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Medicine

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Summary

对于糖尿病研究领域的关键挑战是要明白,调节胰岛β细胞的复制,并制定刺激β细胞再生方法的分子机制。在此高内涵筛选的方法来识别和评估小分子的β细胞复制促进活性表示。

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Zhao, Z., Abdolazimi, Y., Armstrong, N. A., Annes, J. P. A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform. J. Vis. Exp. (113), e54298, doi:10.3791/54298 (2016).

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Abstract

Introduction

糖尿病包括病症共享打乱葡萄糖稳态的共同终点的集合。虽然糖尿病亚型的致病机理是不同的,它们共享降低β细胞量, ,胰岛素生产能力1,2-损失的后果。目前,糖尿病的治疗策略依赖外源性胰岛素,胰岛素的产生或增强胰岛素敏感性的药理学刺激的长期管理,也很少,胰岛或全胰腺3,4移植。令人遗憾的是,这些策略的成功是短命的和/或不能充分概括内源性胰岛素产生的作用。尽管显影刺激β细胞再生的方法的实用性,没有这样的方法存在。因此,一个重要的糖尿病研究的目标是开发的方法来产生新的β细胞或展开内源性β细胞量5 6,7的追求。重要的是,新的β细胞在体内的主要来源是预先存在的β细胞,而不是专门祖细胞8,9。虽然β细胞看起来具有有限的复制能力,在β细胞量略有增加(〜30%)可足以在许多糖尿病患者恢复葡萄糖动态平衡。另外, β细胞量的原位药物刺激是一种潜在的廉价的和可扩展的治疗策略。这里提出了识别和表征刺激β细胞生长的小分子的高含量筛选方法。

各种体外实验方法可以用于鉴定基因产物和/或分子塔ŧ促进初级β细胞复制。用于测量β细胞复制诱导早期的努力用于胎儿啮齿动物的胰腺文化或完整隔离胰岛文化来衡量响应特定的处理条件10 [3 H]胸苷掺入,BrdU的醛,硫堇或胰岛素染色人群中掺入或有丝分裂体, 11。 这些体外的方法和密切变体具有一些局限性。突出的缺陷包括:(1)使用胎儿细胞,不同于成熟β细胞,显示高基底β细胞复制速率和在明显的方式12调节生长; (2)β细胞复制事件实验者相关裁决的主观性; (3)β细胞复制事件实验者依赖计数的劳动和时间密集性质阻碍了实验的吞吐量; (4)利用核掺入/染色/外观识别复制甚至TS和一个非重叠的胞质染色,以确定β细胞导致邻近非β细胞复制事件对β细胞的错误认定。

最近成熟原β细胞已被用于评估转基因过度表达对β细胞复制13-16的影响,以及基因产物或化合物处理。然而,这些研究还依赖于复制事件,对β细胞鉴定和/或限制通过劳动密集型的步骤, 例如 ,细胞或完整胰岛个体滑动孔电镀细胞质staining-或非特异性方法的主观计数石蜡包埋和处理17。值得注意的是,基于图像的人β细胞复制的筛选方法,类似于本文中所呈现的人,已发表​​18;然而,成功地利用该测定的尚未得到证实和利用对于初筛人胰岛的可能不是大致FEAsible。

识别复制促进物质的另一种策略是评估的β细胞系的生长诱导。最初的努力用于转化的β细胞,系如MIN6细胞或INS一十三分之八百三十二细胞14,19-21。然而,这些细胞系中表现出奔放增长,没有什么相似之处分化良好的β细胞22。因此,增长的感应能力是最小的,目前还不清楚相关的,有时难以概括。基于细胞系的筛选改进策略采用“可逆转变”是生长在没有四环素(强力霉素)的逮捕依赖SV40 T抗原表达23,24细胞。然而,目前还不清楚这些细胞是否恢复到在强力霉素除去一个“正常”β细胞样状态。不幸的是,使用这些细胞已经产生,不会出现有直接效用广义生长促进化合物24。总体而言,使用的细胞系来研究细胞类型中显示最小的自发复制活动的生长调控可能具有有限的适用性。

本文中所呈现的β细胞复制筛选平台利用成熟原代大鼠β细胞在体内的生长调节以保持在可能的范围内,混合细胞型组合物,以便能够谱系限制性生长促进性活动的胰岛细胞培养物,多-Well格式以最大化吞吐量和自动化的分析,以消除偏见和促进吞吐量。成功地利用这个平台,使促进胰岛β细胞的复制25,26几种化合物的鉴定。此外,该测定已被用于结构 - 活性关系的研究和化学上位实验以提供机械见解β细胞复制的分子调控。所提出的平台成功地适应FOβ细胞复制的RNA干扰基于-R的慢病毒调查通路25。该测定的局限性包括限制可扩展性(使用原代细胞),利用啮齿动物,而不是基于抗体的成像和初级胰岛使用,使用相关联的人胰岛细胞(尽管该测定可适于人胰岛研究),费用的的分散的胰岛(胰岛破坏架构),以方便自动图像采集和依赖性在与图像采集和分析能力的自动显微镜的可用性。虽然用于鉴定基因产物或刺激原位 β细胞再生化合物的简便体内筛选方法将是理想的,这样的平台尚不可用27。因此,所描述的平台是适合研究者感兴趣的研究β细胞复制的大多数方面。

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Protocol

该协议是根据医学的斯坦福大学医学院的机构动物护理和使用委员会(IACUC)进行。 300克(8 - - 9周龄)的雄性Sprague Dawley大鼠,这足以产生228井胰岛细胞复制评估384孔板的所描述的协议从六个250缩放为胰岛分离。

1.材料准备

  1. 之前通过在15厘米的组织培养皿28收集维持在合流3天804G大鼠膀胱癌细胞的条件培养基(20毫升RPMI1640的)发起胰岛分离制备涂覆介质 。无菌过滤并储存(-20℃)以备后用的条件培养基。
  2. 消毒手术工具(一个12厘米齿组织钳,一是11.5厘米精剪,一是14.5厘米手术剪,二16厘米弯钳,一是12厘米弯止血钳,一是12厘米手术刀手柄)和初始化之前一30目组织筛iating胰岛分离。
  3. 在60ml 1×的Hanks'平衡盐溶液(HBSS)中的补充有钙和镁- Ⅱ类胶原酶(40万台300,000总胶原酶活性):通过溶解60%制备胰消化溶液 :纯化的I类的40%混合物中。负载10毫升胰消化缓冲液到10ml注射器(六)具有一个1“22克针和放置在冰上。
    注10毫升消解液每鼠注射。相应的规模。
  4. 通过混合1.3毫升氯胺酮(100毫克/毫升),0.2赛拉嗪的混合物(100毫克/毫升)和3毫升的PBS制备4.5毫升麻醉剂鸡尾酒在通风橱。启动胰岛分离的1小时内准备麻醉的鸡尾酒。
  5. 通过加入25ml的新生小牛血清的至500ml的HBSS制备洗涤缓冲液 。放置洗涤缓冲液在冰上待用。
  6. 制备1瓶胰岛介质,其为500 mL的低葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM),5的0毫升胎牛血清(FBS),青霉素5000单位/ ml和5000微克/毫升链霉素。
  7. 准备从功能/存活率溶液(500毫升),用2%FBS,2mM谷氨酰胺,5mM葡萄糖,青霉素5000单位/ ml和5000微克/ ml链霉素的胰岛功能介质 。存储供以后使用胰岛功能的媒体 (4℃)。
  8. 通过加入2.5毫升驴血清和0.12毫升三硝基甲苯X-100至37.38毫升1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备40毫升封闭缓冲液。供以后使用商店封闭缓冲液(4℃)。
  9. 事先得到启动协议所需的抗体。
    注意:PDX-1(TRITC)和Ki-67(FITC)共染色用于主β细胞复制的筛选。对于具体的谱系复制分析,进行免疫荧光染色额外的细胞特性标记(胰岛素,胰高血糖素,波形或生长抑素; TRITC)核(DAPI),PDX(Cy5的)和Ki-67(FITC)染色一起。另类代表lication标记, 例如 ,PCNA,也可以使用。
  10. 准备在一式四份执行的每个处理条件的228井的治疗方案。包括正性(5-Iodotubercidin [1μM]或双嘧达莫[15μM])和车辆控制(DMSO 1:666稀释)井。

2.胰腺灌注

  1. 由麻醉剂稀释液的鸡尾酒(0.30毫升/ 100克体重)腹腔注射麻醉大鼠。一旦老鼠是完全麻醉,反应迟钝有害刺激,进行颈椎脱位。
  2. 放置在仰卧位(头脚方向)纸巾的叠层上安乐死大鼠和喷雾用70%乙醇腹部区域。
  3. 具有U切口(基于耻骨区域)打开腹腔,并在延髓方向上胸部回缩皮肤以暴露腹腔。
  4. 仔细抢使用两对弯钳十二指肠,找到共同的b的进入十二指肠ILE管(奥狄括约肌)和管夹在乳头用弯止血钳十二指肠开放。
  5. 解除用于夹紧胆总管乳头和抢用弯钳胆管接近肝脏的弯止血。使用钝性分离与弯钳分离和暴露胆管。
  6. 重新定位与头部近端和脚远端的老鼠。
  7. 导管插入在胆总管(CBD),或只是远端与胰消化溶液胆囊和常见肝管的交界-loaded 10毫升注射器慢慢注入10 胰腺消化溶液 。同时注入,支持CBD用手术刀手柄。重新定位针如果管道和胰腺不能夸大。
  8. 删除使用弯钳和细剪刀将其从降结肠,肠,胃,脾分离充气胰腺。置于冰上膨胀胰腺中含有5毫升50毫升管注意:为了获得最大的胰岛收获,收集每次50ml消化管30分钟和地点只有1或2胰腺内的所有胰腺。

3.胰腺的解离

  1. 一旦所有胰腺被收集,该消化管放入37℃水浴15分钟。轻轻旋转每3分钟的管子。
  2. 15分钟后,大力摇晃(垂直)管的10倍,并添加10毫升冷洗涤缓冲液 。大力摇晃管额外的5倍,并置于冰上。
  3. 颠倒试管5次填补消化管到50毫升冷洗涤缓冲液和组合。
  4. 离心在97 XG管在4℃下1分钟,倒出上清液。要小心,不要打跑沉淀组织。
  5. 加入25 1ml 洗涤缓冲液并通过温和涡旋重新悬浮组织。重复步骤3.4和3.5倍以上。
  6. 将30目筛组织通过STerile容量250ml的烧杯,并倒入组织悬液到筛。冲洗消化管与另外20 1ml 洗涤缓冲液倒到网格。未消化的胰腺和脂肪组织是在此步骤中去除。
  7. 倒入过滤材料成两个新鲜的50毫升管,并通过在4℃以97 XG纺丝1分钟沉淀组织。倒出上清,逆变管排出多余的缓冲区。

4.胰岛分离纯化

  1. 20ml冷多聚蔗糖/钠泛影葡胺溶液(1.119克/ ml的密度)添加到沉淀胰腺组织。轻轻吹打上下五次均匀重新悬浮每个管中的内容。
  2. 轻轻覆盖10毫升HBSS的多聚蔗糖/泛影葡胺钠溶液。通过沿管壁缓慢加入HBSS保持锋利液体界面。
  3. 离心在560 xg离心消化的胰腺15分钟(4℃)以缓慢的加速和不制动。
  4. 有限公司在新鲜的50毫升管使用10毫升吸管和地点胰岛llect从界面胰岛层。不要在这个阶段集中小岛。
  5. 在140 xg离心加40 1ml 洗涤缓冲液中,以每50ml管中并旋转1分钟,在4℃。
  6. 倒掉上清液,并通过反相管几次重新悬浮在50ml 洗涤缓冲液汇集小岛。离心1分钟的管子在97 XG在4℃收集的胰岛中的颗粒。
  7. 倒掉洗涤液 ,重复清洗。把胰岛进入组织培养罩和吸出上清液。
  8. 重悬胰岛每管6毫升胰岛介质
  9. 传送从每次50ml管中的胰岛成六个孔组织培养皿的孔中。摇动6孔皿收集胰岛入井的中部,并在显微镜下观察胰岛质量和纯度。
  10. 手动收集使用1毫升吸管小岛和拾取胰岛转移到邻近的以及含6毫升胰岛媒体。重复胰岛旋流和采摘直至> 90%纯度的实现。
  11. 转移纯化胰岛含20ml 胰岛培养基在10cm组织培养皿中
  12. 在组织培养箱地方胰岛(37℃,5%CO 2)过夜( 图1A)。
  13. 在制备镀胰岛细胞,外套与804G条件培养基的40微升每孔384孔平板的孔中。在组织培养箱孵育过夜。

5.分散和胰岛细胞的电镀

  1. 翌日,轻轻分离从10cm皿用细胞刮刀胰岛和胰岛转移到50毫升管中。
  2. 沉淀通过离心胰岛1分钟,在室温下22 XG。吸出上清液。
  3. 用20毫升温的PBS洗涤小岛和如上倒出。
  4. 重悬在0.25%胰蛋白酶的胰岛(每只大鼠胰腺150微升),在37℃下孵育10分钟。吸管胰岛并用1ml移液器后5和10分钟温育的上下10次。
  5. 10分钟后,评价在显微镜下胰蛋白酶化的胰岛的20微升样品,以确保完全消化并使用血细胞计数器计数的胰岛细胞。如果未消化的胰岛仍然存在,继续培养额外的3 - 5分钟,吸管上下10次以上。根据需要重复。
    注:典型的产量〜125000 - 每个大鼠胰岛150000细胞。
  6. 从培养箱除去804G空调涂覆介质384孔板并用12孔歧管抽吸除去介质。
  7. 暂停胰岛细胞以每毫升45000细胞胰岛功能介质的密度和板每孔70微升(3150细胞)与多道移液器(图1B)。
    注意:由于位于外井β细胞倾向于朝向板使用的行C的周长为N和列4迁移到21至板228的孔与来自6只大鼠中分离的胰岛细胞。
  8. 放置在组织培养孵化该板48小时,以允许细胞粘附。

6.胰岛细胞治疗文化,固定和染色

  1. 制备200μl的车辆和化合物(处理条件以一式四份进行)在胰岛功能介质 2倍的浓度。安排在无菌96孔板化合物,以促进多井移液。
  2. 小心地取出胰岛培养基12孔歧管吸引和用12孔吸管胰​​岛功能介质(35微升/孔)更换。取出和更换时间从一行媒体限制干燥(图1C)的风险。
  3. 通过转移35微升/孔的2X化合物溶液开始治疗。返回板的孵化器为48小时的治疗持续时间。
  4. 处理48小时后,通过倒转板倒出处理介质。</ LI>
  5. 轻轻地洗胰岛细胞每1×PBS(1分钟)以及50微升。使用多通道移液器添加PBS中。
  6. 倒出PBS中并通过加入每冷的4%多聚甲醛(PFA)的孔50μl在1×PBS中稀释固定细胞。孵育细胞在4℃下15分钟。
  7. 通过倒转板以除去PFA和轻轻加入60微升的PBS每孔如上洗涤细胞三次(每次5分钟)。
  8. 通过混合14.25毫升甲酰胺加入0.75ml 0.15M的柠檬酸钠(pH值为6)制备15毫升抗原修复溶液。使用前的抗原修复立即解决方案。
  9. 通过倒转板,从孔中除去PBS中,添加60微升抗原修复溶液每个孔中。加热在70℃的水浴的板45分钟。将此温育过程中在板的顶部的加热块,以防止该多孔板的翘曲。
    注:水应该是半山腰板裙子;该板不应该被淹没。
  10. 清洗细胞,每孔60微升的1×PBS清洗3次(每次5分钟)。添加PBS中的一个多通道移液器和通过反转所述板倒出PBS中。
  11. 使用多通道移液器以每孔加入封闭缓冲液的40微升孵育在室温下30分钟。通过倒转板和倾析除去阻断缓冲液。
  12. 添加小鼠抗人Ki-67的(1:200)的40微升和山羊抗人PDX-1(1:100),在封闭缓冲液到每个孔中稀释的抗体并在4℃下孵育过夜。
  13. 第二天,弃去抗体溶液并用1×PBS洗涤细胞三次(每次5分钟),如上所述。倒出PBS。
  14. 添加40微升每稀释的井(1:200)生物素化的驴抗小鼠IgG和罗丹明缀合的驴抗山羊IgG在封闭缓冲液。孵育1小时在室温下。
  15. 清洗细胞用1×PBS清洗3次,每次5分钟。添加40微升稀释(1:400在封闭缓冲液)的荧光素缀合的链霉抗到每个孔中。在室温下孵育30分钟。
  16. 清洗细胞用1×PBS清洗3次,每次5分钟。添加40微升每DAPI的井(300纳米在封闭缓冲液中),并孵育在室温下15分钟。
  17. 洗涤细胞用1×PBS两次并离开细胞在40微升1×PBS中。该板现在准备进行分析。

7.β细胞复制分析

注:测试方案必须用来测量β细胞复制的高内涵筛选显微镜成立。在其最简单的组合物,该协议是一两色测定法,其中的标识标记是用来定义β细胞(PDX-1 + -细胞)和一个复制标记(Ki-67的)被用来定义细胞分裂事件。

  1. 标识基于所述averag对象(β细胞)β型细胞核(图2A)的预期像素区域内:(宽度<1.6的长度)的大致圆内PDX-1染色(549纳米过滤器)电子荧光强度。
  2. 其次,建立设置来识别PDX-1 +区域(图2B)内根据平均荧光强度(485纳米过滤器)的复制事件(KI-67阳性)。
    注意:曝光时间必须固定到允许跨图像的像素强度的比较。测定协议参数被调整,以使得机器呼叫始终排除非特异性染色,碎片和细胞聚集体,可能的数据质量造成不利影响。
  3. 分析的最小每孔500β细胞以最大化精度和限制可变性。
    注意:在大鼠胰岛培养物的基底β细胞复制索引预期为0.5 - 3%。通常情况下,每孔40幅影像是绰绰有余,以确定500β细胞。
  4. 此前分析整个板,分析所选的负(DMSO处理)和阳性对照(5- iodotubercidin [1μM]或双嘧达莫[15μM])处理的孔中,以评估该测定方案的有效性。当被正确建立的测定中,阳性对照化合物诱导至少在复制β细胞的百分比增加两倍。
  5. 阅读整个盘中一度测试方案进行了验证。

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Representative Results

为了评估β细胞或α-细胞复制,需要一个四色测定方案。首先,对象由DAPI染色(通道1,386纳米)来识别。接下来,β细胞(事件1)计数:的对象共表达PDX-1 +(通道2,650纳米)和近郊核胰岛素(通道3,549纳米)。随后,复制β细胞(事件2)被计算:β-细胞(事件1),该共表达Ki-67的(信道4中,485纳米)(图3)。复制β细胞的百分比来计算:(事件2 /事件1)×100为了量化α-细胞复制,总的目的是通过DAPI染色鉴定(通道1),然后α细胞(事件1)由列举不存在PDX-1染色的(信道2)和核周胰高血糖素染色的存在(通道3)。复制α细胞(事件2)是共表达Ki-67的(通道4)(图 4)α-细胞的数目。复制α-细胞的百分比来计算:(事件2 /事件1)×100。

开始实验前,化合物的治疗计划是由(表1A)。这里,一个小规模的试验,使用阴性对照(DMSO处理)和阳性对照运行(双嘧达莫治疗[15μM])的条件下,以评估PDX-1,β细胞,α细胞复制在384孔格式(每孔49图像)。实验数据表明达莫以选择性地促进PDX-1 细胞和β细胞复制,但不是α-细胞复制。每孔识别PDX-1细胞的平均数目为5541±555对DMSO处理和6,439±363为双嘧达莫治疗条件(P​​ <0.01);展示在PDX-1细胞数目(表1B,上图)一个达莫依赖性增加平均百分比PDX-1 细胞复制(DMSO + PDX-1 + Ki-67的+ </ SUP> / DMSO + PDX-1 +)为3.35±0.50%DMSO处理的和10.10±0.98%为双嘧达莫治疗条件(P <0.01)(表1B,下图)。重要的是,还有随后分析β细胞(行CF)和α-细胞复制(行GJ)水井类似PDX-1 细胞复制率:DMSO = 3.3±0.66(行CF)和3.4±0.23(行GJ)(p = 0.80);潘生丁= 9.8±0.86(行CF)和10.4±0.1.1(行GJ)(P = 0.43)。因此,这些井,虽然染色不同的细胞谱系标志物(胰岛素和胰高血糖素),类似地响应药物治疗。

下一个β细胞,α细胞的复制率从原始数据(表2)来计算。 β细胞(事件1)的平均数目响应于达莫治疗升高:DMSO 3,930±488 VS。双嘧达莫4,589±218(P <0.05)。值得注意的是,存在相比PDX-1细胞(5541±555)(P <0.01)β细胞(3,930±488)的数目的显著减少。这是不包括PDX-1 + -细胞是胰岛素的结果-从β细胞计数, 例如,δ型细胞或β细胞的祖细胞,并且需要β细胞是胰岛素+的附加 ​​严格性。值得注意的是,α细胞的(事件1)的数量并没有与潘生丁治疗增加(DMSO 1465±123 VS双嘧达莫1,467±74.7; P = 0.93)。因此,双嘧达莫选择性增加β细胞数量。复制β细胞(事件2)的数目响应于双嘧达莫治疗(DMSO 131±31 双嘧达莫476.5±39.6; P <0.01)增加,但复制α细胞(事件2)的数目不(DMSO 10.25±3 双嘧达莫9.0±1.6; p = 0.5)。复制β-CE的最后百分比LLS和α细胞计算((事件2 /事件1)×100)。事实上,双嘧达莫增加复制β细胞但不是α-细胞( 图5中概括)的百分比。重要的是,一个健康的文化基础β细胞的复制速度实验之间变化(0.5 - 3%),但应该是一个实验中跨井高度一致。因为基底的复制是可变的,所述化合物诱导的β细胞复制率也横跨实验变量;然而,β细胞复制的折叠感应横跨实验一致,并允许化合物功效跨实验可靠地比较。值得注意的是,α-细胞复制速率比β细胞复制速度下〜5倍和培养含有〜1/3作为许多α-细胞作为β细胞;因此,α-细胞复制索引显示相比于β细胞复制指数增加的可变性。为了限制可变性,每孔的图像从49(这里使用的)增大到最大的81。

图1
图1:隔离和分散的大鼠胰岛。 (一)健康的离体大鼠胰岛的显微照片;如图100微米的比例尺。分散的大鼠胰岛的(B)的显微照片(5X和10X目标)电镀后1小时; 100微米(左)和200微米(右)比例示出杆。分散的大鼠(C)显微照片(5X和10X的目标)胰岛48小时后电镀; 100微米(左)和200微米(右)比例显示条。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:PDX-1的自动识别+ +胰岛细胞。 (A)的化合物处理过的分散的大鼠胰岛染色PDX-1的细胞。 PDX-1 +物体盘旋在蓝色;排除对象盘旋在橙色。 150μm的比例尺显示。 (B)染色Ki-67的胰岛细胞的同一领域。 PDX-1 + Ki-67的+双阳性细胞盘旋为绿色。所显示150微米的比例尺。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:复制β细胞的自动识别复制β细胞通过DAPI(左上角,蓝色圆圈),PDX-1(右上角,绿色圆圈),胰岛素鉴定(左下角,品红圆圈)和Ki-67(右下角,红色圆圈)CO-E的表达。合并后的图像(右)示出了几个复制β细胞。所显示150微米的比例尺。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4:复制α细胞的自动识别复制α-细胞用DAPI(左上角,蓝色圆圈)时,不存在PDX-1(右上角,绿圆),胰高血糖素标识(左-低级角落里,品红色圆圈)和Ki-67(右下角,红色圆圈)共同表达。合并后的图像(右)显示α细胞的一种罕见的复制双峰(黄色箭头)。所显示150微米的比例尺。 请点击此处查看该图的放大版本。


5: 双嘧达莫诱导PDX-1 + -和β细胞复制但 PDX-1细胞的无α-细胞复制的图形表示(左上),β细胞(右上)和α-细胞(左下)在DMSO-达莫处理井复制所示。棒代表独立地处理的孔的平均(PDX-1的复制,N = 8;β细胞,α细胞的复制中,n = 4)。误差棒表示标准差(* P <0.01)。 请点击此处查看该图的放大版本。

<TD> 3.77
一个。 治疗: 染色:
4
C DMSO 双嘧达莫胰岛素,DAPI,PDX-1,Ki-67的
ð DMSO 双嘧达莫胰岛素,DAPI,PDX-1,Ki-67的
Ë DMSO 双嘧达莫胰岛素,DAPI,PDX-1,Ki-67的
F DMSO 双嘧达莫胰岛素,DAPI,PDX-1,Ki-67的
G DMSO 双嘧达莫 胰高血糖素,DAPI,PDX-1,Ki-67的
H DMSO 双嘧达莫 胰高血糖素,DAPI,PDX-1,Ki-67的
一世 DMSO 双嘧达莫 胰高血糖素,DAPI,PDX-1,Ki-67的
Ĵ DMSO 双嘧达莫 胰高血糖素,DAPI,PDX-1,Ki-67的
B. PDX-1 +细胞的数量
DMSO 双嘧达莫
4
C 5158 6249
ð 6365 6795
Ë 4830 6974
F 5988 6408
G 5574 6532
H 5939 6411
一世 5612 6387
Ĵ 4862 5759
PDX-1 + Ki-67的+细胞百分比
DMSO 双嘧达莫
4
C 3.04 9.99
ð 3.91 10.57
Ë 2.51 8.58
F 10.14
G 3.44 10.1
H 3.06 10.69
一世 3.58 9.07
Ĵ 3.52 11.74

表1:代表性的实验计划和PDX-1 + -细胞复制数据。 (一)治疗计划的概要显示。孔用DMSO(列4)或双嘧达莫(第5栏)处理。染色用DAPI,抗PDX-1,抗胰岛素(正常刻字)或抗胰高血糖素(斜体字)和Ki-67(B)的PDX-1 +细胞的总数(顶部,DAPI进行+PDX-1每井孔和复制PDX-1的细胞的百分比(底部,DAPI + PDX-1 + Ki-67的+ / DAPI + PDX-1 +×100)+)被示出。

事件1:
DMSO 双嘧达莫
4
C 3557 4352 #DAPI(+)PDX-1(+),胰岛素(+)
ð 4387 4542 #DAPI(+)PDX-1(+),胰岛素(+)
Ë 3462 4879 #DAPI(+)PDX-1(+),胰岛素(+)
F 4315 4585 #DAPI(+)PDX-1(+),胰岛素(+)
G 1594 1567 #DAPI(+)PDX-1(+)胰高血糖素(+)
H 1477 1439 #DAPI(+)PDX-1(+)胰高血糖素(+)
一世 1491 1390 #DAPI(+)PDX-1(+)胰高血糖素(+)
Ĵ 1298 1474 #DAPI(+)PDX-1(+)胰高血糖素(+)
事件2:
DMSO 双嘧达莫
4
C 113 425 #DAPI(+)PDX-1(+),胰岛素(+),Ki-67的(+)
ð 152 511 #DAPI(+)PDX-1(+),胰岛素(+),Ki-67的(+)
Ë 97 466 #DAPI(+)PDX-1(+),胰岛素(+),Ki-67的(+)
F 163 504 #DAPI(+)PDX-1(+),胰岛素(+),Ki-67的(+)
G 13 9 #DAPI(+)PDX-1(+)胰高血糖素(+),Ki-67的(+)
H 10 9 #DAPI(+)PDX-1(+)胰高血糖素(+),Ki-67的(+)
一世 6 11 #DAPI(+)PDX-1(+)胰高血糖素(+),Ki-67的(+)
Ĵ 12 </ EM> 7 #DAPI(+)PDX-1(+)胰高血糖素(+),Ki-67的(+)
%复制:
DMSO 双嘧达莫
4
C 3.18 9.77
ð 3.47 11.25
Ë 2.8 9.55
F 3.78 10.99
G 0.82 0.57
H 0.68 0.63
一世 0.4 0.79
Ĵ 0.92 0.48

表2:代表性的β细胞,α细胞复制数据 β细胞的总数(事件1:DAPI + PDX-1 +胰岛素+;顶表行的CF,正常刻字)),α-细胞(事件1 :DAPI + PDX-1 +胰高血糖素+;顶表行GH,斜体字),复制β细胞(事件2:DAPI + PDX-1 +胰岛素+中Ki-67 +;中间表行CF,正常刻字)和α -细胞(事件2:DAPI + PDX-1 +胰高血糖素++ 67;中间表行GH,斜体字)每孔被示出。此外,复制β细胞(DAPI + PDX-1 +胰岛素+中Ki-67 + / DAPI + PDX-1 +胰岛素+×100;下表中的行CF,正常刻字)的百分比和α细胞(DAPI + PDX -1 +胰高血糖素+ Ki-67的+ / DAPI + PDX-1 +胰高血糖素+×100,每孔底部的表行GJ,斜体字)所示。

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Discussion

为研究控制β细胞的生长和再生的分子通路的实验方法对于糖尿病研究的重要工具。在此,基于大鼠胰岛筛选平台,以确定和描述β细胞复制的小分子刺激呈现。

虽然该协议的大部分内容很容易被经验丰富的研究人员进行了几步需要特别的技术。首先,胰岛分离过程中,而不破坏其完整性胆管插管需要实践。一个有用的策略是最低限度地膨胀胆管,以确保充分配药胰腺消化液前针正确定位。其次,从外分泌组织有效的胰岛分离,需要密切关注的消化时间和适当的搅拌。应注意,以确保通过间歇旋流整个摘要甚至加热。三,实验的成功依赖小号在小岛和手工采摘胰岛外分泌腺期间杂物间精通歧视;这个技能和实践提高。第四,胰岛分散和电镀完成,使得所有的胰岛被分散成单细胞和两个或三个单元的小簇的混合物。过冲和下消化胰岛电镀前与实验性能干扰。扩频并允许在48小时连接不受打扰前新鲜镀胰岛细胞应为约50%汇合。 图1示出了成功的胰岛细胞培养物在不同的时间电镀后的外观。五,胰岛细胞培养介质的变化都仔细地进行,以避免弱贴壁细胞的破坏。第六,抗原修复必须谨慎进行以避免多井板的翘曲,但足以使成功Ki-67的染色这是既不足和敏感过度暴露于升温;翘曲板不能被用于自动图像采集。请注意,过度的胰腺消化,暴露于外分泌组织碎片和/或胰蛋白酶是胰岛细胞培养失败的常见原因。

该协议的一个限制是在对β细胞的身份和复制事件特异性表达标记的依赖。单一标志物的使用具有误导的可能性。例如,PDX-1是由β细胞,促生长素抑制素表达δ型细胞和β细胞祖29,30的一个子集表示;因此,这增加了PDX-1-细胞复制的化合物可能是特异地作用于非β细胞群。因此,使用替代β细胞标志的验证性研究是必要的。同样,Ki-67的表达不是复制和附加指标,如BrdU的和磷酸化组蛋白3,应使用31一个完美的标记。该测定的第二个限制是,其中诱导β细胞复制的化合物可以simultaneously增加β细胞的凋亡或去分化。因此,为了评估化合物是否诱导β细胞数目的绝对增加是重要的,和/或诱导β细胞凋亡和化合物处理的β细胞是否保留正常功能(葡萄糖刺激的胰岛素分泌)32。此法的第三个限制是使用主胰岛细胞相关的适度吞吐量;从只大鼠胰岛产生228实验孔,它允许以一式四份(加阳性和阴性对照)待筛选〜55的化合物。所描述的胰岛β细胞的复制筛选平台的另外一个限制是利用大鼠胰岛而非人类胰岛。人和大鼠胰岛之间的差别足以要求使用大鼠胰岛培养使用人胰岛培养证实标识的所有复制促进化合物。然而,由于供应有限,而人胰岛成本高,初步筛选与人我slets是不切实际的大多数研究人员。

该协议的主要优点是:1)利用新鲜分离的主要的胰岛以维持正常生长限制到最大程度地,2)使用384孔格式,以允许中等通量筛选(通常胰岛从六个大鼠分离足以228孔)和3)使用自动图像采集和分析的加速试验的速度以及限制偏压。相比之下,常用的替代方法依赖于人工图像采集和β细胞复制事件或放射性胸苷整个小岛掺入不细胞linages,例如成纤维细胞对β细胞的复制15,17区分主观评价。因此,所提出的协议表示调查β细胞的生长调节的重要的和改进的工具。

我们设想了多种适于使用此筛选平台。或胰岛素+ -细胞-首先,在β细胞数目的绝对增加可以通过计数PDX-1 +的数量来衡量。考虑到在每孔一个较高数每个条件重复的镀细胞的数量变异性可包括(通常N = 8)。第二,该平台可适于基于慢病毒的过表达或敲除/向下实验以鉴定参与β细胞复制通路。总之,所描述的实验技术是用于识别化合物和调节β细胞复制的分子途径广泛有用的。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 g male Male Sprague Dawly Rat Charles River Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps Fine Science Tools 11021-12
11.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14058-11
14.5 cm surgical scissors Fine Science Tools 14001-14
16 cm curved forceps Fine Science Tools 11003-16
12 cm curved hepostat Fine Science Tools 13011-12
12 cm scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Tissue sieve-30 mesh Bellco Glass 1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units VitaCyte 005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) Gibco 24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml) JHP Pharmaceuticals NDC# 42023-113-10 to make anesthetic cocktail 
Xylazine (5 g/50 ml) LLOYD NADA# 139-236 to make anesthetic cocktail 
Histopaque 1077 Sigma H-1077 to make histopaque 1100
Histopaque 1119 Sigma H-1119 to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml Hyclone SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution Hyclone SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose  Hyclone SH30021.01
Functionality/Viability Solution  Mediatech 99-768-CV
RPMI1640 media  Hyclone SH30096.01 to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line Available upon request to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 26160
GlutaMax-I Gibco 35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)  MP Biomedicals 1670049
Formamide 500 ml Fisher BioReagents BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) Vector Laboratories H-3300 to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous EMD Chemicals DX0145-1 to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder) Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody BD Biosciences 556003
Goat anti-human PDX-1 antibody R&D Systems AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody Dako 2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody Dako 2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody Dako 2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody abcam ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated  Invitrogen S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG  Jackson ImmunoResearch 705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch 705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG Jackson ImmunoResearch 703-175-155
DAPI Millipore S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml Sorenson BioScience 39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate BD Falcon 353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate Costar 3603
Multi-channel pipettor Costar 4880
12-channel vaccume aspirator Drummond 3-000-096
Cell Scraper Falcon 353085
Isotemp Water Bath Model 2223  Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI Thermo Scientific

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References

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