (पी <0.05)। विशेष रूप से, वहाँ β-कोशिकाओं (3930 ± 488) PDX-1 कोशिकाओं (5541 ± 555) (पी <0.01) की तुलना की संख्या में उल्लेखनीय कमी है। Β-कोशिका गिनती, जैसे, δ-कोशिकाओं या β-सेल पूर्वज कोशिकाओं, और होना करने के लिए इंसुलिन + β-कोशिकाओं की आवश्यकता होती है की अतिरिक्त तंगी से - यह PDX-1 + -cells कि इंसुलिन हैं को छोड़कर का परिणाम है। विशेष रूप से, α-कोशिकाओं की संख्या (घटना 1) (dipyridamole 1,467 ± 74.7 बनाम DMSO 1465 ± 123; पी = 0.93) dipyridamole उपचार के साथ वृद्धि नहीं था। इसलिए, dipyridamole चुनिंदा β-सेल संख्या बढ़ जाती है। Β-कोशिकाओं को दोहरा (घटना 2) की संख्या (DMSO 131 ± 31 बनाम dipyridamole 476.5 ± 39.6, पी <0.01) dipyridamole उपचार के जवाब में वृद्धि हुई है, लेकिन α-कोशिकाओं को दोहरा (घटना 2) की संख्या नहीं है (DMSO 10.25 ± 3 बनाम dipyridamole 9.0 ± 1.6, पी = 0.5)। नकल β-सीई के अंत प्रतिशतlls और α-कोशिकाओं गणना की जाती है ((इवेंट 2 / घटना 1) x 100)। दरअसल, dipyridamole β कोशिकाओं नहीं लेकिन α-कोशिकाओं (चित्रा 5 में संक्षेप) नकल का प्रतिशत बढ़ जाती है। (- 3% 0.5), लेकिन एक प्रयोग के भीतर कुओं भर में अत्यधिक अनुरूप होना चाहिए महत्वपूर्ण बात है, बेसल सेल β-एक स्वस्थ संस्कृति की प्रतिकृति दर प्रयोगों के बीच होती है। क्योंकि बेसल प्रतिकृति चर रहा है, यौगिक प्रेरित β-सेल प्रतिकृति दर भी प्रयोगों भर में चर रहा है; हालांकि, β-सेल प्रतिकृति के गुना-प्रेरण प्रयोगों भर के अनुरूप है और यौगिक प्रभावकारिता मज़बूती प्रयोगों भर में तुलना करने के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, α-सेल प्रतिकृति दर से 5 बार β-सेल प्रतिकृति दर से कम है और संस्कृतियों ~ 1/3 के रूप में कई α-कोशिकाओं के रूप में β-सेल होते हैं; नतीजतन, α-सेल प्रतिकृति सूचकांक प्रदर्शित करता है β-सेल प्रतिकृति सूचकांक की तुलना में परिवर्तनशीलता में वृद्धि हुई। परिवर्तनशीलता सीमित करने के लिए, अच्छी तरह से प्रति छवियों49 (यहां इस्तेमाल किया) से 81 की एक अधिकतम करने के लिए बढ़ जाती है।

आकृति 1
चित्रा 1: पृथक और छितरी चूहा आइलेट्स। (ए) स्वस्थ पृथक चूहे टापू का एक माइक्रोग्राफ; 100 माइक्रोन पैमाने बार दिखाया गया है। (बी) चढ़ाना के बाद 1 घंटा छितरी चूहे टापू की सूक्ष्मग्राफ (5X और 10X उद्देश्यों); 100 माइक्रोन (बाएं) और 200 माइक्रोन (दाएं) से पता चला सलाखों के पैमाने। (सी) छितरी चूहे के सूक्ष्मग्राफ (5X और 10X उद्देश्यों) चढ़ाना के बाद 48 घंटा islets; 100 माइक्रोन (बाएं) और 200 माइक्रोन (दाएं) से पता चला सलाखों के पैमाने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: PDX-1 की स्वचालित पहचान + + आइलेट कोशिकाओं। (ए) यौगिक इलाज छितरी चूहा आइलेट कोशिकाओं PDX-1 के लिए दाग। PDX-1 + वस्तुओं नीले रंग में परिक्रमा कर रहे हैं; बाहर रखा वस्तुओं नारंगी में परिक्रमा कर रहे हैं। 150 माइक्रोन के स्केल बार दिखाया गया है। (बी) आइलेट कोशिकाओं की-67 के लिए दाग के एक ही क्षेत्र। PDX-1 + Ki-67 + डबल पॉजिटिव कोशिकाओं हरे रंग में परिक्रमा कर रहे हैं। दिखाए गए 150 माइक्रोन के स्केल बार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Β-कोशिकाओं को दोहरा की स्वचालित पहचान β-कोशिकाओं को दोहरा DAPI (बाएं ऊपरी कोने, नीले हलकों), PDX-1 (सही-ऊपरी कोने, हरी हलकों), इंसुलिन द्वारा पहचाने जाते हैं (बाएं निचले कोने, मैजेंटा हलकों) और की-67 (सही-निचले कोने, लाल हलकों) के सह-एहै xpression। मर्ज किए गए छवि (दाएं) कई नकल β-कोशिकाओं से पता चलता। दिखाए गए 150 माइक्रोन के स्केल बार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। Α-कोशिकाओं को दोहरा की स्वचालित पहचान α-कोशिकाओं को दोहरा DAPI (बाएं ऊपरी कोने, नीले हलकों), PDX-1 की अनुपस्थिति (सही-ऊपरी कोने, हरी हलकों), ग्लूकागन द्वारा पहचाने जाते हैं (बाएं कम कोने, मैजेंटा हलकों) और की-67 (सही-निचले कोने, लाल वृत्त) के सह-अभिव्यक्ति। मर्ज किए गए छवि (दाएं) α-कोशिकाओं के एक दुर्लभ नकल नक़ल (पीले तीर) से पता चलता है। दिखाए गए 150 माइक्रोन के स्केल बार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 5:। Dipyridamole लाती PDX-1 + - और β-सेल प्रतिकृति लेकिन PDX-1-सेल की नहीं α-सेल प्रतिकृति ग्राफिकल प्रतिनिधित्व (ऊपर बाएं), β-सेल (शीर्ष सही) और α-सेल (नीचे बाएँ) DMSO- और dipyridamole इलाज कुओं में प्रतिकृति दिखाए जाते हैं। बार्स स्वतंत्र रूप से इलाज किया कुओं का मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं (PDX-1 प्रतिकृति, एन = 8; β सेल और α-सेल प्रतिकृति, एन = 4)। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (* पी <0.01) से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<टीडी> 3.77
ए। उपचार: धुंधला:
4 5
सी DMSO DIPYRIDAMOLE इंसुलिन, DAPI, PDX-1, की-67
डी DMSO DIPYRIDAMOLE इंसुलिन, DAPI, PDX-1, की-67
DMSO DIPYRIDAMOLE इंसुलिन, DAPI, PDX-1, की-67
एफ DMSO DIPYRIDAMOLE इंसुलिन, DAPI, PDX-1, की-67
जी DMSO DIPYRIDAMOLE ग्लूकागन, DAPI, PDX-1, की-67
एच DMSO DIPYRIDAMOLE ग्लूकागन, DAPI, PDX-1, की-67
मैं DMSO DIPYRIDAMOLE ग्लूकागन, DAPI, PDX-1, की-67
जम्मू DMSO DIPYRIDAMOLE ग्लूकागन, DAPI, PDX-1, की-67
बी PDX-1 + कोशिकाओं की संख्या
DMSO DIPYRIDAMOLE
4 5
सी 5158 6249
डी 6365 6795
4830 6974
एफ 5988 6408
जी 5574 6532
एच 5939 6411
मैं 5612 6387
जम्मू 4862 5759
PDX-1 + Ki-67 + कोशिकाओं के प्रतिशत
DMSO DIPYRIDAMOLE
4 5
सी 3.04 9.99
डी 3.91 10.57
2.51 8.58
एफ 10.14
जी 3.44 10.1
एच 3.06 10.69
मैं 3.58 9.07
जम्मू 3.52 11.74

तालिका 1: प्रतिनिधि प्रायोगिक योजना और PDX-1 + सेल प्रतिकृति डेटा। (ए) उपचार योजना की एक रूपरेखा दिखाया गया है। वेल्स DMSO (स्तंभ 4) या dipyridamole (स्तंभ 5) के साथ इलाज किया गया। धुंधला DAPI, विरोधी PDX-1, विरोधी इंसुलिन (सामान्य अभिलेख) या विरोधी ग्लूकागन (इटैलिक अभिलेख) और की-67 (बी) PDX-1 + कोशिकाओं की कुल संख्या (ऊपर, DAPI के साथ प्रदर्शन किया गया था +PDX-1 +) प्रति अच्छी तरह से अच्छी तरह से और PDX-1 कोशिकाओं को दोहरा का प्रतिशत (नीचे, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + x 100) प्रति दिखाए जाते हैं।

घटना 1:
DMSO DIPYRIDAMOLE
4 5
सी 3557 4352 # DAPI (+) PDX-1 (+) इंसुलिन (+)
डी 4387 4542 # DAPI (+) PDX-1 (+) इंसुलिन (+)
3462 4879 # DAPI (+) PDX-1 (+) इंसुलिन (+)
एफ 4315 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) इंसुलिन (+)
जी 1594 1567 # DAPI (+) PDX-1 (+) ग्लूकागन (+)
एच 1477 1439 # DAPI (+) PDX-1 (+) ग्लूकागन (+)
मैं 1491 1390 # DAPI (+) PDX-1 (+) ग्लूकागन (+)
जम्मू 1298 1474 # DAPI (+) PDX-1 (+) ग्लूकागन (+)
घटना 2:
DMSO DIPYRIDAMOLE
4 5
सी 113 425 # DAPI (+) PDX-1 (+) इंसुलिन (+) की-67 (+)
डी 152 511 # DAPI (+) PDX-1 (+) इंसुलिन (+) की-67 (+)
97 466 # DAPI (+) PDX-1 (+) इंसुलिन (+) की-67 (+)
एफ 163 504 # DAPI (+) PDX-1 (+) इंसुलिन (+) की-67 (+)
जी 13 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) ग्लूकागन (+) की-67 (+)
एच 10 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) ग्लूकागन (+) की-67 (+)
मैं 6 1 1 # DAPI (+) PDX-1 (+) ग्लूकागन (+) की-67 (+)
जम्मू 12 </ Em> 7 # DAPI (+) PDX-1 (+) ग्लूकागन (+) की-67 (+)
% प्रतिकृति:
DMSO DIPYRIDAMOLE
4 5
सी 3.18 9.77
डी 3.47 11.25
2.8 9.55
एफ 3.78 10.99
जी 0.82 0.57
एच 0.68 0.63
मैं 0.4 0.79
जम्मू 0.92 0.48

तालिका 2: प्रतिनिधि β सेल और α-सेल प्रतिकृति डेटा β-कोशिकाओं की कुल संख्या (इवेंट 1: DAPI + PDX-1 + इंसुलिन +; शीर्ष तालिका पंक्तियों सीएफ, सामान्य अभिलेख)।), Α-कोशिकाओं (इवेंट 1 : DAPI + PDX-1 + ग्लूकागन +; शीर्ष तालिका पंक्तियों जी एच, इटैलिक अभिलेख), β-कोशिकाओं (इवेंट 2 नकल: DAPI + PDX-1 + इंसुलिन + Ki-67 +, मध्य तालिका पंक्तियों सीएफ, सामान्य अभिलेख) और α -cells (इवेंट 2: DAPI + PDX-1 + ग्लूकागन + Ki-67 +, मध्य तालिका पंक्तियों जी एच, इटैलिक अभिलेख)अच्छी तरह से प्रति दिखाए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, β-कोशिकाओं (DAPI + PDX-1 + इंसुलिन + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + इंसुलिन + x 100; नीचे तालिका पंक्तियों सीएफ, सामान्य अभिलेख) नकल का प्रतिशत और α-कोशिकाओं (DAPI + PDX -1 + ग्लूकागन + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + ग्लूकागन + x 100; नीचे तालिका पंक्तियों जी जे, इटैलिक अभिलेख) प्रति अच्छी तरह से दिखाए जाते हैं।

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Discussion

आणविक मार्ग है कि β-सेल के विकास और उत्थान पर नियंत्रण के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक विधियों मधुमेह शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। इस के साथ साथ, एक चूहे-आइलेट आधारित स्क्रीनिंग मंच की पहचान करने और चिह्नित करने के लिए β-सेल प्रतिकृति के छोटे अणु stimulators प्रस्तुत किया है।

हालांकि इस प्रोटोकॉल की सबसे पहलुओं को आसानी से अनुभवी शोधकर्ताओं द्वारा किया जाता है, कुछ कदम विशेष तकनीक की आवश्यकता है। सबसे पहले, आइलेट अलगाव के दौरान, इसकी अखंडता बाधा पहुँचा के बिना पित्त वाहिनी के केन्युलेशन अभ्यास की आवश्यकता है। एक सहायक रणनीति न्यूनतम पित्त नली बढ़ करने के लिए पूरी तरह से अग्नाशय पाचन समाधान वितरण से पहले सुई के उचित स्थिति सुनिश्चित करना है। दूसरा, बहि ऊतक से कुशल आइलेट अलगाव पाचन अवधि और उचित आंदोलन के करीब ध्यान की आवश्यकता है। जॉब भी रुक-रुक कर घूमता माध्यम से डाइजेस्ट भर हीटिंग सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। तीसरा, प्रयोगात्मक सफलता निर्भर करती हैटापू और मैनुअल आइलेट उठा दौरान बहि मलबे के बीच कुशल भेदभाव पर S; इस कौशल अभ्यास के साथ बेहतर बनाता है। चौथा, आइलेट फैलाव और चढ़ाना इस तरह से किया जाता है कि सभी टापू एकल कक्षों और दो या तीन कोशिकाओं के छोटे समूहों का एक मिश्रण में बिखरे हैं। खत्म और अंडर पाचन टापू की पूर्व प्रायोगिक प्रदर्शन के साथ हस्तक्षेप करने के लिए चढ़ाना। हौसले चढ़ाया आइलेट कोशिकाओं के प्रसार और परेशान किया जा रहा बिना 48 घंटा से अधिक संलग्न करने की अनुमति से पहले लगभग 50% मिला हुआ होना चाहिए। चित्रा 1 चढ़ाना के बाद विभिन्न समय पर सफल आइलेट सेल संस्कृतियों की उपस्थिति से पता चलता है। पांचवां, आइलेट सेल संस्कृतियों के लिए मीडिया परिवर्तन दुर्बलता से पक्षपाती कोशिकाओं के विघटन से बचने के लिए सावधानी से किया जाता है। छठी, प्रतिजन पुनर्प्राप्ति सावधानी से किया जाना चाहिए बहु अच्छी तरह से थाली के warping से बचने के लिए, लेकिन पर्याप्त रूप से सफल Ki-67 धुंधला है जो दोनों के तहत और के प्रति संवेदनशील है सक्षम करने के लिए तापमान पदोन्नति के लिए जोखिम के ऊपर; विकृत प्लेटों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकतास्वचालित छवि अधिग्रहण। ध्यान दें, अत्यधिक अग्न्याशय पाचन, बहि ऊतक मलबे और / या trypsinization के लिए जोखिम आइलेट सेल संस्कृति में नाकामी के लिए आम कारण हैं।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा β-सेल पहचान और नकल की घटनाओं के लिए विशिष्ट अभिव्यक्ति मार्कर पर निर्भरता है। एकल मार्कर के उपयोग संभावित भ्रामक हो गया है। उदाहरण के लिए, PDX-1 β-कोशिकाओं, सोमेटोस्टैटिन व्यक्त δ-कोशिकाओं और β-सेल progenitors 29,30 के एक सबसेट द्वारा व्यक्त की है; इसलिए, यौगिकों जो PDX-1-सेल प्रतिकृति को बढ़ाने के लिए विशेष रूप से एक गैर-β-सेल की आबादी पर अभिनय हो सकता है। नतीजतन, पुष्टि अध्ययन है कि वैकल्पिक β-सेल मार्कर का उपयोग आवश्यक हैं। इसी तरह, की-67 अभिव्यक्ति प्रतिकृति और BrdU के रूप में और phospho-हिस्टोन 3 31 इस्तेमाल किया जाना चाहिए जैसे कि अतिरिक्त संकेतक के लिए एक आदर्श मार्कर नहीं है। इस परख की एक दूसरी सीमा है कि यौगिकों जो β-सेल प्रतिकृति प्रेरित simultane सकता हैously β-सेल apoptosis या डी-भेदभाव वृद्धि हुई है। इसलिए, यह एक यौगिक β-सेल नंबर में एक निरपेक्ष वृद्धि लाती है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है, और / या β-सेल apoptosis लाती है और क्या यौगिक इलाज β-कोशिकाओं को सामान्य कार्य (ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन का स्राव) 32 बरकरार रहती है। इस परख के एक तिहाई सीमा मामूली प्राथमिक आइलेट कोशिकाओं के इस्तेमाल से जुड़े throughput है; छह चूहों से टापू 228 प्रयोगात्मक कुओं जो ~ 55 यौगिकों चार प्रतियों (प्लस सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण) में जांच करने की अनुमति देता उत्पन्न करता है। वर्णित β-सेल प्रतिकृति स्क्रीनिंग मंच का एक अतिरिक्त सीमा चूहे टापू के बजाय मानव टापू का इस्तेमाल होता है। मानव और चूहे टापू के बीच मतभेद की आवश्यकता है कि सभी प्रतिकृति को बढ़ावा देने के यौगिकों का उपयोग चूहा आइलेट संस्कृतियों मानव आइलेट संस्कृतियों का उपयोग कर पुष्टि कर रहे हैं की पहचान के लिए पर्याप्त हैं। हालांकि, सीमित उपलब्धता, और मानव टापू की उच्च लागत, मानव के साथ मैं प्राथमिक स्क्रीनिंग दियाslets सबसे शोधकर्ताओं के लिए अव्यावहारिक है।

इस प्रोटोकॉल का प्राथमिक लाभ कर रहे हैं: 1) हौसले से पृथक प्राथमिक टापू का उपयोग संभव सबसे बड़ी हद तक सामान्य वृद्धि मजबूरी बनाए रखने के लिए, 2) एक 384 अच्छी तरह प्रारूप का उपयोग मध्यम throughput प्रदर्शन की अनुमति के लिए (आमतौर पर छह चूहों से अलग टापू 228 कुओं के लिए पर्याप्त) कर रहे हैं और 3) प्रयोग की गति को तेज करने के लिए और पूर्वाग्रह को सीमित करने की स्वचालित छवि अधिग्रहण और विश्लेषण का उपयोग करें। इसके विपरीत, आमतौर पर इस्तेमाल वैकल्पिक तरीकों का मार्गदर्शन छवि अधिग्रहण और β-सेल प्रतिकृति घटनाओं या रेडियोधर्मी thymidine के पूरे आइलेट शामिल है जो सेल linages, उदाहरण के fibroblast बनाम β-सेल प्रतिकृति 15,17 के बीच भेदभाव नहीं करता है के व्यक्तिपरक आकलन पर भरोसा करते हैं। इसलिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल β-कोशिकाओं के विकास को नियमन की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण और बेहतर उपकरण प्रतिनिधित्व करता है।

हम अनुकूलित की एक किस्म की कल्पनाइस स्क्रीनिंग मंच के लिए उपयोग करता है। या इंसुलिन + -cells - सबसे पहले, β-सेल नंबर में एक निरपेक्ष वृद्धि PDX-1 + की संख्या की गणना के द्वारा मापा जा सकता है। अच्छी तरह से हालत प्रति प्रतिकृति के एक उच्च संख्या प्रति चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तनशीलता के लिए खाते में करने के लिए शामिल किया जा सकता है (आम तौर पर एन = 8)। दूसरा, मंच lentivirus आधारित overexpression के लिए अनुकूलित या नाक आउट / नीचे प्रयोगों β-सेल प्रतिकृति में शामिल रास्ते की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। सारांश में, वर्णित प्रयोगात्मक तकनीक यौगिकों और आणविक मार्ग है कि β-सेल प्रतिकृति को विनियमित की पहचान के लिए मोटे तौर पर उपयोगी है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 g male Male Sprague Dawly Rat Charles River Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps Fine Science Tools 11021-12
11.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14058-11
14.5 cm surgical scissors Fine Science Tools 14001-14
16 cm curved forceps Fine Science Tools 11003-16
12 cm curved hepostat Fine Science Tools 13011-12
12 cm scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Tissue sieve-30 mesh Bellco Glass 1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units VitaCyte 005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) Gibco 24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml) JHP Pharmaceuticals NDC# 42023-113-10 to make anesthetic cocktail 
Xylazine (5 g/50 ml) LLOYD NADA# 139-236 to make anesthetic cocktail 
Histopaque 1077 Sigma H-1077 to make histopaque 1100
Histopaque 1119 Sigma H-1119 to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml Hyclone SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution Hyclone SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose  Hyclone SH30021.01
Functionality/Viability Solution  Mediatech 99-768-CV
RPMI1640 media  Hyclone SH30096.01 to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line Available upon request to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 26160
GlutaMax-I Gibco 35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)  MP Biomedicals 1670049
Formamide 500 ml Fisher BioReagents BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) Vector Laboratories H-3300 to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous EMD Chemicals DX0145-1 to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder) Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody BD Biosciences 556003
Goat anti-human PDX-1 antibody R&D Systems AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody Dako 2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody Dako 2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody Dako 2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody abcam ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated  Invitrogen S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG  Jackson ImmunoResearch 705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch 705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG Jackson ImmunoResearch 703-175-155
DAPI Millipore S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml Sorenson BioScience 39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate BD Falcon 353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate Costar 3603
Multi-channel pipettor Costar 4880
12-channel vaccume aspirator Drummond 3-000-096
Cell Scraper Falcon 353085
Isotemp Water Bath Model 2223  Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI Thermo Scientific

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References

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